二氫楊梅素-Ag+納米乳液的制備及其對金黃色葡萄球菌抑制性能與機理

丁利君,黃梓浩,劉 丹

（廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院,廣東 廣州 510006）

病原微生物是新世紀(jì)以來食品安全中面臨的重大威脅[1-3],尤其是生鮮食品文化的興起,為保證食品安全同時滿足人們對于食品健康的追求,現(xiàn)有研究已證明天然產(chǎn)物具有優(yōu)異的抑菌性能[4-5],天然抑菌劑的開發(fā)越來越受人們重視[6-8]。二氫楊梅素（dihydromyricetin,DMY）是一種多酚羥基雙氫黃酮醇,是黃酮類物質(zhì)。廣泛存在于藤茶中,具有抗菌[9-10]、抗氧化[11-12]、防腐[13]等多種活性,可替代成為新型的天然抗菌劑、抗氧化劑和防腐劑,在食品行業(yè)中的應(yīng)用有很好的前景,但其穩(wěn)定性差和水難溶性限制了其應(yīng)用推廣。Ag+是典型的廣譜金屬離子抑菌劑,主要原因是它極易被還原（氧化還原電位低、離子化傾向高）,而且與有機物官能團反應(yīng)力強,但是過量的Ag+對于機體的正常細(xì)胞也會產(chǎn)生破壞和影響,所以GB 5749—2006《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定其質(zhì)量濃度不能超過50 μg/L[14-15],而此限量并不能完全抑制食品中的細(xì)菌,無法起到食品保質(zhì)的作用?；诖?本實驗提出構(gòu)建DMY-Ag+納米乳液體系,以期解決DMY水難溶性不穩(wěn)定的問題,并通過協(xié)同作用提高體系的抑菌性能,彌補Ag+添加量限制的缺陷,為天然抑菌劑的開發(fā)提供新思路和新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金黃色葡萄球菌ATCC6538 廣東省微生物菌種保存中心；DMY（純度≥98%） 貴州苗藥生物有限公司；硝酸銀（分析純、純度≥99.8%）、3,5-二硝基水楊酸（純度≥98%）、酒石酸鉀鈉（分析純、純度≥99%）、苯酚（分析純）、無水亞硫酸鈉（分析純、純度≥98%） 上海麥克林生化科技有限公司；營養(yǎng)瓊脂、LB肉湯 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline,PBS） 天津大茂化學(xué)試劑公司；硝基氯化碘（iodonitrotetrazolium chloride,INT）（分析純、純度≥98%） 上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FP-1100-C全自動生長曲線儀 芬蘭Bioscreen公司；HT 7700透射電子顯微鏡 日本日立儀器設(shè)備有限公司；UV-1800PC紫外-可見分光光度計 上海美譜達(dá)儀器有限公司；Bante 901電導(dǎo)率儀 上海邦特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化和菌懸液的制備

金黃色葡萄球菌保存在4 ℃的營養(yǎng)瓊脂（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)2% NaCl,下同）斜面上,實驗前在37 ℃下培養(yǎng)24 h進行活化?；罨蟮木w接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中,取3～5接種環(huán)接入LB肉湯培養(yǎng)基（含2% NaCl）在37 ℃下氣浴搖床（100 r/min）中培養(yǎng)24 h。菌懸液的菌體濃度調(diào)整至104～108CFU/mL用于各項實驗。

1.3.2 DMY梯度濃度溶液的制備

0.1 g DMY溶解于5 mL體積分?jǐn)?shù)為20%的乙醇溶液中,然后用蒸餾水將DMY的醇溶液2 倍稀釋至10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078、0 mg/mL系列梯度。

1.3.3 DMY對金黃色葡萄球菌最低抑菌濃度的確定

使用3 種方法（生長曲線、抑菌圈直徑與平板計數(shù)）確定DMY對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration,MIC）。全自動生長曲線能夠準(zhǔn)確記錄活菌數(shù)隨著時間變化的變化,在600 nm波長處的吸收強度代表活菌數(shù)量,因此可使用全自動生長曲線儀記錄DMY對于金黃色葡萄球菌體的生長抑制[16]。將0.1 mL的菌懸液（106CFU/mL）與0.9 mL的DMY處理液在試管中混合后置于37 ℃下氣浴搖床（150 r/min）中處理5 min,然后取300 μL處理后的混合液與100 μL LB肉湯培養(yǎng)基滴加于孔板的測試小孔中,用全自動生長曲線儀每1 h記錄1 次小孔的生長情況,直至20 h停止。與空白組對比可以得出各個質(zhì)量濃度的DMY對于金黃色葡萄球菌的抑制能力。

抑菌圈直徑是檢測DMY對于金黃色葡萄球菌的MIC比較直觀的方法[17]。將菌懸液（104CFU/mL）與營養(yǎng)瓊脂（冷卻至45 ℃）以1∶50的比例混合均勻,然后倒15 mL至培養(yǎng)皿中使其在室溫下凝固。凝固后用牛津杯在每個培養(yǎng)基中打出3 個6 mm直徑的小孔,然后向每個小孔分別注入濃度梯度的DMY處理液與培養(yǎng)基表面持平。培養(yǎng)基在5～10 ℃下存放1 h使處理液充分?jǐn)U散至培養(yǎng)基中,接著培養(yǎng)基在37 ℃下培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈直徑。

平板計數(shù)是用來確定DMY對于金黃色葡萄球菌的MIC重要的傳統(tǒng)方法[18]。將0.1 mL菌懸液（106CFU/mL）與0.9 mL的DMY處理液在試管中混合后置于37 ℃下氣浴搖床（150 r/min）中處理5 min,然后取0.1 mL處理后的混合液滴加在滅菌的瓊脂培養(yǎng)基表面并涂布均勻,進行3 次平行,在37 ℃下孵育10 h,然后進行計數(shù)。

此3 種方法同樣用于確定DMY-Ag+納米乳液的抑菌效果。

1.3.4 DMY-Ag+納米乳液的制備及表征

因為DMY的水難溶性限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用,所以一個穩(wěn)定的納米乳液系統(tǒng)能夠提高其在水溶液體系中的含量。首先將15 mL DMY的醇溶液（體積分?jǐn)?shù)20%）與10 mL吐溫-80（體積分?jǐn)?shù)10%）水溶液在磁力攪拌器中均勻攪拌5 min,然后緩慢滴加25 mL AgNO3（50 μg/L）水溶液,繼續(xù)攪拌10 min。最后得到納米乳液組成為1.25 mg/mL DMY+50 μg/L Ag+。使用紫外-可見分光光度計進行全波長掃描研究納米乳液的組裝方式,用HT 7700透射電子顯微鏡觀測乳液的形態(tài)和尺寸。將一滴納米乳液滴在銅網(wǎng)上在37 ℃下隔夜干燥后進行觀察。

1.3.5 電導(dǎo)率的測定

菌懸液中電導(dǎo)率變化可以反映菌體胞壁和胞膜的破損和通透性變化。1 mL菌懸液（106CFU/mL）與5 mL處理液在37 ℃下氣浴搖床（150 r/min）中培養(yǎng)12 h,以蒸餾水作為空白對照,測定處理前后的菌懸液中電導(dǎo)率。

1.3.6 核酸與蛋白質(zhì)泄漏的測定

將2 mL菌懸液（106CFU/mL）與10 mL處理液混合在37 ℃下氣浴搖床（150 r/min）中培養(yǎng)10 h,以蒸餾水作為空白對照,每隔2 h取樣1 mL,5 478.2×g離心5 min后用紫外-可見分光光度計測定上清液在260 nm[19]和280 nm[20]波長處的OD值。

1.3.7 還原糖釋放的測定

將1 mL菌懸液（106CFU/mL）加入到5 mL處理液中,然后混合8 h并且每隔2 h測試一次。每次測試前,將菌懸液5 478.2×g離心5 min后收集0.5 mL上清液在一根試管中,向試管加入0.5 mL 3,5-二硝基水楊酸后沸水浴5 min。沸水浴后待其冷卻,向試管中加入4 mL蒸餾水,用紫外-可見分光光度計測定其在540 nm波長處的OD值[21]。

1.3.8 呼吸鏈脫氫酶活性的測定

用20 mL蒸餾水將斜面培養(yǎng)的菌體刮下,每根試管分裝2 mL后2 795×g離心10 min,去掉上清液后用生理鹽水清洗,然后與1 mL處理液混合培養(yǎng)1 h。陽性對照組（空白組用無菌水處理）和陰性對照組（用沸水加熱處理20 min殺死菌體）按同樣的操作條件。培養(yǎng)結(jié)束后,菌懸液11 180×g離心15 min并丟棄上清液,沉淀用生理鹽水清洗。然后向每根試管中加入0.9 mL PBS和0.1 mL INT混合后在室溫中避光暗處理1 h。暗處理后用紫外-可見分光光度計測定其在490 nm波長處的OD值[22]。

1.3.9 細(xì)胞形態(tài)觀察

使用透射電子顯微鏡觀察金黃色葡萄球菌細(xì)胞形態(tài)的變化。處理液處理后,菌懸液11 180×g離心10 min丟棄上清液,接著將戊二醛（體積分?jǐn)?shù)2.5%）加入到試管中固定細(xì)胞6 h,固定結(jié)束后用PBS洗滌并11 180×g離心3 min,然后用乙醇溶液梯度洗脫,洗脫完畢后重懸并滴在銅網(wǎng)上,在37 ℃下隔夜干燥后進行觀察。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用OriginPro 9.1軟件對所收集數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和方差分析,并根據(jù)數(shù)據(jù)結(jié)果進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 DMY對金黃色葡萄球菌MIC的確定

由圖1可知,加入DMY處理后的金黃色葡萄球菌生長曲線在前5 h都表現(xiàn)出不同程度的生長遲滯,20 h的生長結(jié)束后對比于經(jīng)DMY處理的其他各組,菌體在600 nm波長處的OD值都有所降低,說明不同質(zhì)量濃度的DMY均對金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出了一定的抑制,并且抑制效果隨著DMY質(zhì)量濃度的增加而增強。當(dāng)所處理的DMY質(zhì)量濃度高于0.625 mg/mL時,600 nm波長處的OD值跳躍式下降并接近于0.2,所以判斷1.25 mg/mL為DMY對于金黃色葡萄球菌的MIC。

圖1 DMY處理后金黃色葡萄球菌600 nm波長處的生長曲線Fig.1 Growth curves of Staphylococcus aureus at 600 nm after DMY treatment

為進一步確定DMY對于金黃色葡萄球菌的MIC,使用傳統(tǒng)的抑菌圈和平板計數(shù)法。抑菌圈實驗結(jié)果顯示,當(dāng)DMY的質(zhì)量濃度低于1.25 mg/mL時在培養(yǎng)基中沒有出現(xiàn)明顯的抑菌圈或不可測量；而從平板的結(jié)果中也可以看出當(dāng)DMY的質(zhì)量濃度低于1.25 mg/mL時培養(yǎng)基上的菌落數(shù)較大,所以結(jié)合生長曲線的結(jié)果確認(rèn)1.25 mg/mL為DMY對金黃色葡萄球菌的MIC,研究發(fā)現(xiàn)DMY對于副溶血性弧菌的MIC為0.625 mg/mL[23],結(jié)合對其他菌的抑制效果研究[24-26],可以看出DMY的抑菌性較強并且為廣譜抑菌。

2.2 DMY-Ag+納米乳液的表征結(jié)果

經(jīng)測定,DMY-Ag+納米乳液表觀性質(zhì)為：pH 6.6、吐溫-80體積分?jǐn)?shù)2%、4 500 r/min離心15 min后無分層或渾濁、粒徑200 nm。納米乳液的pH值偏中性,這對于市面上常見的酸性防腐劑是一個比較好的補充。

DMY-Ag+乳液是穩(wěn)定分散的圓球形液滴（圖2a）、并無團聚,表觀性質(zhì)測定結(jié)果也說明乳液具有很好的離心穩(wěn)定性,這對于解決DMY在水溶液體系中的難溶性問題有很好的啟示作用?？梢钥吹矫恳粋€乳液球滴都是由一個外圈加內(nèi)核的形態(tài)構(gòu)成,推測Ag+在外形成了一層親水層,通過表面活性劑將DMY包埋在內(nèi)層,使DMY穩(wěn)定在水相體系中。乳液微觀形態(tài)模擬圖（圖2b）,與王嘉軍[27]制備的蜂膠-銀離子復(fù)合納米乳劑理論相似。

圖2 納米乳液的透射電子顯微鏡圖與模擬圖Fig.2 Transmittance electron microscopic observation and simulation of nanoemulsion

制備的DMY-Ag+乳液呈乳黃色,經(jīng)過光照或長時間存放后顏色穩(wěn)定（圖3）,而直接螯合的DMY-Ag+配合物則因被氧化由黃色轉(zhuǎn)變成紅棕色,這與Ameen等[28]所制得的DMY介導(dǎo)Ag+配合物現(xiàn)象一致；全波長掃描發(fā)現(xiàn)乳液與DMY、Ag+純物質(zhì)對比并沒有出現(xiàn)新的峰,說明本實驗制備所得乳液并非直接化學(xué)鍵螯合,并且乳液的性質(zhì)要比螯合物穩(wěn)定。

圖3 DMY-Ag 乳液與DMY-Ag 螯合對比Fig.3 Comparison of DMY-Ag＋ emulsion with DMY-Ag＋ chelate

2.3 DMY-Ag+乳液對金黃色葡萄球菌生長曲線的影響

各處理液對于金黃色葡萄球菌的生長情況影響如圖4所示,相對于空白組,各組處理液都表現(xiàn)出比較強的抑制生長情況,前4 h出現(xiàn)了生長遲滯,并且可以看出DMY-Ag+乳液幾乎完全抑制了金黃色葡萄球菌的生長,實驗結(jié)果表明乳液相對于單種抑菌處理液達(dá)到了較好的協(xié)同抑制效果。

圖4 不同處理液處理后金黃色葡萄球菌在600 nm波長處生長曲線Fig.4 Growth curves of Staphylococcus aureus at 600 nm after treatment with different agents

為了進一步確定納米乳液的協(xié)同效果,使用傳統(tǒng)的抑菌圈直徑和平板計數(shù)的方法分析抑菌效果。從抑菌圈直徑可以看出,納米乳液抑菌圈直徑達(dá)到5.25 mm,DMY抑菌圈直徑為4.05 mm,而Ag+處理組與空白組有較多的菌落生長并無清晰可見的抑菌圈。平板計數(shù)結(jié)果的規(guī)律與前面2 種方法所測得的結(jié)果也比較符合,并且納米乳液相對于空白組菌落總數(shù)減少了4.385（lg（CFU/mL））,所以納米乳液達(dá)到很好的協(xié)同作用。

2.4 DMY-Ag+乳液對金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁膜通透性的影響

菌懸液在260 nm以及280 nm波長處的吸收峰在加入處理液后2～6 h增加并在之后保持穩(wěn)定（圖5a、b）,核酸和蛋白質(zhì)釋放的時間關(guān)聯(lián)過程表明有可能是因為細(xì)胞膜的損傷增加導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物的向外泄漏。圖5c、d則進一步確認(rèn)細(xì)胞中的離子與還原糖也在擴散到菌懸液中,因此認(rèn)為這些處理液改變了部分或全部的細(xì)胞壁膜的滲透性質(zhì),使得其失去生物選擇透過的功能,同時根據(jù)內(nèi)容物外泄的程度可以看出DMY-Ag+乳液對于金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁膜破壞最大。熊偉等[29]研究認(rèn)為DMY對于金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁的通透性只有一定的影響,可導(dǎo)致細(xì)胞中的離子等電解質(zhì)小分子泄漏,而不足以導(dǎo)致蛋白質(zhì)等大分子外泄。圖5b也可以印證這一點,DMY處理下的280 nm處的OD值并不高,同時可以看到DMY-Ag+納米乳液處理下的280 nm波長處的OD值較高,即認(rèn)為DMY-Ag+納米乳液對于細(xì)胞壁膜的破壞程度足以導(dǎo)致蛋白質(zhì)等大分子也出現(xiàn)外泄的現(xiàn)象。

圖5 處理液對金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁膜通透性的影響Fig.5 Effects of bacteriostatic agents on cell membrane permeability of Staphylococcus aureus

2.5 DMY-Ag+納米乳液對金黃色葡萄球菌呼吸鏈脫氫酶活性的影響

圖6 不同處理液對金黃色葡萄球菌呼吸鏈脫氫酶活性的影響Fig.6 Effects of bacteriostatic agents on respiratory chain dehydrogenase activity in Staphylococcus aureus

如圖6所示,與陽性對照組相比,各組酶活力都有不同程度的降低。熊偉等[30]研究DMY主要是通過三羧酸循環(huán)途徑來影響菌體的呼吸代謝,而呼吸鏈脫氫酶是三羧酸循環(huán)中的關(guān)鍵酶,如果酶活降低則乙酰輔酶A在第三階段則無法被徹底氧化或者氧化速率降低,即會影響葡萄糖的完全轉(zhuǎn)化,無法完成呼吸代謝和對菌體正常生命活動所需的供能。圖6中DMY-Ag+納米乳液對于脫氫酶活的影響程度比DMY稍強,因此可以看出其對于菌體有氧呼吸的代謝過程也產(chǎn)生了抑制作用。

2.6 DMY-Ag+乳液對金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁膜形態(tài)的影響

圖7 不同抑菌處理液處理后的金黃色葡萄球菌細(xì)胞形態(tài)Fig.7 Cell morphology of Staphylococcus aureus before and after treatment by bacteriostatic agents

由圖7a、b可知,經(jīng)過DMY處理后的金黃色葡萄球菌保持了與空白處理的菌體一樣的外觀形態(tài),而從前面的實驗結(jié)果中,可以看出經(jīng)過DMY處理后菌懸液中的離子濃度、核酸、蛋白質(zhì)含量都有增加,說明細(xì)胞中的這些物質(zhì)在向溶液中擴散,造成這一現(xiàn)象是因為細(xì)胞壁和細(xì)胞膜在與DMY接觸后遭到破壞,導(dǎo)致其喪失了部分或者全部的選擇透過性,使得內(nèi)容物外泄。這可能是因為金黃色葡萄球菌是革蘭氏陽性菌,它的細(xì)胞壁厚且致密,而DMY分子粒徑相對比較大,所以不能直接裂解細(xì)胞壁進入細(xì)胞,只能附著在金黃色葡萄球菌的表面,由于其極強的疏水性引起細(xì)胞膜表面疏水性增加,而改變細(xì)胞壁膜的通透性,使得細(xì)胞內(nèi)容物外泄。由圖7c可知,經(jīng)過Ag+處理的金黃色葡萄球菌菌體形態(tài)破裂,而造成細(xì)胞中物質(zhì)向溶液擴散這一現(xiàn)象是因為帶正電的Ag+可以與細(xì)胞膜上帶負(fù)電的成分產(chǎn)生庫侖力,而牢固吸附在細(xì)胞上,大量的Ag+穿透細(xì)胞壁進入胞內(nèi),破壞了細(xì)胞壁膜的完整性,導(dǎo)致內(nèi)容物外泄,并且Ag+可以與—SH反應(yīng),使蛋白質(zhì)凝固,破壞細(xì)胞一些成分或產(chǎn)生功能障礙。另外有研究表明微量的Ag+在細(xì)胞表面也能起到催化活性中心的作用,激活空氣或者水中的氧,產(chǎn)生羥基自由基及活性氧離子抑制或殺滅細(xì)菌[31-32]。由圖7d可知,經(jīng)過DMY-Ag+納米乳液處理的菌體被改變了原有的形態(tài),而結(jié)合前面的實驗結(jié)果,說明了其也引起了菌體細(xì)胞壁膜通透性的改變,而且要比單獨使用DMY或Ag+處理的效果更強,這可能是因為DMY和Ag+形成了相互協(xié)同作用,加快了對于菌體壁膜的黏附速率以及破壞強度。這些抑菌劑除通過改變菌體細(xì)胞壁膜的結(jié)構(gòu)和功能來實現(xiàn)抑菌以外,另一個非常重要的途徑就是影響細(xì)菌菌體的呼吸代謝。

3 結(jié) 論

DMY是一種來源于天然植物的黃酮類物質(zhì),其本身具有抗氧化、抗菌等生理活性作用,實驗證明DMY對金黃色葡萄球菌的MIC為1.25 mg/mL,說明其具有很好的食品行業(yè)開發(fā)價值,特別是對于海產(chǎn)品、生鮮食品的貯存等,但水難溶性限制了其推廣應(yīng)用。實驗通過制備DMY-Ag+納米乳液使其能夠穩(wěn)定存在于水溶液體系,并且Ag+本身具有廣譜抑菌的性能,因此可以在達(dá)到較好協(xié)同抑菌效果的同時大大降低抑菌劑在食品中的添加量,保證食品的質(zhì)感和安全。通過進一步研究DMY-Ag+納米乳液的抑菌機理,發(fā)現(xiàn)其改變了細(xì)胞壁膜的通透性,并且由于DMY和Ag+的相互協(xié)同作用,加快了對菌體壁膜的黏附速率以及破壞強度。另一方面,乳液也破壞了菌體呼吸代謝中的關(guān)鍵酶活力。關(guān)于乳液抑菌機理的完全闡釋需要更進一步的實驗研究,包括乳液尺寸對于抑菌的影響、作用的具體靶點、對遺傳物質(zhì)的影響等。進一步完善乳液的開發(fā)對于食品的抑菌具有重要意義。