高速逆流色譜分離純化桑葚花色苷及其抗氧化活性

薛宏坤,李鵬程,鐘 雪,劉成海,李 倩

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)工程學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150030；2.清華大學(xué)工程物理系,粒子與輻射成像教育部重點實驗室,北京 100084；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,吉林 長春 130112；4.大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,遼寧 大連 116622）

桑葚為?？粕伲∕orus albaL.）的聚花果,果實柔軟多汁、色澤誘人、風(fēng)味獨特,且含有豐富的活性蛋白、白藜蘆醇、超氧化物歧化酶、花青素等活性成分[1],具有較高的醫(yī)學(xué)和藥用價值,備受人們喜愛?；ㄇ嗨厥巧］刂凶钪匾幕钚晕镔|(zhì),屬于水溶性的天然色素,安全無毒,在植物細胞液中多數(shù)以糖苷鍵形成花色苷而存在,其基本結(jié)構(gòu)單元是C6-C3-C6骨架構(gòu)成的2-苯基苯并吡喃[2]。因花色苷獨特的結(jié)構(gòu)使其具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、預(yù)防心血管疾病和增強視力等功效[3]。近年來,植物花色苷所呈現(xiàn)的生物活性和藥理作用引起廣泛關(guān)注,特別是隨著合成色素暴露引發(fā)越來越多的安全問題,天然色素資源的探尋和開發(fā)已逐漸成為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點。目前,雖然對花色苷生理活性研究較多,但已有的研究結(jié)果仍存在不確定性,因為大部分研究主要針對花色苷粗提物,而從單一花色苷組分獲得的研究數(shù)據(jù)有限。因此為進一步明確花色苷單體的生理活性,亟需尋找能獲得單一高純度花色苷組分的分離純化方法。

桑葚花色苷的有效富集和純化是獲得單一高純度花色苷單體的關(guān)鍵步驟。桑葚花色苷粗提物中含有大量糖類、蛋白質(zhì)類、脂類及色素等雜質(zhì),嚴重影響花色苷的生物學(xué)活性和純度[4],為獲得單一高純度花色苷單體,必須要對花色苷粗提物進行分離和純化。傳統(tǒng)分離花色苷的方法主要用大孔樹脂層析、凝膠層析、C18反向色譜等方法[5]。但以上純化花色苷的方法均存在制備量小、重現(xiàn)性差等缺點,無法滿足對大量高純度花色苷的需求。

高速逆流色譜（high-speed counter-current chromatography,HSCCC）技術(shù)是利用物質(zhì)在兩相中分配系數(shù)的不同而實現(xiàn)分離的一種色譜技術(shù),具有簡單快捷、制備量大、分離效率高、重現(xiàn)性好、無不可逆吸附、成本低和樣品回收完全等優(yōu)點。因此,該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于越橘[6]、紫甘薯[7]、木瓜花瓣[8]、玫瑰茄[9]、楊梅[10]等植物花色苷分離純化。而采用HSCCC分離純化桑葚花色苷及對其組分進行鑒定分析的研究報道有限。鑒于此,本研究在大孔樹脂分離純化桑葚花色苷的基礎(chǔ)上,通過HSCCC技術(shù)進一步對其進行分離純化,結(jié)合紫外-可見光譜、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（high performance liquid chromatography-mass spectrometry,HPLC-MS）技術(shù)及核磁共振（nuclear magnetic resonance,NMR）技術(shù)對分離純化得到的組分進行鑒定,同時測定桑葚花色苷粗提取物和分離得到花色苷組分的體外抗氧化活性,以期為功能性食品和保健食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葚采摘于黑龍江大興安嶺地區(qū),采摘時間2018年8～9月,經(jīng)除雜、洗凈、晾干后,于-18 ℃冰箱中冷凍保存。

乙醇、甲醇、甲酸（分析純）、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid,TBA）、大豆卵磷脂（lecithin soybean,LS）、三氯乙酸（trichloroacetic acid,TCA）（分析純） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；乙腈（acetonitrile,ACN）、正丁醇（BuOH,BH）、甲基叔丁基醚（methyl tert-butyl ether,MTBE）、三氟乙酸（trifluoroacetic acid,TFA）（色譜純） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；AB-8大孔樹脂 天津市大鈞科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1100 HPLC、1290 HPLC-G6500四極桿飛行時間MS聯(lián)用儀 美國Agilent公司；HSCCC-300C HSCCC儀上海同田生物技術(shù)股份有限公司；SHZ-D（III）型循環(huán)水式真空泵 鞏義儀器有限責(zé)任公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；XY-S650CT臺式恒溫超聲波提取機 上海析宇儀器有限公司；Advance III NMR光譜儀 瑞士Bruker公司；UV-mini1240紫外-可見分光光度計 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗流程

實驗設(shè)計流程為：

1.3.2 桑葚花色苷粗提物的制備

在預(yù)實驗的基礎(chǔ)上,采用體積分數(shù)60%乙醇溶液（含體積分數(shù)0.05%醋酸）作為提取溶劑。稱取1.5 kg冷凍狀態(tài)桑葚果于打漿機中進行打漿,然后稱取1 kg果漿,按照料液比1∶4加入提取溶劑,調(diào)節(jié)pH值至2.0,同時設(shè)定超聲功率300 W、提取溫度50 ℃、提取時間25 min,提取結(jié)束后,過濾,將濾渣在同樣條件下提取2 次,合并3 次所得濾液,35 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮,回收乙醇；將濃縮液以1∶1的體積比再加入無水乙酸乙酯萃取3 次,收集水相,35 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮,得到花色苷粗提液?；ㄉ沾痔嵋阂? BV/h流速通過已活化的AB-8大孔樹脂柱（2.6 cm×60 cm）,待上樣完成后,將其靜置15 min,然后分別以2 BV的蒸餾水和3 BV體積分數(shù)40%、60%、80%酸化乙醇（含體積分數(shù)0.05%醋酸）依次洗脫,流速3 BV/h,收集體積分數(shù)60%乙醇洗脫液,將其用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于35 ℃減壓濃縮、冷凍干燥,得到花色苷粗提物粉末61.5 g,避光密封保存在-18 ℃冰箱中。

1.3.3 HSCCC溶劑系統(tǒng)選擇

參考Qiu Fang等[11]的方法選取BH-MTBE-ACN-水-TFA作為HSCCC溶劑體系,將不同溶劑按照比例進行配制,振搖后靜置分層,上相為固定相、下相為流動相。根據(jù)化合物在兩相中的分配系數(shù)不同,篩選最適的溶劑比例。準確稱取0.1 g經(jīng)1.3.2節(jié)制備的花色苷粗提物粉末溶解于上相（10 mL）與下相（10 mL）中,搖勻,待兩相分配達到平衡后,將兩相進行分離,分別各取1 mL,然后將其用0.45 μm膜過濾,用HPLC檢測分析,依據(jù)式（1）計算不同溶劑的分配系數(shù)K。

式中：K為化合物在兩相中的分配系數(shù)；A1為上相中化合物的峰面積；A2為下相中化合物峰面積。

1.3.4 HSCCC分離制備

按照1.3.3節(jié)篩選的最佳BH-MTBE-ACN-水-TFA比例組合為HSCCC溶劑體系,將配好的溶劑體系靜置過夜后兩相分離,超聲脫氣30 min。進樣前,首先開啟循環(huán)水浴儀,設(shè)定溫度25 ℃、固定相流速15 mL/min,待固定相充滿螺線管后,打開主機電源,緩慢正向調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速至850 r/min,當(dāng)轉(zhuǎn)速恒定后,以2 mL/min流速泵入流動相,待整個體系建立完成后,準確稱取花色苷粗提物粉末0.2 g用20 mL下相充分溶解,進樣開始分離,檢測波長254 nm,根據(jù)色譜流出圖對組分出峰部位進行分步收集,流速3 mL/min,每管收集6 mL,對收集得到的組分進行冷凍干燥,且避光保存在-18 ℃冰箱中備用。

1.3.5 純度測定與組分鑒定

1.3.5.1 紫外-可見光譜分析

采用質(zhì)量分數(shù)0.03%氯化鉀溶液分別溶解1.0 mg經(jīng)1.3.4節(jié)HSCCC分離所得組分,然后分別將其在200～700 nm波長處進行光譜掃描[12],分析其光譜特征。

1.3.5.2 HPLC分析檢測

樣品處理：分別準確稱取1.0 mg經(jīng)1.3.4節(jié)HSCCC分離所得組分和花色苷粗提物粉末,并用體積分數(shù)0.1%HCl-甲醇溶液稀釋后,配制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的樣品溶液,溶液過0.45 μm濾膜,用于HPLC分析。

色譜條件：1100 C18柱（150 mm×4.6 mm,2.6 μm）；流動相A：甲酸-水（體積比1∶5）；流動相B：乙腈-水-甲酸（體積比62∶40∶3）；洗脫程序：10% B（0 min）～30% B（10 min）～30% B（15 min）～100% B（25 min）～100% B（30 min）～10% B（45 min）；流速0.5 mL/min；柱溫25 ℃；進樣量20 μL；檢測波長520 nm。依據(jù)峰面積歸一法計算所得組分的純度（以峰面積比例表示）,計算公式如式（2）所示。

式中：wi為待測組分i的峰面積比例/%；fi為校正因子；Ai為待測組分i的峰面積。

1.3.5.3 HPLC-MS分析

HPLC條件：1290 C18柱（150 mm×2.1 mm,5 μm）,流動相A：體積分數(shù)0.1%甲酸水溶液；流動相B：體積分數(shù)0.1%甲酸乙腈溶液；洗脫程序：15% B（0 min）～40% B（15 min）～60% B（20 min）～75% B（30 min）～90%B（35 min）～15% B（45 min）；流速0.2 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量20 μL；檢測波長525 nm。

MS條件：電噴霧電離離子源,MS采用正離子掃描方式,質(zhì)量掃描范圍m/z100～1 000,毛細管電壓4.5 kV,霧化器壓力138 kPa,干燥氣溫度335 ℃。

1.3.5.4 NMR結(jié)構(gòu)鑒定

樣品處理：分別準確稱取1.0 mg經(jīng)1.3.4節(jié)HSCCC分離所得組分,并用氚代甲醇溶解,配制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的樣品溶液,溶液過0.45 μm濾膜,用于NMR分析。通過MS、1H-NMR和13C-NMR光譜數(shù)據(jù)庫及參考文獻,確定組分結(jié)構(gòu)。

1.3.6 抗氧化能力測定

1.3.6.1 抗脂質(zhì)體過氧化能力測定

參照樊金玲等[13]的方法并略作改動。分別準確稱取2.0 mg樣品（花色苷粗提物粉末、組分I、II、III）,用體積分數(shù)60%酸化乙醇（含體積分數(shù)0.05%醋酸）將其配制成不同質(zhì)量濃度（0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 g/L和1.50 g/L）樣品溶液。分別取1 mL樣品溶液,分別加入1 mL LS溶液和1 mL 0.4 mol/L FeSO4溶液,充分混合。避光37 ℃恒溫水浴1 h,再加入2 mL TCA-TBA-HCl（15 g TCA、0.37 g TBA、2.1 mL HCl）混合液,避光水浴15 min,然后以3 000 r/min離心10 min,取上清液在532 nm波長處測定其吸光度。以相同質(zhì)量濃度VC溶液為陽性對照,依據(jù)公式（3）計算脂質(zhì)體抑制率。

式中：A樣品為樣品組的吸光度；A對照為以1 mL VC溶液代替1 mL樣品溶液,操作同上,測得的對照管吸光度。

1.3.6.2 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除能力測定

參照封燕等[14]的方法并略作改動。分別準確稱取3.0 mg樣品（花色苷粗提物粉末、組分I、II、III）,采用體積分數(shù)60%酸化乙醇（含體積分數(shù)0.05%醋酸）將其配制成不同質(zhì)量濃度（0.10、0.20、0.40、0.60、0.80 g/L和1.00 g/L）樣品溶液。分別取出2 mL置于6 個10 mL具塞比色管中,分別加入2.8 mL 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine,DPPH）溶液并將其充分混合,避光室溫下放置30 min,在517 nm波長處分別測定其吸光度。以相同質(zhì)量濃度VC溶液為陽性對照,由公式（4）計算DPPH自由基清除率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析處理

每組實驗重復(fù)3 次,結(jié)果用平均值±標準差表示；采用Statistix 8.0軟件對每組實驗數(shù)據(jù)進行方差分析；采用SAS 8.0軟件分析結(jié)果的差異顯著性,以P＜0.05表示差異顯著；通過Origin 9.0軟件繪圖,Chemical Draw 15.0軟件繪制花色苷結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 HSCCC溶劑體系的確定

采用HSCCC技術(shù)分離天然產(chǎn)物最關(guān)鍵的步驟就是確定合適的溶劑體系,參考文獻[15-16],本研究采用BH-MTBE-ACN-水-TFA為溶劑體系,并采用HPLC法快速、高效地測定K,確定最適的HSCCC溶劑體系配比,各溶劑配比及K如表1所示。

表1 不同溶劑體系配比的分配系數(shù)Table 1 Distribution coefficients (K) of different solvent systems

由表1可知,溶劑體系2、3、4各組分的K均在0.5～2.0范圍內(nèi),符合HSCCC溶劑體系配比,但在2、3、4體系中,不同組分K無顯著差異（P＞0.05）,導(dǎo)致4 種組分不能完全分開,故不適合作HSCCC溶劑體系。體系5中各組分的K較小,組分分離效果較差,因此,體系5不適合作為HSCCC溶劑體系。體系1各組分的K均在0.5～2.0,且各組分的K具有顯著差異（P＜0.05）,組分分離效果較好,結(jié)果說明體系1適合作為HSCCC溶劑體系。該結(jié)果與Chen Liang[17]和Li Bo[18]等利用HSCCC技術(shù)分別從藍果忍冬和黑米糠分離花色苷所用HSCCC溶劑體系配比一致。

2.2 HSCCC分離純化結(jié)果

依據(jù)1.3.4節(jié)的方法,以BH-MTBE-ACN-水-TFA（2∶2∶1∶5∶0.01,V/V）作為HSCCC溶劑體系,桑葚花色苷經(jīng)HSCCC分離所得實驗結(jié)果如圖1所示。

圖1 HSCCC法分離桑葚花色苷的色譜圖Fig.1 HSCCC chromatogram of anthocyanins separated from mulberry fruit

由圖1可知,桑葚花色苷經(jīng)HSCCC分離,一共得到4 個組分,分別命名為組分I～IV,同時測定固定相的保留率為52.6%,說明所用HSCCC溶劑體系可行,且目標成分分離良好。從200 mg花色苷粗提物粉末中分離得到組分I（34.8 mg）、組分II（67.4 mg）、組分III（19.6 mg）、組分IV（16.3 mg）。

2.3 紫外-可見光譜分析結(jié)果

經(jīng)HSCCC分離所得的組分I～IV分別用質(zhì)量分數(shù)0.03%氯化鉀溶液溶解,并稀釋至一定質(zhì)量濃度,然后用紫外-可見光譜儀進行掃描,其吸收光譜如圖2所示。

圖2 HSCCC法分離桑葚花色苷組分的紫外-可見光譜Fig.2 UV-Vis spectra of anthocyanin components separated from mulberry fruit by HSCCC

花色苷屬于多羥基的黃酮類化合物,分別在波長280 nm和520 nm左右具有特征吸收峰,而其他黃酮類化合物（黃酮醇、黃酮、黃烷酮等）在波長300～400 nm和240～280 nm的紫外區(qū)具有特征吸收[19]。因此,可以根據(jù)組分在波長280 nm和520 nm左右有無吸收特征,作為判斷是否為花色苷類物質(zhì)的依據(jù)。由圖2a～c可知,組分I～III均在波長280 nm和520 nm左右具有特征吸收峰,說明組分I～III均為花色苷類物質(zhì)。由圖2d可知,組分IV在255 nm波長處具有特征吸收峰,且在波長280 nm和520 nm左右均無特征吸收峰,說明組分IV為非花色苷的黃酮類化合物,由于本研究的主要目的是分離純化桑葚花色苷,故組分IV不再進行后續(xù)的研究。

2.4 HPLC檢測分析結(jié)果

采用HPLC對桑葚花色苷粗提取粉末和經(jīng)HSCCC分離所得的花色苷組分（組分I、II、III）進行純度檢測分析,其結(jié)果如圖3所示。

圖3 桑葚花色苷粗提物及組分I、II、III的HPLC圖Fig.3 HPLC chromatograms of crude extract, and components I, II and III

由圖3可知,桑葚花色苷粗提物包含3 種花色苷組分,且分離效果較好。依據(jù)出峰時間確定組分I～III分別對應(yīng)圖3a中的1～3號峰。另外,組分I～III的HPLC圖均無雜峰,表明組分I～III均為單一的花色苷組分。根據(jù)峰面積計算組分I～III的純度分別為92.27%、94.05%和90.82%。采用HPLC-MS和NMR技術(shù)進一步鑒定以上3 種花色苷組分。

2.5 HPLC-MS和NMR檢測分析

為確定組分I～III的結(jié)構(gòu),利用HPLC-MS和NMR技術(shù)對其進行鑒定。根據(jù)一級MS、二級MS、1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)來確定花色苷的結(jié)構(gòu),上述3 種花色苷組分的MS圖見圖4,其鑒定結(jié)果如表2所示。

由表2可知,組分I保留時間為13.72 min,圖4a1、a2中的MS和MS2信息表明,其分子離子峰[M+]為465.1,在MS中檢測到碎片離子為m/z303.1。m/z303是飛燕草素的特征離子,丟失的碎片為m/z162,可能是失去葡萄糖和半乳糖；另外組分I的紫外-可見光譜顯示其可見光譜最大波長為523 nm,且A440nm/Aλmax為28.0%,結(jié)合文獻[20-21]分析,初步可判定組分I為飛燕草素-3-葡萄糖苷。將組分I進一步由NMR分析,1H NMR（CF3COODCD3OD）：δ6.66（1H, d,J＝1.2 Hz, H-6）、6.87（1H, d,J＝1.2 Hz, H-8）、7.74（2H, d,J＝2.2 Hz, H-2', 6'）、8.93（1H, s, H-4）；5.34（1H, d,J＝7.8 Hz, H-1 glc）、3.73（1H, m, H-2 glc）、3.60（2H, m, H-3,5 glc）、3.51（1H, m, H-4 glc）、3.79（1H, dd,J＝12.2, 5.4 Hz, H-6b glc）、3.94（1H, dd,J＝12.2, 2.0 Hz, H-6a glc）。13C NMR（CF3COODCD3OD）：δ164.2 （C-2）、144.6（C-3）、136.8（C-4）、159.4（C-5）、103.1（C-6）、170.8（C-7）、95.4（C-8）、157.8（C-9）、113.0（C-10）、121.5（C-1'）、113.7（C-2'）、147.6（C-3'）、146.0（C-4'）、147.9（C-5'）、113.4（C-6'）、103.5（C-1 glc）、74.8（C-2 glc）、78.0（C-3 glc）、71.2（C-4 glc）、78.8（C-5 glc）、62.3（C-6 glc）。組分I的1H NMR在δ6.66（2H, d）和δ6.87（2H, d）存在二重質(zhì)子峰,耦合常數(shù)J＝1.2 Hz,表明A環(huán)上存在兩個超耦合的雙重質(zhì)子,推測為H-6和H-8。在δ7.74（2H, d,J＝2.2 Hz）下觀察到一組AM系統(tǒng)的雙峰,這是H-2'和H-6'的特征。δ5.34（1H, d,J＝7.8 Hz）表明組分I僅含有一個單葡萄糖,同時在δ144.6處與C-3配基結(jié)合。該研究結(jié)果與Alexandra等[22]研究香蕉苞花色苷飛燕草素-3-葡萄糖苷的NMR信息相一致,故最終確定組分I為飛燕草素-3-葡萄糖苷。

圖4 花色苷組分質(zhì)譜圖Fig.4 MS of anthocyanin components

由表2可知,組分II保留時間為21.84 min,圖4b1、b2中的MS和MS2信息表明,其分子離子峰[M+]為449.1,在MS中檢測到碎片離子為m/z287.2。m/z287是矢車菊素的特征離子,丟失的碎片162可能是失去葡萄糖和半乳糖；另外組分II的紫外-可見光譜顯示其可見光譜最大波長為516 nm,且A440nm/Aλmax為20.0%,參考文獻[23-24],初步判定組分II為矢車菊素-3-葡萄糖苷。將組分II進一步用NMR分析,1H NMR（CF3COOD-CD3OD）：δ6.64（1H, d,J＝1.2 Hz, H-6）、6.86（1H, d,J＝1.2 Hz, H-8）、8.22（1H, dd,J＝8.8, 2.2 Hz, H-6'）、8.02（1H, d,J＝2.2 Hz, H-2'）、7.04（1H, d,J＝8.8 Hz, H-5'）、8.98（1H, s, H-4）、5.31（1H, d,J＝7.8 Hz, H-1 glc）、3.69（1H, m, H-2 glc）、3.56（2H, m, H-3,5 glc）、3.46（1H, m, H-4 glc）、3.73（1H, dd,J＝12.2, 5.6 Hz, H-6b glc）、3.96（1H, dd,J＝12.2, 2.2 Hz, H-6a glc）。13C NMR （CF3COODCD3OD）：δ164.5（C-2）、145.8（C-3）、137.2（C-4）、159.6（C-5）、103.7（C-6）、170.8（C-7）、95.4（C-8）、157.9（C-9）、113.6（C-10）、121.5（C-1'）、118.7（C-2'）、147.6（C-3'）、156.0（C-4'）、117.7（C-5'）、128.4（C-6'）、104.1（C-1 glc）、75.0（C-2glc）、78.3（C-3glc）、71.3 （C-4 glc）、79.0（C-5 glc）、62.6（C-6 glc）。組分II的1H NMR表明,在δ6.64和δ6.86時,A環(huán)上存在兩個超耦合的雙重質(zhì)子（J＝1.2 Hz）,分別分配給H-6和H-8。在δ7.04（1H, d,J＝8.8 Hz）、8.22（1H, dd,J＝8.8, 2.2 Hz）、8.02（1H, d,J＝2.2 Hz）時,觀察到兩組雙峰和一組ABM系統(tǒng)的雙峰,分別具有H-5'、H-6'和H-2'的特征。環(huán)C是黃烷酮的一部分,且在δ3.46～5.31處的質(zhì)子信號（H-1-glc-H-6-glc）,表明組分II僅含有一個D-吡喃葡萄糖,在組分II的1H異核多碳相關(guān)譜中,在δ5.31/145.8（H-1 glc/C-3）處的交叉峰表明葡萄糖鏈接在C-3上[25]。Lee等[26]研究鵝掌楸果實花色苷的矢車菊素-3-葡萄糖苷的NMR信息與組分II一致,故最終確定組分II為矢車菊素-3-葡萄糖苷。

由表2可知,組分III保留時間為28.39 min,圖4c1、c2中的MS和MS2信息表明,其分子離子峰[M+]為433.1,在MS中檢測到碎片離子為m/z271.0,m/z271碎片離子是[M+H－162]所得,同時m/z271是天竺葵素的特征離子,且組分III的紫外-可見光譜顯示其可見光譜最大波長為516 nm。參考文獻[27],組分III初步判定為天竺葵素-3-葡萄糖苷。將組分III進一步由NMR分析,1H NMR（CF3COOD-CD3OD）：δ6.67（1H, d,J＝1.2 Hz, H-6）、6.94（1H, d,J＝1.2 Hz, H-8）、7.05（2H, d,J＝8.8 Hz, H-3', 5'）、8.60（2H, d,J＝8.8 Hz, H-2', 6'）、9.08（1H, s, H-4）、5.34（1H, d,J＝8.0 Hz, H-1 glc）、3.68（1H, m, H-2 glc）、3.54（2H, m, H-3,5 glc）、3.42（1H, m, H-4 glc）、3.80（1H, dd,J＝12.2, 6.0 Hz, H-6b glc）、4.04（1H, dd,J＝12.2, 2.0 Hz, H-6a glc）。13C NMR（CF3COODCD3OD）：δ164.8（C-2）、145.8（C-3）、137.4（C-4）、159.9 （C-5）、103.7（C-6）、170.9（C-7）、95.5（C-8）、158.1（C-9）、114.5（C-10）、121.5（C-1'）、136.8（C-2'）、118.6（C-3'）、166.0（C-4'）、118.7（C-5'）、136.4（C-6'）、104.1（C-1 glc）、75.3（C-2 glc）、78.5（C-3 glc）、71.3（C-4 glc）、79.0（C-5 glc）、62.6（C-6 glc）。同理,按照上述方式對組分III結(jié)構(gòu)進行解析,同時參考組分III的相關(guān)NMR文獻[28],最終確定組分III為天竺葵素-3-葡萄糖苷。

表2 桑葚花色苷種類鑒定結(jié)果Table 2 Identification of anthocyanins from mulberry fruit

2.6 抗氧化分析結(jié)果

2.6.1 脂質(zhì)體過氧化能力的結(jié)果分析

卵磷脂通常被作為細胞模型用于體外脂質(zhì)體過氧化實驗,卵磷脂內(nèi)含有高密度脂蛋白、低密度脂蛋白和極低密度脂蛋白。在Fe3+的催化下,其低密度脂蛋白和極低密度脂蛋白中的不飽和脂肪酸能發(fā)生過氧化反應(yīng)。因此,可以通過Fe3+誘導(dǎo)卵磷脂體過氧化模型來評價桑葚花色苷的抗氧化活性[29]。在卵磷脂過氧化實驗中,在532 nm波長處檢測TBA反應(yīng)物質(zhì)吸光度可以反映脂質(zhì)體過氧化程度。桑葚花色苷粗提取物、組分I～III和VC對抑制脂質(zhì)過氧化能力的測定結(jié)果如圖5所示。

圖5 桑葚花色苷和VC對脂質(zhì)體抑制率的影響Fig.5 Inhibitory effect of mulberry anthocyanins and VC on lipid peroxidation

由圖5可知,桑葚花色苷粗提物、組分I～III和VC均對脂質(zhì)體過氧化有抑制作用,且隨樣品質(zhì)量濃度的增加,脂質(zhì)抑制率顯著增加（P＜0.05）。桑葚花色苷粗提物、組分I～III和VC抑制脂質(zhì)體過氧化的半抑制濃度（50% inhibiting concentration,IC50）分別為（0.77±0.02）、（0.34±0.02）、（0.55±0.04）、（0.68±0.01）g/L和（0.91±0.03）g/L。分析樣品的IC50可知,樣品的抗氧化能力順序為組分I＞組分II＞組分III＞桑葚花色苷粗提物＞VC。其可能原因是組分I結(jié)構(gòu)上還原性酚羥基多于組分II和組分III。由于還原性酚羥基能夠直接與酶和非酶系統(tǒng)產(chǎn)生的氧自由基發(fā)生反應(yīng),避免發(fā)生脂質(zhì)體過氧化反應(yīng)而產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物；另外,由于還原性酚羥基產(chǎn)生共軛效應(yīng),氧原子上不成對的電子靠近苯環(huán),使氫氧鍵作用力減弱,造成酚羥基氫原子活性提高,易于脫氫而形成供氫體,供氫體能與脂類化合物的自由基發(fā)生反應(yīng),轉(zhuǎn)化成非常穩(wěn)定的酚自由基,從而降低自動氧化鏈反應(yīng)的傳遞速率,抑制脂類進一步氧化,故使抗脂質(zhì)體過氧化能力增強[30]。組分I、II、III對脂質(zhì)體抑制率高于桑葚花色苷粗提物。其原因是桑葚花色苷粗提物中含有不具有抗氧化能力的雜質(zhì),因此降低其對脂質(zhì)體抑制率。

2.6.2 DPPH自由基清除能力分析結(jié)果

DPPH自由基是一種含有氮元素的穩(wěn)定自由基,在醇溶液中呈現(xiàn)紫色,在517 nm波長處對紫外光有最大吸收[31],本研究通過DPPH自由基清除能力來判斷花色苷的抗氧化能力。

圖6 桑葚花色苷和VC對DPPH自由基清除率的影響Fig.6 DPPH radical scavenging effect of mulberry anthocyanins and VC

由圖6可知,隨組分I、II、III質(zhì)量濃度增加,DPPH自由基清除率呈現(xiàn)先顯著增加后無顯著變化的趨勢。桑葚花色苷粗提物、組分I、II、III和VC對DPPH自由基清除率的IC50分別為（0.40±0.01）、（0.16±0.01）、（0.22±0.01）、（0.35±0.03）g/L和（0.59±0.02）g/L。IC50越低表示抗氧化活性越強。對比IC50可知,組分I對DPPH自由基清除能力最強,且桑葚花色苷粗提物和組分I、II、III對DPPH自由基清除能力均高于VC。組分I對DPPH自由基清除能力優(yōu)于組分II和組分III,其主要原因與其花色苷單體的結(jié)構(gòu)相關(guān),組分II和組分III苯環(huán)上還原性酚羥基的數(shù)目少于組分I,且組分III還原性酚羥基的數(shù)目少于組分II,在氧化過程中,還原性酚羥基作為主要的還原部位,能作為供氫體與氧化過程中產(chǎn)生的DPPH自由基發(fā)生反應(yīng),自身形成的自由基可以通過分子內(nèi)氫鍵、半醌式自由基等形式得以穩(wěn)定,從而中斷自由基鏈的反應(yīng)[32]。因此,花色苷組分對DPPH自由基清除能力大小順序為組分I＞組分II＞組分III。

3 結(jié) 論

桑葚花色苷粗提物經(jīng)HSCCC分離純化后,得到4 種組分,并經(jīng)紫外-可見光譜、HPLC-MS和NMR鑒定發(fā)現(xiàn)組分IV為非花色苷類,組分I～III分別為飛燕草素-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-葡萄糖苷和天竺葵素-3-葡萄糖苷,其含量和純度分別為17.4、33.7、9.8 mg/100 mg和92.27%、94.05%、90.82%。桑葚花色苷對脂質(zhì)體抑制和DPPH自由基清除能力大小順序均為組分I＞組分II＞組分III＞桑葚花色苷粗提物。本研究建立了從桑葚中分離純化高純度花色苷的HSCCC方法,同時為花色苷的進一步藥理活性研究提供重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。