不同方法構(gòu)建大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型的實(shí)驗(yàn)研究

林珊 戴麗冰（通訊作者） 翁春輝 趙向陽(yáng) 郭愛(ài)芳

（1 廣州市紅十字會(huì)醫(yī)院＜暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬?gòu)V州紅十字會(huì)醫(yī)院 廣州市創(chuàng)傷外科研究所＞ 廣東 廣州 510220）

（2 廣東燕嶺醫(yī)院口腔科 廣東 廣州 510507）

（3 廣州市紅十字會(huì)醫(yī)院口腔科＜暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬?gòu)V州紅十字會(huì)醫(yī)院口腔科＞ 廣東 廣州 510220）

牙周炎屬于非常普遍的慢性免疫炎癥性疾病，導(dǎo)致牙齦組織、牙周韌帶和鄰近的支持性牙槽骨逐漸喪失[1-2]。動(dòng)物模型有助于研究牙周炎的發(fā)病機(jī)制及臨床表現(xiàn)的。目前猴子、狗、兔、鼠等動(dòng)物是目前最主要的造模動(dòng)物，但大型動(dòng)物造模受實(shí)驗(yàn)條件和社會(huì)倫理問(wèn)題的限制，在大多數(shù)情況下使用大鼠模型成為牙周病研究的一個(gè)方向[3-4]。革蘭氏陰性細(xì)菌在牙周炎中屬于較為重要的致病菌，而脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）屬于這類(lèi)細(xì)菌重要組成部分，是內(nèi)源性免疫反應(yīng)的重要刺激物[5-6]。因此，一個(gè)簡(jiǎn)單、可復(fù)制的大鼠牙周病模型，為人類(lèi)牙周病的發(fā)病機(jī)制及防治研究有積極的意義。大鼠通常用于實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，因?yàn)槟パ赖难乐芙馄蕝^(qū)與人類(lèi)有一些相似之處[7-8]。本實(shí)驗(yàn)以斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬祝⊿D）大鼠為研究對(duì)象，參照諸多學(xué)者的牙周炎動(dòng)物模型構(gòu)造方法，探討出一種快速構(gòu)建大鼠牙周炎動(dòng)物模型的有效方式。

1.資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、器械

SD 大鼠24 只，雌雄均一半，SPF 級(jí)，體重(198.95±45.85)g，采購(gòu)于南方醫(yī)科大學(xué),10%水合氯醛（上海國(guó)藥集團(tuán)，生產(chǎn)批號(hào)30037517）；乙醇（上海國(guó)藥集團(tuán)，生產(chǎn)批號(hào)801769722）；大腸桿菌O 111：B4 株脂多糖（E-LPS） 購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)L-2630；正畸結(jié)扎絲（上海康橋齒科醫(yī)械廠(chǎng)，生產(chǎn)批號(hào)：120305）；牙周探針（上?？禈?，ALLQX0700）；漢密爾頓注射器10μL。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證證照編號(hào)：SYXK(鄂)2018-0042，均符合動(dòng)物倫理學(xué)認(rèn)可。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將24 只大鼠隨機(jī)分成3 組：健康對(duì)照組、LPS 注射組、正畸結(jié)扎絲組，均8 只。均使用10%水合氯醛(0.3ml/100g,腹腔注射) 麻醉, 對(duì)照組無(wú)需任何干預(yù)。正畸結(jié)扎絲組：正畸結(jié)扎絲大鼠在雙側(cè)上頜第一磨牙置于齦下，在頰側(cè)打結(jié)并滴注LPS 2μl。LPS 注射組在顯微鏡下，于大鼠上頜第一、第二磨牙之間腭側(cè)牙齦注射2μ l。L P S 注射每2 天1 次，持續(xù)2 周。注射過(guò)程中沒(méi)有觀察到組織炎癥或軟組織損傷明顯的跡象。處置結(jié)束等待蘇醒，從實(shí)驗(yàn)日喂食常規(guī)鼠料和水，記錄3 組動(dòng)物活動(dòng)狀態(tài)、飲 食、體重、糞便情況，記錄口腔糜爛及牙周袋形成，記錄其不同之處。在術(shù)后1、4 周斷頸處死各組中的3 只大鼠，均取大鼠雙側(cè)上頜骨，截取5mm×5mm 標(biāo)本，及時(shí)進(jìn)行處理。將標(biāo)本制成頰舌向5μ m 厚的組織切片，蘇木素- 伊紅(H E) 染色，記錄牙周組織情況。

1.3 觀察指標(biāo)

牙齦出血指數(shù)(Sulcus bleeding index，SBI)SBI 評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)采用Mazza（1981）提出的0 ～5 分記分法，0 為牙齦健康；1 為牙齦輕度水腫，探診不出血；2 為僅在探診出呈狀出血[9-10]；3 為出血沿齦緣擴(kuò)展；4 為出血溢出齦緣；5 有自發(fā)出血傾向或潰瘍形成[11]。牙周探診深度(probing depth，PD)用探針輕探實(shí)驗(yàn)牙的牙周袋，2 每個(gè)實(shí)驗(yàn)牙各測(cè)量頰側(cè)、腭側(cè)兩個(gè)位點(diǎn)測(cè)量，取平均[12-13]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2.結(jié)果

2.1 臨床表現(xiàn)

2.1.1 術(shù)后1 周 正畸結(jié)扎絲組大鼠雙側(cè)上頜第一磨牙的結(jié)扎線(xiàn)有3 只脫落,牙齦呈粉紅色，不出血，與對(duì)照組無(wú)差異；剩下5 只大鼠結(jié)扎絲未脫落，其牙齦稍紅腫，探診不出血。LPS 注射組牙齦向冠方腫脹，未出血。

2.1.2 術(shù)后4 周 對(duì)照組與1 周時(shí)已脫落的結(jié)扎絲組，牙齦均為粉紅色，彈性較好；5 只結(jié)扎絲未脫落大鼠牙齦暗紅色，探診袋內(nèi)壁有出血。LPS 注射組牙齦邊緣圓鈍，與牙面未出現(xiàn)貼附，腭側(cè)齦緣黏膜糜爛、壞死，探診后牙齦出血，牙齦退縮達(dá)釉牙骨質(zhì)界以下，牙齦糜爛、牙根面暴露，牙齒I°松動(dòng) ，見(jiàn)圖1-3。

圖1-3 三組大鼠口內(nèi)變化情況

2.2 組織病理學(xué)改變

2.2.1 術(shù)后1 周 對(duì)照組、3 只結(jié)扎絲脫落及5 只結(jié)扎絲未脫落的正畸結(jié)扎絲組的大鼠牙齦結(jié)合上皮為無(wú)角化的鱗狀上皮，牙槽骨表面光滑，未出現(xiàn)骨陷窩及破骨細(xì)胞。LPS 注射組大鼠牙齦結(jié)合上皮釘突增生，纖維結(jié)締組織出現(xiàn)水腫，牙槽骨并未出現(xiàn)變化。

圖4-5 大鼠病理學(xué)變化

2.2.2 術(shù)后4 周 對(duì)照組、3 只結(jié)扎絲脫落大鼠的病理變化與對(duì)照組之間并無(wú)差別。5 只結(jié)扎絲未脫落的正畸結(jié)扎絲組大鼠，與LPS 注射組大鼠，在牙齦組織中結(jié)合上皮向根方增殖、延伸，齦溝壁處出現(xiàn)炎癥，牙周膜膠原變性、降解，但牙周膜間隙寬度增加，牙槽骨出現(xiàn)破壞。牙齦結(jié)合上皮出現(xiàn)加深，出現(xiàn)較深的牙周袋，發(fā)生炎癥細(xì)胞。

2.3 三組間SBI 及PD 值比較

正畸結(jié)扎絲組和LPS 注射組干預(yù)1、4 周后的SBI 和PD 高于對(duì)照組，LPS 注射組干預(yù)1、4 周后的SBI 和PD 高于正畸結(jié)扎絲組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；三組大鼠干預(yù)4 周后的SBI 和PD 高于同期干預(yù)1 周后，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 三組大鼠牙周探診深度比較（±s，mm）

表1 三組大鼠牙周探診深度比較（±s，mm）

注：③與②、①同期各項(xiàng)比較，P ＜0.05；①與②同期比較，P ＜0.05；本組干預(yù)4 周后與1 周時(shí)比較，P ＜0.05。

n SBI PD 1 周 4 周 1 周 4 周正畸結(jié)扎絲組① 8 0.9±0.58 1.9±0.61 0.36±0.03 1.31±0.20 LPS 注射組② 8 1.6±0.52 3.6±0.52 0.87±0.02 1.54±0.30對(duì)照組③ 8 0.3±0.23 0.6±0.78 0.11±0.11 0.13±0.05

3.討論

牙周炎主要是炎性破壞疾病，患者會(huì)合并出現(xiàn)出血、腫脹，包括牙槽骨吸收，形成牙周袋，最后患者牙齒出現(xiàn)脫落與松動(dòng)[14]。牙菌斑是牙周炎的始動(dòng)因子，牙菌斑可通過(guò)脂多糖促進(jìn)骨吸收，而重要細(xì)菌為革蘭陰性細(xì)菌，成為免疫反應(yīng)重要刺激物[15]。

通過(guò)建立牙周炎動(dòng)物模型，記錄牙周炎病因情況，對(duì)致病因子產(chǎn)生良好條件。大鼠屬于嚙齒動(dòng)物，其牙周情況與人類(lèi)較為相似，能夠作為良好的實(shí)驗(yàn)工具，牙周組織與人基本一致，且大鼠價(jià)格較為便宜，實(shí)驗(yàn)成活率較高，有利于在實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行[16]。

關(guān)于實(shí)驗(yàn)性牙周炎動(dòng)物模型建立的方法，早期國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道。目前主要實(shí)施多種方法的聯(lián)合應(yīng)用，縮短實(shí)驗(yàn)性牙周炎動(dòng)物模型建立所需的時(shí)間，建立符合實(shí)驗(yàn)要求的模型標(biāo)本。柴巧學(xué)等[17]、劉紅等[18]報(bào)道采用結(jié)扎法均能成功誘導(dǎo)動(dòng)物牙周病的發(fā)生。王瑢等[19]研究表明單純注射LPS 于大鼠磨牙的牙齦組織，最早在注射7d 后就能發(fā)現(xiàn)牙槽骨喪失。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：LPS注射組的大鼠分別在1、4 周時(shí)表現(xiàn)出牙周炎的發(fā)展的連續(xù)過(guò)程，1 周時(shí)是牙周病早期牙齦炎的表現(xiàn)，是一個(gè)急性滲出性炎癥反應(yīng)；4 周時(shí)，牙齦出現(xiàn)重度急性炎癥反應(yīng)，牙齦上皮紅腫，并能夠觀察到明顯的潰瘍情況，上皮下結(jié)締組織可見(jiàn)大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，膠原變性、破壞，牙槽骨破壞明顯，可見(jiàn)死骨形成，屬于典型的急性重度牙周炎活動(dòng)期的病理表現(xiàn)。

正畸結(jié)扎絲組大鼠在2 周時(shí)有3 只大鼠結(jié)扎線(xiàn)脫落，僅形成牙齦炎的表現(xiàn)，可能是由于大鼠進(jìn)食的食物較粗糙，結(jié)扎期間出現(xiàn)脫落，最終難以形成牙周炎的模型。

本研究采用LPS 注射大鼠上頜磨牙和使用正畸結(jié)扎絲結(jié)扎法均可成功構(gòu)建實(shí)驗(yàn)性牙周炎動(dòng)物模型，操作方法簡(jiǎn)單，可重復(fù)性好。但結(jié)扎絲法有可能因結(jié)扎絲脫落而失敗，而注射法在成功建模的同時(shí)并且可以縮短建模需要的時(shí)間，而且注射部位、劑量等易于控制，缺點(diǎn)在于需要使用微量注射器和較細(xì)的針頭并需要在放大鏡下操作[20]，增加了實(shí)驗(yàn)成本。

綜上所述，建立以上兩種牙周炎模型均可成功建模，但局部注射LPS 方法制備牙周炎動(dòng)物模型更佳。