香芹酚-酪蛋白納米顆粒制備及其對枇杷果實炭疽病的抑制作用

花春陽,李卓燁,金 鵬,覃定奎,杜琪珍

（浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院,浙江 杭州 311300）

病原微生物引起的腐爛是造成果蔬采后損失的主要原因,由此帶來巨大的經(jīng)濟損失[1],因此,研發(fā)用于果蔬保鮮的安全防腐劑至關(guān)重要[2]。近年來,納米技術(shù)在采后果蔬保鮮方面受到關(guān)注[3]。其研究主要集中在以下兩方面：一方面,在果蔬包裝材料中使用金屬氧化物類納米顆粒（nanoparticles,NPs）（如納米TiO2、納米ZnO、納米CuO等）可以間接避免果蔬在貯運過程中受到病菌污染；另一方面,在果蔬表面噴涂納米化的抗菌劑（如納米化肉桂醛、納米化葡聚糖）可以直接預(yù)防果蔬的腐敗[4]。

香芹酚（carvacrol,CL）是一種酚類單萜類化合物[5],廣泛存在于牛至、百里香、胡椒、佛手柑等植物的精油中。在植物來源的酚類化合物中,由于CL存在游離羥基和酚基,其抗菌活性高于其他揮發(fā)性化合物[6]。然而,CL因具有揮發(fā)性、疏水性而容易被氧化和熱降解,導(dǎo)致應(yīng)用時分散不均、時效短和穩(wěn)定性差。此外,CL的疏水性也使其在食物保鮮過程中易與脂質(zhì)和蛋白質(zhì)結(jié)合,從而降低抗菌效果[7]。因此,納米和微乳液包埋（如納米醇質(zhì)體、纖維素衍生物[8]或生物聚合物制備的微球、殼聚糖[9]和交聯(lián)的明膠[10]制備的納米復(fù)合物）成為解決上述問題的重要策略。

酪蛋白（casein,CS）是牛乳中主要的乳蛋白（占牛乳蛋白的80%）,在食品和飲料行業(yè)中是一種低成本的食品級添加劑[11]。天然酪蛋白在溶液中可以自組裝成納米微團結(jié)構(gòu),其直徑大約為80～400 nm,已被廣泛用作疏水試劑輸送系統(tǒng)的有效納米載體[12-13]。本實驗通過低能量、簡單的自乳化技術(shù),利用低成本的食品級酪蛋白制備香芹酚-酪蛋白納米顆粒（CL-CS-NPs）,對其物理性質(zhì)進行測定,并對其在枇杷果實上的抗菌效果進行分析,以期為CL-CS-NPs的生產(chǎn)及其采后預(yù)防果實腐爛提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

100 kg成熟‘白沙’枇杷（Eriobotrya japonica(Thunb.) Lindl.cv.Baisha）,采自浙江省杭州市余杭區(qū)琵琶灣枇杷園,3 h內(nèi)運回實驗室,挑選顏色較一致、表面無缺陷的果實用于實驗。

酪蛋白（純度大于98%） 美國Sigma-Aldrich公司；CL（純度99%） 上海源葉生物科技有限公司；乙醇、磷酸、乙醚均為國產(chǎn)分析純；甲醇為國產(chǎn)色譜純。

LB培養(yǎng)基（含10 g/L色氨酸、5 g/L酵母提取物、10 g/L氯化鈉和質(zhì)量分數(shù)1%葡萄糖）。

1.2 儀器與設(shè)備

Zetasizer Nano ZS90型納米粒徑電位分析儀 英國馬爾文儀器有限公司；TGL-16G型高速離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；KQ5200B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；XW-80A漩渦混合儀 上海馳唐電子有限公司；ZNCL-GS磁力攪拌器 杭州明遠儀器有限公司；JY92-IIN超聲儀 上海滬析儀器有限公司；ME104E/02電子天平 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；高效液相色譜系統(tǒng) 日本Shimadzu公司；H-9500E透射電子顯微鏡日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 游離CL、酪蛋白+CL混合物和CL-CS-NPs的制備

游離CL：將CL溶于乙醚配制成一定的質(zhì)量濃度,即得到游離CL。

酪蛋白+CL混合物：將游離CL添加于酪蛋白溶液（2 mL）,漩渦混勻3 min即得到酪蛋白+CL混合物。

CL-CS-NPs：將酪蛋白完全溶解于去離子水中,配制成終質(zhì)量濃度20 mg/mL溶液。CL溶于無水乙醇中,配制成終質(zhì)量濃度300 mg/mL溶液。將10 mL酪蛋白溶液置于50 mL玻璃燒杯中,在磁力攪拌器上攪拌（500 r/min）,同時將CL溶液以10 μL的體積分多次加入到酪蛋白溶液中（至CL質(zhì)量濃度分別為3、6、9、12、15 mg/mL）,然后超聲處理5 min（22 Hz、50 W）,即得到CL-CS-NPs分散液。將CL-CS-NPs置于冷藏室（4～10 ℃）貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 CL-CS-NPs分散液中CL包埋率測定

取1.3.1節(jié)制備的不同CL質(zhì)量濃度CL-CS-NPs分散液（5 mL）,3 000×g離心10 min,使游離的CL（不溶于水）與納米分散液分層,在納米分散液層取50 μL,加450 μL甲醇沉淀蛋白并提取CL,甲醇提取液用高效液相色譜外標法測定待測液CL質(zhì)量濃度。高效液相色譜測定條件為： C18柱（250 mm×4.6 mm,5 μm）；流動相為甲醇/水/磷酸（30∶70∶0.01,V/V）,流速為1 mL/min,柱溫為30 ℃,檢測波長為280 nm。離心后納米分散液中的CL質(zhì)量即為CL-CS-NPs包埋的CL質(zhì)量。包埋率按式（1）計算。

1.3.3 CL-CS-NPs物理性質(zhì)的測定

將500 μL CL-CS-NPs顆粒分散液用去離子水稀釋成5 mL,用Zetasizer Nano ZS90型納米粒徑電位分析儀測定CL-CS-NPs的粒徑分布、多分散指數(shù)（polydispersity index,PDI）和Zeta電位。測定溫度25 ℃、激光波長633 nm。

1.3.4 CL-CS-NPs納米粒微觀結(jié)構(gòu)觀察

首先用純水稀釋的CL-CS-NPs分散液,然后將其吸附到附著在金屬樣品網(wǎng)格的碳涂層膜上。接著用吸水紙去除多余樣品,并用一滴染色液（質(zhì)量分數(shù)2%磷鎢酸）覆蓋網(wǎng)格。染色數(shù)分鐘后去除多余的溶液。待樣品徹底風(fēng)干,然后用H-9500E透射電子顯微鏡對CL-CS-NPs進行微觀結(jié)構(gòu)觀察。

1.3.5 CL-CS-NPs釋放性分析

將CL-CS-NPs分散液（CL 10 μg/mL）或酪蛋白+CL混合物（CL 10 μg/mL）分別噴灑在固體LB培養(yǎng)基（固化前體積為5 mL）表面（10 μL/cm2）,然后置于28 ℃培養(yǎng)箱中,每隔24 h取出一批培養(yǎng)皿,將培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基取出,置于三角瓶中,用20 mL乙醚提取CL（提取3 次）,合并提取液,氮吹揮發(fā)乙醚,用適量甲醇溶解提取物,通過高效液相色譜測定甲醇溶液中CL質(zhì)量濃度,并計算培養(yǎng)基中CL存留量。游離CL用乙醚溶解并噴灑在固體培養(yǎng)基表面（10 μL/cm2）,待乙醚揮發(fā)后置于28 ℃培養(yǎng)箱中,CL存留量分析同處理組。

1.3.6 病菌培養(yǎng)

參照本課題組前期的實驗方法[14],從腐爛枇杷果實中分離出炭疽菌（Colletotrichum acutatum）。然后將菌絲體在28 ℃的LB瓊脂培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)5 d作為種子。

1.3.7 CL-CS-NPs離體抗菌活性分析

CL-CS-NPs、酪蛋白+CL混合物抑菌活性測定：在培養(yǎng)基表面分別噴灑CL-CS-NPs分散液10 μL/cm2（CL 10 μg/mL）、酪蛋白+CL混合物10 μL/cm2（CL 10 μg/mL）和1.3.5節(jié)CL-乙醚,之后在培養(yǎng)基中央接種5 μL孢子懸浮液,然后在28 ℃下培養(yǎng)。在沒有CL的情況下進行相同的對照實驗。每隔24 h測定菌斑的直徑,計算菌斑增長率（式（2））。病斑增長率實驗重復(fù)3 次。

1.3.8 CL-CS-NPs對枇杷炭疽病的抗菌活性分析

用無菌生理鹽水擦洗枇杷果實表皮,用無菌注射針在每果中部接種5 μL炭疽菌孢子懸液（1×105孢子/mL）。將含等量CL（10 μg/mL）的酪蛋白+CL混合物樣品溶液和CL-CS-NPs分散液噴在果實表面。每組10 個枇杷果實,重復(fù)3 次。對照組用無菌蒸餾水處理。隨后,所有處理過的樣品在28 ℃的無菌室中儲存。測定并記錄疾病發(fā)生率和病變直徑。將接種孔處出現(xiàn)腐爛斑點和果肉顏色變化的枇杷定義為發(fā)病枇杷。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗采用完全隨機設(shè)計,用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件采用單因素方差分析對數(shù)據(jù)進行顯著性分析,結(jié)果以平均值±標準偏差表示。采用Duncan法進行多重比較,P＜0.05認為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 CL-CS-NPs的制備、表征與相對抑菌活性

表1 不同CL質(zhì)量濃度制備的CL-CS-NPs的特性及包埋率Table 1 Characterization and encapsulation rate of CL-CS-NPs prepared at different CL concentrations

如表1所示,CL-CS-NPs的粒徑、分散性（PDI）、Zeta電位和包埋率與制備時添加的CL質(zhì)量濃度有關(guān)。CL質(zhì)量濃度從3 mg/mL增加到12 mg/mL,CL-CS-NPs的粒徑僅從121.9 nm增加到152.6 nm；但CL質(zhì)量濃度增加到15 mg/mL時,納米顆粒粒徑則增加到370.7 nm,表明過量CL誘發(fā)了納米顆粒的聚集。納米顆粒的聚集導(dǎo)致分散液的透光率顯著降低（圖1A）。CL-CS-NPs的Zeta電位絕對值與CL的粒徑呈負相關(guān),表明CL導(dǎo)致納米顆粒所帶負電荷的減少。Zeta電位與納米顆粒的穩(wěn)定性有一定的相關(guān)性,通常對粒徑相同的粒子,所帶電荷越多,相互之間的斥力越大,分散液體系的穩(wěn)定性越高。本研究中只有CL質(zhì)量濃度增加到15 mg/mL才導(dǎo)致Zeta電位發(fā)生顯著改變,因此,可以認為CL質(zhì)量濃度3～12 mg/mL制備的納米顆粒穩(wěn)定性與所帶電荷的關(guān)系不大。CL質(zhì)量濃度在3～12 mg/mL,納米顆粒的包埋率變化不顯著,但CL質(zhì)量濃度增加到15 mg/mL時,包埋率降低,且與其他質(zhì)量濃度之間有顯著性差異（P＜0.05）。

不同CL質(zhì)量濃度制備的納米分散液在相同CL添加量時對炭疽菌的抑制活性如圖1B所示,結(jié)果表明,15 mg/mL CL制備的納米顆粒抑菌活性較其他質(zhì)量濃度CL制備的納米分散液顯著降低（P＜0.05）。從表1中可以看出,15 mg/mL CL制備的納米顆粒的粒徑比其他幾種質(zhì)量濃度制備的粒徑大1 倍以上,提示粒徑對抑菌活性有較大的影響。大的藥物裝載量在制備和使用時更經(jīng)濟,因此,從藥物裝載量和抑菌活性兩方面綜合考慮,采用12 mg/mL CL是較理想的,透射電子顯微鏡觀察表明,該納米分散液中的納米顆粒呈球形,均勻性較好（圖1C）。

圖1 CL-CS-NPs納米分散液（A）及其相對抑菌活性（B）和CL 12 mg/mL制備的樣品透射電子顯微鏡圖（C）Fig.1 Samples of CL-CS-NPs nanodispersions (A) and their relative anti-fungal activity (B), and transmission electron microscope of CL-CS-NPs nanodispersion prepared with 12 mg/mL CL (C)

2.2 CL-CS-NPs的CL釋放性

為了研究CL-CS-NPs的CL緩釋效果,測定了28 ℃下不同時間LB固體培養(yǎng)基上CL存留量。如圖2所示,游離CL處理、酪蛋白+CL混合物處理、CL-CS-NPs處理CL接近揮發(fā)完全的時間分別為2、4 d和6 d,CL-CS-NPs處理組的緩釋時間較游離CL處理組和酪蛋白+CL混合物處理組分別延長了4 d和2 d。表明納米化CL緩釋效果明顯,應(yīng)用CL-CS-NPs可以延長CL對病菌的作用時間。

圖2 培養(yǎng)基上噴灑CL-CS-NPs、酪蛋白CL混合物和游離CL不同時間的CL存留率Fig.2 Retention rates of CL after incubation of CL-CS-NPs, casein +CL mixture and free CL on the culture medium for different periods

2.3 CL-CS-NPs對離體枇杷炭疽菌的抑制作用

圖3 培養(yǎng)基上噴灑CL-CS-NPs和其他處理抑菌效果比較Fig.3 Comparison of in vitro antifungal effects of CL-CS-NPs,CL + CS mixture and free CL

如圖3所示,CL-CS-NPs組的完全抑菌時間達到5 d,酪蛋白+CL混合物和游離CL組均為3 d。由于游離CL組CL揮發(fā)快,因此在3 d之后,菌斑增長率開始迅速升高,而酪蛋白+CL混合物中的CL由于酪蛋白的作用可相對延緩CL揮發(fā)時間。CL-CS-NPs中的CL能夠緩釋,使得病菌被CL作用的時間大幅延長,因而完全抑制病菌生長的時間也大幅延長。因此,將CL-CS-NPs分散液直接噴涂在枇杷果實上,可較好地抑制枇杷腐爛。

2.4 CL-CS-NPs在枇杷果實上的防腐作用

由圖4可知,接種5 d后,噴涂蒸餾水的枇杷果實（空白對照）腐爛已比較嚴重,而噴涂CL-CS-NPs分散液的枇杷果實基本沒有出現(xiàn)腐爛（圖4A）。接種7 d后CL-CS-NPs組的平均病斑直徑僅為1.5 mm（圖4B）,發(fā)病率僅為10%（圖4C）,表明大多數(shù)枇杷果實沒有被病菌侵害,抗菌劑的效果良好。相對而言,噴涂酪蛋白+CL混合物的枇杷果實5 d后病斑直徑也相對較小,但發(fā)病率高達80%；7 d后的病斑平均直徑達到4.8 mm,腐爛比較嚴重。由此可見,CL-CS-NPs在枇杷果實上的抗菌效果良好,能夠用于采后枇杷果實及其他一些水果的抑菌防腐。

圖4 CL-CS-NPs分散液抑制枇杷炭疽菌引起的枇杷腐爛作用Fig.4 CL-CS-NPs dispersion inhibited anthracnose rot in loquats

3 討 論

酪蛋白納米載體由于其優(yōu)良的乳化性[15]和可自組裝膠束的性質(zhì)[16],被廣泛用作疏水藥物和生物活性化合物的遞送系統(tǒng)[17-20]。本研究表明,CL可以與酪蛋白的低極性氨基酸殘基（如酪氨酸殘基）相互作用,從而使酪蛋白+CL混合物釋放CL的速率顯著放緩；而CL被制備成CL-CS-NPs后,其釋放CL的速率又能進一步大幅減緩。培養(yǎng)基上噴灑游離CL、酪蛋白+CL混合物、CL-CS-NPs得到的CL釋放速率結(jié)果與枇杷果實上接種炭疽菌后涂布游離CL、酪蛋白+CL混合物、CL-CS-NPs產(chǎn)生的抑菌效果（圖3、4）基本一致。由此可以得出,CL-CS-NPs噴涂比其他處理抑制效果增強的主要原因是納米顆粒的緩釋作用使得功效成分抗菌作用的時效大大延長。

枇杷是我國南方特有的水果,以口感好、營養(yǎng)豐富而著稱。枇杷通常在溫暖的雨季成熟,易發(fā)生微生物感染,每年遭受的經(jīng)濟損失巨大。炭疽真菌引起的炭疽病是枇杷果實采后的主要病害[21-23]。雖然冷藏是一種被廣泛應(yīng)用的防腐技術(shù),可以保持枇杷特有的風(fēng)味,但冷藏會引起果肉的堅韌性和木質(zhì)化,使枇杷果實品質(zhì)顯著下降[24]。傳統(tǒng)上,枇杷果實采后病害的防治主要采用殺菌劑（如苯醚甲環(huán)唑、異菌脲、啼菌環(huán)胺、多菌靈、甲基硫菌靈、施保工等[25]）,由于殺菌劑殘留物對環(huán)境和人類健康的負面影響,近年來,采取其他措施控制枇杷果實的采后病害受到重視[26]。國內(nèi)外學(xué)者選擇安全無毒的物質(zhì)替代化學(xué)殺菌劑的研究越來越多[27]。Cao Shifeng等[28-29]使用茉莉酸甲酯處理接種炭疽菌的枇杷果實,發(fā)現(xiàn)該處理能降低枇杷果實的發(fā)病率、病斑直徑以及提高枇杷果實的貯藏品質(zhì)。張春萍等[30]使用殼聚糖和那他霉素涂膜液處理枇杷果實,發(fā)現(xiàn)該處理能夠減少枇杷果實的腐爛。Schirra[31]和Liu Fengjuan[32]等對枇杷果實用加熱和皮氏畢赤酵母聯(lián)合處理,結(jié)果表明,該方法對炭疽病有一定的防治效果。Wang Kaituo等[33]用乙醇處理枇杷果實后,發(fā)現(xiàn)枇杷炭疽病得到明顯抑制。以上方法各有優(yōu)缺點,可為解決枇杷腐爛問題提供技術(shù)支撐。

本研究采用食品安全性高的酪蛋白包埋天然抗菌物質(zhì)CL,由于納米顆粒的緩釋作用使得CL發(fā)揮抗菌作用的時間大幅延長,所得納米化的CL對枇杷的抗炭疽菌效果顯著提高。這種納米化的CL有望在枇杷的產(chǎn)后保鮮中得到實際應(yīng)用。進一步的研究有望將CL-CS-NPs分散液開發(fā)成果蔬抗菌保鮮劑。