全蝎白術(shù)白頭翁組方發(fā)酵前后可溶性蛋白質(zhì)分子量分析

陶然　劉富菁　王婭玲　王悅　袁如月　宋興爽　王集會

摘????? 要： 通過Tricine-SDS-PAGE電泳法比較全蝎白術(shù)白頭翁組方發(fā)酵前后水溶性蛋白質(zhì)相對分子量的變化。按照超聲水提的最佳工藝，分別制備全蝎白術(shù)白頭翁組方（SAPZF）、全蝎白術(shù)白頭翁組方發(fā)酵物（SAPZFFW）的超聲水提醇沉凍干粉。通過Tricine-SDS-PAGE電泳法對SAPZF、SAPZFFW醇沉物中的蛋白進行凝膠電泳分離。結(jié)果表明：12% T、3% C的Tricine-SDS-PAGE電泳圖譜顯示SAPZF醇沉物的蛋白主要出現(xiàn)了4個條帶，相對分子量主要集中在130、70、50、35 kDa左右;SAPZFFW醇沉物的蛋白主要出現(xiàn)了3個條帶，相對分子量分別集中在50、20、15 kDa左右。Tricine-SDS-PAGE電泳圖譜顯示發(fā)酵前后的全蝎白術(shù)白頭翁中蛋白相對分子量大小具有顯著性差別，發(fā)酵之后的蛋白質(zhì)相對分子量較未發(fā)酵的變小。

關? 鍵? 詞：全蝎;白術(shù);白頭翁;Tricine-SDS-PAGE電泳;發(fā)酵;水溶性蛋白質(zhì)

中圖分類號：R284.1?????????? 文獻標識碼： A ????文章編號： 1671-0460（2020）07-1330-04

Analysis on Molecular Weight of Soluble Protein

of SAPZF Before and After Fermentation

TAO Ran a， LIU Fu-jing a， WANG Ya-ling a， WANG Rue a， YUAN-Ruyueb， SONG-Xingshuanga，WANG Ji-hui c

（a.School of Pharmacy;b.College of Traditional Chinese Medicine;c.Experimental Center，

Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan Shandong 250355 ， China）

Abstract： The change of protein molecular weight of SAPZF lyophilized powder before and after fermentation was compared by Tricine-SDS-PAGE electrophoresis. According to the optimum process of ultrasonic water extraction， the SAPZF and SAPZFFW extract lyophilized powders were prepared， respectively. The alcohol-precipitated proteins in SAPZF， SAPZFFW were separated by Tricine-SDS-PAGE electrophoresis. The results showed that， under the condition of 12% T and 3% C， Tricine-SDS-PAGE electrophoresis map of SAPZF extract showed four bands of protein with 130，70，50，35 kDa; and Tricine-SDS-PAGE electrophoresis map of SAPZFFW extract showed three bands of protein with 50，20，15 kDa. The Tricine-SDS-PAGE electrophoresis map showed that the molecular weight of the protein was significantly different in the extract lyophilized powder of SAPZF and SAPZFFW.

Key words： Scorpio; Atractylodes macrocephala; Pulsatilla chinensis; Tricine-SDS-PAGE electrophoresis; Fermentation; Water soluble protein

全蝎白術(shù)白頭翁組方（SAPZF）是以全蝎、白術(shù)、白頭翁三種中藥按等量混合組成的復方。前期研究，該組方具有抗腫瘤抗病毒的作用^[1]，且經(jīng)發(fā)酵后的組方，其抗腫瘤抗病毒作用有明顯的提高。球孢白僵菌（B. bassiana）是屬于半知菌亞門（deuteromycotina）的昆蟲病原真菌，該菌的次生代謝物質(zhì)如白僵菌素和其他聚酮類物質(zhì)具有抗癌、抗病毒等作用^[2]。相關研究表明^[3]，大分子蛋白物質(zhì)能通過固體發(fā)酵技術(shù)降解為小分子肽類，具有降低中藥毒性、提高中藥藥效的作用。利用球孢白僵菌雙向固體發(fā)酵技術(shù)發(fā)酵本復方后，其水溶性蛋白質(zhì)、水溶性氨基酸的含量升高，抗腫瘤、抗病毒效果增強^[4]?？紤]其抗腫瘤作用的增強可能與發(fā)酵后的蛋白質(zhì)成分的變化有關，采用 Tricine-SDS-PAGE電泳法對發(fā)酵前后全蝎白術(shù)白頭翁中可溶性蛋白質(zhì)的種類和相對分子量進行比較，為今后研究其抗腫瘤成分奠定基礎。

1 ?儀器與試劑

1.1? 儀器

DYCZ-24D 垂直電泳槽，北京六一生物科技有限公司;DYY-8B 型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，北京天創(chuàng)尚邦儀器設備有限公司; UV9100B型紫外可見分光光度計，北京萊伯泰科儀器股份有限公司。

1.2? 試劑

N，N，N，N-四甲基乙二胺、N，N-亞甲基雙丙烯酰胺、三（羥甲基）甲基甘氨酸、三（羥甲基）氨基甲烷、、丙烯酰胺，均購自上海麥克林生化科技有限公司;15-130 kDa雙色預染蛋白Marker，上海源葉生物科技有限公司。

1.3? 藥材

全蝎（ButhusmartensiiKarsch，均為野生成年蝎）;白頭翁（Pycnonotussinensis）及白術(shù)（Atractylodes- macrocephalaKoidz），均鑒定為正品;全蝎白術(shù)白頭翁組合發(fā)酵物，自制（批號：20181228）。

2? 方法

2.1? SAPZFFW、SAPZF凍干粉的制備

將球孢白僵菌桃5活化菌種B.bassiana（Bals.）Vuill接種于115 ℃滅菌后的馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基中，于25 ℃條件下培養(yǎng)7 d后稀釋成濃度為1×10⁸ CFU/mL 孢子懸液^[5]。無菌狀態(tài)下稱取已經(jīng)鈷-60滅菌的白頭翁、野生全蝎凍干粉、白術(shù)藥材各5.00 g，用孢子懸液濕潤，均勻攪拌。在適宜條件下發(fā)酵至菌絲長滿。冷凍干燥，即得SAPZFFW。等量取3種中藥混合均勻即得SAPZF，均低溫密封保存。

2.2? SAPZF、SAPZFFW超聲水提醇沉及醇沉物凍干粉的制備

精密稱取SAPZFFW于錐形瓶中，按照最佳超聲水提工藝^[4]條件，加入40倍體積蒸餾水，調(diào)節(jié)pH為11，40 ℃超聲提取60 min（頻率80 kHz，輸入功率500 W），于4 ℃、4 000 r·min^-1下離心15 min，抽濾，重提后兩次濾液合并，即得SAPZFP超聲水提醇沉。加入無水乙醇至其濃度為80%，靜置1 d。于4 ℃、4 000 r·min^-1下離心15 min，取沉淀物冷凍干燥，低溫密封保存。SAPZF超聲水提醇沉及醇沉物凍干粉按同樣方法制得。

2.3? SAPZFFW、SAPZF水提醇沉凍干粉中蛋白質(zhì)含量的測定

采用福林酚法^[6]測定SAPZFFW、SAPZF水提醇沉中水溶性總蛋白質(zhì)的含量。配制0.2 mg?mL^-1的牛血清蛋白溶液，用移液槍移取溶液于試管中、用蒸餾水定容至1 mL，使其質(zhì)量濃度分別為0、0.04、0.08、0.12 、0.16 、2 mg?mL^-1，在波長為650 nm下測定吸光度，繪制蛋白質(zhì)的標準曲線。精密稱取SAPZFFW、SAPZF各1.00 g，定容制100 mL的容量瓶中，用移液槍移取溶液稀釋至適宜濃度，測定其水溶性蛋白質(zhì)的含量。

2.4? Tricine-SDS-PAGE電泳

2.4.1? 電泳溶液的配制^[7-9]

按表1進行電泳所需緩沖溶液的配制，其所用水均為哇哈哈純凈水。

2.4.2 ?SAPZFFW、SAPZF水提醇沉蛋白電泳樣品的制備

精密稱取“2.2”項制備的SAPZF、SAPZFFW醇沉物凍干粉各0.10 g于燒杯中，加入樣品緩沖液充分溶解后，稀釋至適宜濃度。為了使電泳條帶清晰，將樣品溶液置于 100 ℃水浴鍋中密封加熱5 min，在

3 000 r·min^-1條件下離心3 min，移取上清液用于電泳。

2.4.3 ?電泳膠的配制

配制下層分離膠，用移液槍移取娃哈哈純凈水9.9 mL和30%丙烯酰胺12 mL于燒杯中，混和均勻后移取分離膠緩沖液7.5 mL于燒杯中混合均勻，將配制溶液抽氣3 min后，依次加入10% 過硫酸銨0.3 mL、10% SDS 0.3 mL、N，N，N，N-四甲基乙二胺12 μL，混合均勻。將制備好的分離膠用移液槍吸至凝膠板中至適宜位置，用膠頭滴管加適量蒸餾水壓平界面，靜置1 h至蒸餾水與凝固的膠層分離，傾倒出蒸餾水并用濾紙吸盡。配制上層濃縮膠，用移液槍吸取娃哈哈純凈水6.80 mL和30%丙烯酰胺1.70 mL于燒杯中混合均勻，加入濃縮膠緩沖液

1.25 mL混合均勻，抽氣3 min后，依次加入10%SDS 0.1 mL、10%過硫酸銨0.10 mL、N，N，N，N-四甲基乙二胺10 μL，混合均勻。將配置好的濃縮膠用移液槍吸至分離膠上部，嵌入干燥潔凈的梳子，靜置約1h至形成凝膠后，緩慢拔出梳子。用適量負極緩沖液沖洗上樣孔后用吸水紙吸盡負極緩沖液。

2.4.4 ?電泳及凝膠的固定、染色、脫色

用微量注射器進樣“2.4.2”項制備的樣品溶液20.00 μL、Marker 5.00 μL，取下凝膠板立即放入電泳槽中并用夾子固定，加入陰極緩沖液和陽極緩沖液。用80 V恒壓電泳至樣品條帶開始進入分離膠時，調(diào)節(jié)電壓至120 V繼續(xù)進行電泳。電泳結(jié)束后取出平板中的凝膠，浸泡于固定液（50%乙醇、10%冰乙酸、40%蒸餾水）中固定1 h，置于考馬斯亮藍R-250染色液中染色1 h后，用蒸餾水洗去凝膠表面的染色液，將凝膠置于脫色液（8%冰乙酸、25%乙醇、67%蒸餾水）中在搖床上脫色，并不斷更換脫色液至凝膠上的背景顏色脫干凈^[10]。Marker標準蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量為130、100、70、50、35、25、20、15 kDa。

3? 結(jié)果

3.1? SAPZFFW、SAPZF水提醇沉凍干粉中蛋白質(zhì)含量

如圖1所示，以吸光度為縱坐標，水溶性總蛋白質(zhì)的濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得水溶性總蛋白質(zhì)的回歸方程為y = 2.267 5x + 0.003 9，R ² = 0.998 4，在濃度范圍0～02 mg·mL^-1內(nèi)水溶性總蛋白質(zhì)與吸光度的線性關系良好。 SAPZFFW和SAPZF中水溶性蛋白的含量分別為22.68%、10.48%。由此可見，組方經(jīng)發(fā)酵后其水溶性蛋白質(zhì)的含量有所增加。

3.2? SAPZFFW、SAPZF水提醇沉凍干粉中蛋白電泳比較

采用Tricine-SDS-PAGE電泳法電泳后，可見凝膠上SAPZFFW主要得到3條電泳條帶，相對分子量主要集中在50、20、15 kDa左右，SAPZF主要可得到4條條帶，相對分子量主要集中在130、70、50、35 kDa左右。由此可見，發(fā)酵后的全蝎白術(shù)白頭翁組方中的蛋白質(zhì)相對分子量明顯降低。

4? 結(jié)束語

通過使用真菌白僵菌對中藥組方進行混合發(fā)酵可以將中藥中的化學成分通過真菌生長過程中產(chǎn)生的范圍廣泛的酶系進行結(jié)構(gòu)修飾和生物轉(zhuǎn)化，從而產(chǎn)生出新的有效成分，如將大分子蛋白酶解成小分子肽類等。同時真菌在生長的過程中也會產(chǎn)生一些具有廣泛生物活性的次生代謝物質(zhì)，例如白僵菌素和聚酮類物質(zhì)等。本文通過Tricine-SDS-PAGE電泳法，比較全蝎白術(shù)白頭翁組方發(fā)酵前后水溶性蛋白質(zhì)相對分子量變化。研究表明，SAPZF醇沉物的蛋白出現(xiàn)了4個條帶，相對分子量主要集中在130、70、50、35 kDa;SAPZFFW醇沉物的蛋白出現(xiàn)了3個條帶，相對分子量分別集中在50、20、15 kDa。通過球孢白僵菌發(fā)酵后的全蝎白術(shù)白頭翁組方，其蛋白質(zhì)的相對分子量明顯減小。表明發(fā)酵使組方中的大分子蛋白質(zhì)發(fā)生了生物轉(zhuǎn)化，變成了相對分子量更小的多肽和寡肽。根據(jù)前期研究表明，發(fā)酵后的全蝎白術(shù)白頭翁中的極性物質(zhì)體外對HSV病毒^[1]、乳腺癌細胞株MCF-7^[11]均具有較好的抑制作用，其活性均優(yōu)于未發(fā)酵物，兩者具有顯著性的差異，推測其抗病毒、抗腫瘤活性的增強正是來自于此。采用Tricine-SDS-PAGE電泳對蛋白相對分子量進行定性的方法簡單可行，設備操作簡便，可以為全蝎白術(shù)白頭翁組方的鑒別等研究方面提供新的思路。

參考文獻：

[1]張瑞，楊培，毛會秀，等.全蝎白術(shù)白頭翁混合發(fā)酵品不同極性部位體外抗病毒研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2019 ，30（1）：62-64.

[2]王美欣，胡海峰，薛亞平. 球孢白僵菌在生物催化反應中的應用研究進展[J].化學與生物工程，2018，35（8）：18.

[3]王集會，王璐，高世杰，等. 野生全蝎粉與酵解和酶解提取物抗腫瘤效果比較研究[J]. 山東中醫(yī)雜志，2014，33（3）：224-226.

[4]劉金虎，田志龍，毛會秀，等.全蝎白術(shù)白頭翁混合發(fā)酵物超聲水提工藝的優(yōu)化及體外抗腫瘤活性研究[J].華西藥學雜，2019，34（4）：383-387.

[5]張莉，張?zhí)m，張玉，等.釀酒酵母菌株的篩選與發(fā)酵特性分析[J].河南農(nóng)業(yè)科學，2018，47（6）：144-148.

[6]史磊，劉春雨，張盼盼，等.正交實驗法優(yōu)選發(fā)酵蜈蚣粉中水溶性總蛋白提取工藝及其抗腫瘤效果[J].山東中醫(yī)雜志，2017，36（8）：710-713.

[7]喬玉歡，雷榮悅，杜君，等.應用SDS-PAGE技術(shù)分析重組蛋白的聚集性[J].實驗室科學，2007（3）：64-66.

[8]孫靜，賀曉光，張津瑜，等.芽孢皮層裂解酶的提取與SDS-PAGE分析[J].食品研究與開發(fā)，2018，39（4）：14-19.

[9]唐澤麗，李多偉，王瑤，等.秦艽種子蛋白質(zhì)的提取及SDS電泳研究[J].西北藥學雜志，2011，26（2）：94-96.

[10]郭堯君.SDS電泳技術(shù)的實驗考慮及最新進展[J].生物化學與生物物理進展，1991（1）：32-37.

[11]劉金虎，趙翠燕，孫志藝，等.全蝎白術(shù)白頭翁組合發(fā)酵品不同醇濃度提取物的活性成分分析及體外藥理研究[J].當代化工，2019，48（6）：1170-1172.

基金項目：山東省重點研發(fā)計劃（項目編號：2016GSF202003）;山東中醫(yī)藥大學大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃（項目編號：2019042）。

收稿日期：2020-02-21

作者簡介：陶然（1999-），女，山東省濟南市人，研究方向：中藥學。E-mail：2573839853@qq.com。

通訊作者：王集會（1962-），男，正高級實驗師，研究方向：蟲類中藥發(fā)酵及活性成分研究。E-mail：Wangjihui10@126.com。