酶抑制法快速定性檢測(cè)水果中農(nóng)藥殘毒

張立新

酶抑制法快速定性檢測(cè)水果中農(nóng)藥殘毒

張立新

（河北省唐山市林果花質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)管理中心063000）

人們對(duì)餐桌上種類繁多的新鮮水果食用安全的要求隨著生活水平的逐步提高也越來越高。加強(qiáng)果品質(zhì)量監(jiān)控，尤其是加強(qiáng)水果農(nóng)藥殘毒檢測(cè)，是提高果品質(zhì)量安全水平，保障百姓“舌尖上的安全”的關(guān)鍵措施之一。采用氣象色譜儀檢測(cè)水果農(nóng)藥殘毒，固然以其精度高、檢測(cè)項(xiàng)目較多等特點(diǎn)而為大多實(shí)驗(yàn)室所采用。但是，此檢測(cè)方法儀器設(shè)備投入資金數(shù)額大、檢測(cè)成本高、檢測(cè)場(chǎng)所固定、檢測(cè)環(huán)境條件要求高、人員操作技術(shù)水平要求較高等特點(diǎn)決定了不太適合生產(chǎn)基地和流通領(lǐng)域要求的快速檢測(cè)。采用酶抑制方法，對(duì)水果中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥進(jìn)行定性快速檢測(cè)，儀器和試劑投入成本低、檢測(cè)方法簡(jiǎn)便易學(xué)、檢測(cè)速度快、檢測(cè)不受實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所的限制，是水果生產(chǎn)基地和超市、水果店等流通領(lǐng)域快速自行檢測(cè)的實(shí)用方法。

1 酶抑制法工作原理

有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥能抑制昆蟲中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中乙酰膽堿酶的活性，造成神經(jīng)傳導(dǎo)介質(zhì)乙酰膽堿的積累，影響正常傳導(dǎo)，使昆蟲中毒死亡。根據(jù)這一原理，在水果有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥提取液中加入類似于乙酰膽堿酶的酶試劑，如果水果提取液中不含有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥或殘留量較低，酶的活性不被抑制或抑制程度小，實(shí)驗(yàn)中加入的底物就被酶水解，水解產(chǎn)物與加入的顯色劑反應(yīng)產(chǎn)生顏色變化。反之，如果水果提取液中含有一定量的有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥，酶的活性就被抑制或部分被抑制，實(shí)驗(yàn)中加入的底物就不能被酶水解或少部分被水解，從而不顯色或顏色變化很小。用分光光度計(jì)測(cè)定吸光值隨時(shí)間的變化情況計(jì)算出抑制率，就可以判斷水果中含有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥的殘留情況。

2 儀器、試劑與判定標(biāo)準(zhǔn)

北京強(qiáng)盛儀器廠生產(chǎn)的NY-III型6通道農(nóng)藥殘毒檢測(cè)儀、NY-Ⅳ型8通道農(nóng)藥殘毒檢測(cè)儀；配套上海瑞鑫科技儀器有限公司出品的農(nóng)藥殘毒速測(cè)試劑，包括提取液試劑1袋、底物1瓶、顯色劑1瓶和酶試劑1瓶，應(yīng)由專業(yè)商家購買；測(cè)試結(jié)果為有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥對(duì)酶的抑制率（%）；測(cè)試結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)為測(cè)試樣品的酶抑制率達(dá)到50%以上，其農(nóng)藥殘留毒性可能超過安全界定標(biāo)準(zhǔn)。適應(yīng)檢測(cè)的水果有蘋果、梨、桃、李、杏、香蕉、火龍果、芒果、獼猴桃、木瓜、柚和檸檬等。

3 檢測(cè)方法

3.1 試劑配制與保存

3.1.1 提取液配制將提取液試劑袋中的試劑溶于510 mL蒸餾水中，溶解、混勻，配成提取液。

3.1.2 底物配制向底物試劑瓶中加入3.1 mL蒸餾水，溶解、混勻，備用。在0～4℃環(huán)境保存，可使用5 d。

3.1.3 顯色配制向顯色劑試劑瓶中加入32 mL提取液，溶解、混勻，備用。避光冷藏保存。

3.1.4 酶試劑配制向酶試劑瓶中加入3.1 mL提取液，溶解、混勻。在0～4℃環(huán)境保存，可使用5 d。

3.1.5 未經(jīng)配制的酶、底物粉劑儲(chǔ)存在冰箱0℃以

下冷凍室保存，有效期為1年。

3.2 操作步驟

3.2.1 準(zhǔn)備開機(jī)預(yù)熱10 min，按確定鍵進(jìn)行儀器自檢。隨機(jī)抽取水果樣本，每個(gè)樣本至少取0.5～1.0 kg，樣品必須具有代表性。

3.2.2 樣品提取從水果表皮至果肉0.5～1 cm處取樣，取1 g放入燒杯中，加入5 mL提取液，常溫下靜置10 min，每隔3 min晃動(dòng)一下燒杯，以使水果中農(nóng)藥充分溶解，或振蕩提取2 min，過濾，濾液即為待檢測(cè)液。NY-III型儀器提取6個(gè)樣品，NY-Ⅳ型提取8個(gè)樣品.

3.2.3 對(duì)照測(cè)試對(duì)照測(cè)試在樣本測(cè)試之前4 min進(jìn)行。取提取液2.5 mL、酶0.1 mL和0.1 mL顯色劑，加入燒杯中，混勻靜置15 min（常溫25～35℃，秒表計(jì)時(shí)）后，立即加入底物0.1 mL。倒置兩次混勻后（切勿震蕩產(chǎn)生氣泡），立即轉(zhuǎn)移到比色皿中，快速放入儀器比色池內(nèi)，蓋好蓋板，按對(duì)照測(cè)試鍵。對(duì)照值在30以上為有效值，反之重做對(duì)照測(cè)試。測(cè)試完畢，馬上將對(duì)照液從比色池內(nèi)取出。

3.2.4 樣品測(cè)試取待撿測(cè)液2.5 mL加入燒杯中，加入酶液0.1 mL和顯色劑液0.1 mL，混勻靜置15 min（秒表計(jì)時(shí)，常溫25～35℃）后，馬上加入底物0.1 mL，倒置兩次后（切勿震蕩產(chǎn)生氣泡），立即轉(zhuǎn)移到比色皿中，快速放入儀器比色池，蓋好蓋板，按樣品測(cè)試鍵執(zhí)行樣品檢測(cè)程序。

3.2.5 測(cè)試結(jié)果的判讀若測(cè)試樣品的酶抑制率達(dá)到50%以上，則表明被測(cè)樣品的農(nóng)藥殘留毒性可能超過安全的界定標(biāo)準(zhǔn)，建議復(fù)檢一次或通過氣相色譜等儀器檢測(cè)進(jìn)一步確認(rèn)。

4 檢測(cè)結(jié)果誤差分析

4.1 實(shí)驗(yàn)操作誤差

4.1.1 移液操作帶來的誤差實(shí)驗(yàn)過程中，試劑都是通過移液槍進(jìn)行添加的。如果按下移液槍后，松手過快會(huì)導(dǎo)致所吸液體中含有很多空氣，造成所加試劑量減少，影響檢測(cè)結(jié)果。操作過程中，在所剩試劑比較少的情況下，應(yīng)慢松移液槍按鈕，確保吸入試劑足量。

4.1.2 操作速度快慢帶來的誤差提取液與樣品混合時(shí)間越長(zhǎng)，越有利于農(nóng)殘溶解，檢測(cè)結(jié)果為不合格的概率就越大。加入酶后放置的時(shí)間越長(zhǎng)，越有利于使酶被充分破壞，檢測(cè)結(jié)果為不合格的概率就越大。應(yīng)提高操作熟練程度，按照要求時(shí)間進(jìn)行操作。

4.1.3 顯示時(shí)間帶來的誤差同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品時(shí)，倒計(jì)時(shí)顯示的時(shí)間每次都有差別，誤認(rèn)為是儀器出現(xiàn)了問題。每次放入比色皿并按下檢測(cè)鍵的時(shí)候，內(nèi)部計(jì)時(shí)器都開始180 s倒計(jì)時(shí)。8個(gè)通道的180 s倒計(jì)時(shí)不是同時(shí)開始的，它們之間的時(shí)間差即為操作時(shí)間。所以最后顯示的時(shí)間因操作的快慢有所不同，屬于正常現(xiàn)象，可以放心操作。

4.1.4 揭遮光蓋時(shí)帶來的誤差每次放入待檢測(cè)的比色皿都需要掀起儀器的遮光蓋，自然光都會(huì)投射進(jìn)正在檢測(cè)的比色皿，影響折光率的判斷，進(jìn)而影響檢測(cè)結(jié)果。操作過程中，要盡可能快速完成比色皿的放置，減少遮光蓋打開的時(shí)間。

4.2 實(shí)驗(yàn)環(huán)境和器皿導(dǎo)致誤差

4.2.1 環(huán)境溫度變化帶來的誤差實(shí)驗(yàn)室溫度的變化，可以造成測(cè)試溫度與對(duì)照溫度的不一致，從而降低吸光值變化曲線的吻合度，導(dǎo)致抑制率的升高，增加檢測(cè)結(jié)果不合格的概率。同時(shí)，溫度對(duì)溶解速度、酶的活性都有影響。應(yīng)在實(shí)驗(yàn)室安裝空調(diào)，按照儀器要求調(diào)整好溫度。

4.2.2 比色皿帶來的誤差比色皿分為透光面和磨光面。在檢測(cè)過程中，透光面表面有水痕、手痕、污跡都會(huì)影響儀器對(duì)折光率的判斷，造成檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。檢測(cè)前應(yīng)將比色皿清洗干凈，操作過程中保持透光面無污物接觸。

4.3 檢測(cè)樣本自身導(dǎo)致誤差

4.3.1 取樣本果皮厚度帶來的誤差所取果皮的厚度，對(duì)檢測(cè)結(jié)果有非常重要的影響。果皮越薄，接觸農(nóng)藥的面積越大，檢測(cè)結(jié)果為不合格的概率就越大。果皮越厚，所含的果汁和色素就越多，對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成的誤差就越大。應(yīng)該按照要求從水果表皮至果肉0.5～1 cm處取樣。

4.3.2 水果色素帶來的誤差儀器通過測(cè)定吸光值隨時(shí)間變化情況來進(jìn)行檢測(cè)。部分水果中含有的色素會(huì)影響儀器對(duì)吸光值的判斷。對(duì)于色素顏色較深的水果品種，應(yīng)采用較為精密的儀器進(jìn)行檢測(cè)。

4.3.3 水果果汁帶來的誤差果汁中含有酸（堿）性物質(zhì)對(duì)于酶的活性、提取液的溶解度、顯色劑的靈敏度等都會(huì)造成影響，從而降低檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性。取樣過程中應(yīng)盡量采用較鋒利的刀具，減少擠出的果汁量。

4.4 介質(zhì)、試劑導(dǎo)致誤差

4.4.1 水質(zhì)帶來的誤差不同水的成分差別較大。水中含有的礦物質(zhì)成分、酸性物質(zhì)、堿性物質(zhì)，都會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響。實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)采用蒸餾水，如條件有限，可用瓶裝純凈水代替。

4.4.2 各種試劑帶來的誤差提取液量多可以稀釋農(nóng)殘，酶量多可以提高分解底物的速度，顯色劑量多可以增加顯色的程度，底物量多可以提高酶的利用效率，以上這些因素都能增加檢測(cè)結(jié)果合格的可能性。檢測(cè)過程中的試劑使用量是經(jīng)過科學(xué)計(jì)算的，應(yīng)嚴(yán)格遵守。

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2015-10-30