地膽粉酶解前后蛋白質(zhì)含量測定及正交優(yōu)化實驗

王婭玲　王悅　于佩琳　徐凱旋　陶然　韓金哲　高世杰

摘????? 要：結(jié)合超聲法比較酶解前后地膽粉中蛋白質(zhì)含量的變化，并用正交實驗法優(yōu)化酶解后地膽粉中蛋白質(zhì)的提取工藝，為今后地膽粉進一步研究提供實驗依據(jù)。首先，采用胰蛋白酶進行酶解，Lowry法測定酶解前后的蛋白質(zhì)含量，將酶解與超聲法結(jié)合，與酶解前進行對比;之后，通過設(shè)計不同種類的酶、酶解時間、酶的用量，對地膽粉中蛋白質(zhì)的提取工藝進行優(yōu)化。實驗表明地膽酶解前的蛋白質(zhì)含量少于酶解后的蛋白質(zhì)含量，酶解前采用水提法測定的質(zhì)量濃度為24.71 mg·mL^-1，胰蛋白酶酶解后蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度測定為48.32 mg·mL^-1，正交優(yōu)化地膽的最佳酶解工藝為胰蛋白酶用量為2.5 mg、酶解時間為3.5 h。

關(guān)? 鍵? 詞：地膽;酶解;含量對比;蛋白質(zhì);正交實驗

中圖分類號：TQ 937?????? 文獻標識碼： A?????? 文章編號： 1671-0460（2020）07-1333-04

Protein Content Determination and Orthogonal Optimization Experiment Before and After Meloecoarctatus Motschulsky Powder Enzymolysis

WANG Ya-ling， WANG Yue， YU Pei-lin， XU Kai-xuan， TAO Ran，，HAN Jin-zhe，GAO Shi-jie

（Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan Shandong 250355， China）

Abstract：The change of protein content in Meloecoarctatus Motschulsky powder before and after enzymolysis was compared with ultrasound method， and the extraction process of protein in Meloecoarctatus Motschulsky powder after enzymolysis was optimized by orthogonal experimental method， which could provide experimental basis for further study of Meloecoarctatus Motschulsky powder in the future. At first，the enzymolysis was carried out by trypsin enzymes，and the protein contents before and after the enzymolysis were determined by Lowry method.And then taking enzyme types， enzymolysis time， enzyme dosage as influence factors， the extraction process of protein in Meloecoarctatus Motschulsky powder was optimized，the optimal extraction process was determined. The results showed that the protein content before enzymolysis was less than the protein content after enzymolysis， the content of hydropitimite determination before enzymolysis was 24.71 mg·mL-1， the protein content after enzymolysis was 48.32 mg·mL-1， the best enzymolysis process was as follows： trypsin enzyme 2.5 mg， enzymolysis time 3.5 h.

Key words： Meloecoarctatus Motschulsky powder; Enzymolysis; Content comparison; Protein; Orthogonal experiment

地膽與斑蝥同為芫菁科昆蟲，主要成分均為斑蝥素^[1]。目前研究主要集中于斑蝥身上，對其同屬動物地膽的研究較少。近年來斑蝥素的抗癌作用備受重視，隨著癌癥患者數(shù)量的增加，對斑蝥素的需求也逐漸上升，導(dǎo)致其供不應(yīng)求^[2]，因此對于其同屬昆蟲的開發(fā)越來越重要。

地膽為常用動物藥，始于《神農(nóng)本草經(jīng)》，又名芫青，功用與斑蝥相似，更長于疝積止痛、除瘡中惡肉。地膽有大毒，性猛峻裂^[3]，副作用較大，經(jīng)研究其毒性成分斑蝥素對原發(fā)性肝癌、膀胱癌等具有顯著抑制作用^[4]，可阻礙腫瘤細胞繁殖，減少不良反應(yīng)，制備抗腫瘤新藥。

酶法為近年來的研究熱點，生物酶能破壞細胞壁，加速有效物質(zhì)溶出，因其專一性而受到廣泛歡迎。為確定酶解對動物類藥物的影響，本實驗將酶解與超聲法結(jié)合，與酶解前進行對比，通過設(shè)計不同種類的酶、酶解時間、酶的用量對地膽粉中蛋白質(zhì)的提取工藝進行優(yōu)化^[5]，確定最佳提取工藝。

1? 實驗部分

1.1? 藥材

地膽粉，實驗室自制，經(jīng)鑒定為正品。

1.2? 試劑^[6]

胃蛋白酶，甘氨酸，彈性蛋白酶，福林酚試劑，胰蛋白酶等，皆為分析純。

1.3? 儀器^[7]

恒溫水浴鍋，電子天平，超聲波清洗器，高速冷凍離心機。

2? 實驗方法

2.1? 蛋白質(zhì)標準曲線的測定

精密稱取甘氨酸100 mg，邊超聲邊攪拌溶解，定容至容量瓶中。用移液槍再次移取稀釋，配制為不同濃度的甘氨酸溶液于干燥的試管中，向待測溶液加入5 mL的堿性銅試劑，振蕩，放置一段時間，隨后加入福林酚溶液，靜置，0.5 h后測定甘氨酸標準溶液的吸光度^[8]。

2.2? 酶解前后蛋白質(zhì)含量測定

稱取地膽1.00 g溶于蒸餾水，離心抽濾，參照“2.1”項下水提法測定酶解前地膽粉中蛋白質(zhì)的吸光度，計算蛋白質(zhì)含量;另取地膽1.00 g，制備相同條件下的酶解液，離心抽濾，參照“2.1”項下方法測定酶解前地膽粉中蛋白質(zhì)的吸光度^[9]。

2.3? 單因素實驗

2.3.1 ?酶的種類對地膽提取影響

固定酶解時間為3.5 h，酶的用量均為2.5 mg，分別用胃蛋白酶、彈性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶酶解地膽粉，測定酶解后地膽的吸光度，計算不同酶酶解地膽粉的蛋白質(zhì)含量差異。

2.3.2 ?酶解時間對地膽提取影響

固定酶的種類為胰蛋白酶，酶的用量均為2.5 mg，酶解時間分別為2.5、3、3.5、4、4.5 h，測定酶解后的吸光度，考察不同酶解時間后地膽粉的蛋白質(zhì)含量差異

2.3.3 ?酶的用量對地膽提取影響

固定酶的種類為胰蛋白酶，酶解時間為3.5 h，選擇酶的用量分別為1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg，測定吸光度，比較酶的用量對地膽粉蛋白質(zhì)含量的影響。

2.4? 正交實驗

見表1，取酶的用量、種類、酶解時間3個因素設(shè)計正交優(yōu)化實驗。

3? 實驗結(jié)果

3.1? 標準曲線測定

如圖1所示，實驗測得甘氨酸標準曲線為：

y=0.677 1x+0.013 9，R²=0.998 2。

3.2? 酶解前后比較

如圖2所示，酶解前地膽中蛋白質(zhì)的吸光度為0.181 2 Abs，經(jīng)計算得含量為24.71 mg·mL^-1;酶解后地膽中蛋白質(zhì)的吸光度為0.341 1 Abs，含量為48.32 mg·mL^-1。酶解后地膽粉中蛋白質(zhì)的含量明顯多于未經(jīng)酶解的蛋白質(zhì)含量，說明經(jīng)過酶解地膽中的蛋白質(zhì)能夠提取更充分。

3.3? 單因素實驗

3.3.1 ?酶的種類對地膽提取影響

由圖2所示，用4種不同酶酶解地膽粉，所測木瓜蛋白酶的吸光度最低，其他3種酶酶解地膽粉的效果均好于木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶與人體蛋白酶不同，最適作用溫度為65 ℃，常溫下酶的活性較低，難以發(fā)揮最佳酶解作用，因此進行正交優(yōu)化實驗時排除木瓜蛋白酶對地膽酶解的影響。

3.3.2? 酶解時間對地膽提取影響

本次實驗酶解時間取值范圍為2.5～4.5 h，吸光度代表蛋白質(zhì)酶解效果呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，酶解時間為3.5 h時，地膽粉酶解蛋白質(zhì)的效果最佳，隨著酶解時間的增加逐漸呈現(xiàn)下降趨勢，酶解時間過長可能存在蛋白質(zhì)流失情況，提取效率降低，見圖3。

3.3.3 ?酶的用量對地膽提取影響

在加酶量為1.5～2.5 mg時，酶解效果隨用量的增加而增加，胰蛋白酶與地膽粉的接觸面積增

大^[10]，酶解程度顯著升高，加酶量大于2.5 mg時，排除實驗誤差的影響，胰蛋白酶與底物的接觸面積變小^[11]，蛋白質(zhì)酶解效果稍有降低，見圖4。

3.4? 正交實驗結(jié)果

參考單因素實驗結(jié)果，設(shè)計酶解地膽粉不同因素不同水平的交叉實驗，計算出不同水平下酶解地膽粉的蛋白質(zhì)含量，優(yōu)選最佳酶解工藝，結(jié)果見表3^[12]。

從表4可知，對正交法酶解地膽粉優(yōu)化實驗進行結(jié)果分析，由F值比較可知，酶的種類（A）、酶解時間（B）、酶的用量（C）對地膽粉酶解實驗的作用程度為酶解時間>酶的種類>酶的用量，地膽粉酶解受時間影響最大，酶的種類對測定地膽粉中蛋白質(zhì)的影響弱于酶解時間，酶的用量影響最弱。結(jié)合P值分析，P_B>P_A>P_C，P_A、P_B值均小于0.05，對地膽粉酶解影響極為顯著，為主要影響因素;0.05<P_C<0.1，影響也較為顯著。

4? 結(jié)束語

許多動物類中藥毒性較大，如全蝎、蟾酥、蘄蛇等，藥用歷史悠久，藥物有毒成分即為其有效成分^[13]。蟾蜍解毒、開竅效果較好^[14]，能夠抑制白細胞增加，增強免疫力，對于白血病、腫瘤具有一定的治療效果;蜈蚣藥用歷史悠久，性溫有毒，其攻堅散結(jié)、治療頑癥療效極為顯著^[15]，現(xiàn)多用于腫瘤前期治療、活血化瘀、抗菌抗炎等^[16];全蝎蝎毒近年來為研究熱點，為攻堅散結(jié)的常用藥^[17]，定驚作用較好，深入研究表明全蝎蝎毒鎮(zhèn)痛作用較好，能夠緩解疼痛，療效顯著。

本實驗采用胰蛋白酶進行酶解，Lowry法測定酶解前后的蛋白質(zhì)含量，將酶解與超聲法結(jié)合，與酶解前進行對比，通過設(shè)計不同種類的酶、酶解時間、酶的用量對地膽粉中蛋白質(zhì)的提取工藝進行優(yōu)化，確定最佳提取工藝。結(jié)果表明：地膽酶解前的蛋白質(zhì)含量少于酶解后的蛋白質(zhì)含量，酶解前采用水提法測定的含量為24.71 mg·mL^-1，胰蛋白酶酶解后蛋白質(zhì)含量測定為48.32 mg·mL^-1，最終確定正交優(yōu)化地膽的最佳酶解工藝為胰蛋白酶用量為2.5 mg、酶解時間為3.5 h。

參考文獻：

[1]李曉飛，婁方明，等.芫菁內(nèi)斑蝥素和結(jié)合斑蝥素抗腫瘤活性的比較研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2013，24（3）：535-538.

[2]王騰蛟.綠芫菁成分定性分析、斑蝥素含量測定及斑蝥素與其衍生物抗腫瘤活性研究[D].南寧：南寧師范大學(xué)，2018.

[3]剛宏林，趙文靜，張喬.有毒動物藥的現(xiàn)代藥理作用研究概況[J].中醫(yī)藥信息，2005，22（5）：44-47.

[4]范瀟婷，于睿鵬，董瑞娟，等.斑蝥素及去甲斑蝥素對小鼠毒性靶器官的影響[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2017，23（15）：118-123.

[5]師婷婷.生物酶與超濾純化在枸杞多糖和總黃酮提取中的應(yīng)用研究[D].蘭州：甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，2016.

[6]呂迎蘭，田玉婷，毛會秀，等.正交實驗法優(yōu)化地龍粉混合酶酶解工藝[J].當(dāng)代化工，2019，48（6）：1174-1177.

[7]方園，郭鵬川，劉小玉，等.超聲-酶聯(lián)半仿生法優(yōu)化海參的水提工藝及體外抗腫瘤活性研究[J].華西藥學(xué)雜志，2019，34（4）：388-392.

[8]劉春雨，張盼盼，王穎，等.蜈蚣粉酶解工藝最佳用酶的初步篩選[J].中南藥學(xué)，2017，15（6）：759-762.

[9]王婭玲，劉迪，毛會秀，等.地膽粉最佳用酶及其酶解物的抗腫瘤作用研究[J].當(dāng)代化工，2019，48（7）：1445-1448.

[10]李玉昕，朱迎春，衛(wèi)云云，等.響應(yīng)面試驗優(yōu)化牛骨湯酶解工藝及其鈣含量分析[J].食品研究與開發(fā)，2020，41（3）：92-96.

[11]孔露，孔茂竹，余佳熹，等.響應(yīng)面優(yōu)化堿性蛋白酶法提取藜麥淀粉工藝[J].食品研究與開發(fā)，2020，41（2）：100-106.

[12]王舒玉，曹廣超，林偉江，等.正交試驗法優(yōu)化發(fā)酵蜣螂粉中水溶性蛋白的提取工藝[J].當(dāng)代化工，2018，47（11）：2334-2337.

[13]王諾琦，張莉，楊秀穎，等.動物類有毒中藥“毒”的歷史認識及現(xiàn)代研究[J].醫(yī)藥導(dǎo)報，2019，38（11）：1425-1430.

[14]張靜，李晶峰，杜延佳，等.近5年動物藥藥理研究新進展[J].吉林中醫(yī)藥，2016，36（11）：1136-1137.

[15]楊曉慧，李雁.中藥蜈蚣抗腫瘤的研究進展[J].中成藥，2017，39（2）：373-377.

[16]張喬，劉東，趙子佳，等.蜈蚣有效成分提取分離及藥理作用研究進展[J].吉林中醫(yī)藥，2016，36（12）：1244-1246.

[17]史磊，張?zhí)戾a，杜聰穎，等.中藥全蝎活性成分、藥理作用及臨床應(yīng)用研究進展[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2015，17（4）：89-91.

基金項目：山東省重點研發(fā)計劃（項目編號：2016GSF202003）;山東中醫(yī)藥大學(xué)優(yōu)秀青年基金（項目編號：2018zk34）。

收稿日期：2020-02-26

作者簡介：王婭玲（1998-），女，山東省煙臺人，2021年畢業(yè)于山東中醫(yī)藥大學(xué)，研究方向：中藥學(xué)。E-mail：2234383235@qq.com。

通訊作者：高世杰（1977-）， 男， 副教授，博士，研究方向： 中藥活性成分的分析。E-mail：sys209@ 163.com。