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    金納米棒免疫層析試紙條定量檢測前列腺特異性抗原

    2020-08-21 17:15張婳李群劉桂鋒
    分析化學(xué) 2020年8期

    張婳 李群 劉桂鋒

    摘 要 建立了一種基于金納米棒(GNR)的免疫層析方法,用于快速定量檢測前列腺特異性抗原(PSA)。以GNR為標(biāo)記探針,通過包裹羧基化的聚合物后,采用共價(jià)偶聯(lián)的方式連接抗PSA單克隆抗體形成偶聯(lián)物,以鼠抗PSA單克隆抗體和羊抗鼠IgG分別噴涂硝酸纖維素膜,形成試紙條的檢測線和質(zhì)控線,采用三明治夾心法構(gòu)建GNR免疫層析試紙條,用于PSA的定量檢測。結(jié)果表明,GNR免疫層析試紙條特異性強(qiáng),穩(wěn)定性好,靈敏度高,對(duì)PSA檢測的線性范圍為0.1~50 ng/mL,檢出限為0.1 ng/mL,批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于10%,且具有良好的保存穩(wěn)定性。本方法可用于檢測血清中PSA的濃度水平,對(duì)于前列腺癌的早期診斷、監(jiān)測治療及預(yù)后判斷具有重要意義。

    關(guān)鍵詞 金納米棒; 免疫層析; 前列腺特異性抗原; 定量檢測

    1 引 言

    前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,占惡性腫瘤男性病死率的第二位,最常用的檢查是前列腺特異性抗原(Prostate specific antigen, PSA)篩查,即測定血清中的PSA濃度水平[1,2]。PSA作為前列腺癌的標(biāo)志物,具有敏感性和特異性強(qiáng)及檢查的無創(chuàng)性等特點(diǎn),在前列腺癌的診斷中發(fā)揮了重要作用。PSA是一種主要由前列腺泡和導(dǎo)管上皮細(xì)胞分泌的單鏈糖蛋白,在功能上屬于類激肽釋放酶的一種絲氨酸蛋白酶,參與精液的液化過程,被分泌入前列腺液或精液中,以有活性的游離形式(f-PSA)存在,而血清中的PSA主要以結(jié)合形式(c-PSA)存在,通常以f-PSA與c-PSA之和代表血清總的PSA水平[3,4]。血清PSA測定的準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定且重復(fù)性好,是常規(guī)臨床用于前列腺良性與惡性疾病診斷及前列腺癌患者術(shù)后跟蹤的重要指標(biāo)。在正常生理?xiàng)l件下,前列腺導(dǎo)管系統(tǒng)與周圍環(huán)境在屏障作用下,血清中僅有微量的PSA; 當(dāng)腫瘤、增生或炎癥發(fā)生時(shí),正常腺管結(jié)構(gòu)遭到破壞,引起血清中PSA濃度升高[5]。血清PSA正常濃度低于4.0 ng/mL; PSA濃度高于10 ng/mL時(shí),患前列腺癌的危險(xiǎn)性增加,需要進(jìn)行前列腺活組織穿刺檢查[6]。檢驗(yàn)血清中PSA的水平有助于前列腺癌的早期診斷、監(jiān)測治療及預(yù)后判斷,對(duì)高危人群,尤其是50歲以上男性前列腺癌的普查具有重要意義。目前已發(fā)展了一系列高靈敏的檢測方法用于PSA的檢測,如電化學(xué)發(fā)光法[7]、表面增強(qiáng)拉曼光譜法[8,9]、比色分析法[10]、光電化學(xué)免疫分析法[11,12]等,但這些方法多需要昂貴的儀器設(shè)備、專業(yè)的操作人員和復(fù)雜的處理過程,且耗時(shí)較長。臨床上對(duì)血清PSA的檢測方法有放射免疫分析法、酶聯(lián)免疫分析法和化學(xué)發(fā)光免疫分析法,其中,放射免疫分析法具有較高的靈敏度、準(zhǔn)確度和精確度,但試劑存在放射性污染,并且標(biāo)記物半衰期短; 酶聯(lián)免疫分析法操作步驟相對(duì)繁瑣,靈敏度有待提高; 化學(xué)發(fā)光免疫分析法雖可實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化檢測,靈敏度高,但發(fā)光強(qiáng)度受環(huán)境因素影響較大,工作曲線隨時(shí)間漂移。因此,有必要發(fā)展一種快速、簡便且靈敏的PSA檢測方法。

    免疫層析技術(shù)是一種簡便、快速的診斷方法,也是現(xiàn)場即時(shí)檢測(Point of care testing, POCT)的重要工具[13~15],最早用于人絨毛膜促性腺激素HCG的檢測,以此作為早期懷孕的診斷依據(jù)。免疫層析技術(shù)主要借助免疫層析試紙條完成,其檢測原理分為雙抗體夾心法和競爭反應(yīng)法,其中,雙抗體夾心法適于檢測大分子物質(zhì)(如腫瘤標(biāo)志物、酶等),而競爭法適于檢測小分子物質(zhì)(如毒素、毒品等)[16,17]。免疫層析技術(shù)不僅操作簡便、檢測快速、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好,而且攜帶方便,已廣泛應(yīng)用于臨床診斷、食品安全、藥物檢測、環(huán)境污染等領(lǐng)域[18~20]。目前,市場上基于免疫層析檢測產(chǎn)品的數(shù)量持續(xù)上升,主要是由于試紙條的各組件價(jià)格低廉,性價(jià)比高,適合現(xiàn)場快速檢測和診斷。近年來,一些納米材料(如量子點(diǎn)、磁納米粒子、上轉(zhuǎn)換納米粒子等)被應(yīng)用于免疫層析檢測研究中[21~23],提高了檢測的靈敏度,并實(shí)現(xiàn)了定量檢測。貴金屬納米粒子,特別是金和銀納米粒子,具有與其自身及外界環(huán)境相關(guān)的局域表面等離子體共振(LSPR)光散射性質(zhì),適于作為光散射分析探針。近年發(fā)展最為成熟的膠體金免疫層析技術(shù),是以膠體金納米顆粒作為免疫標(biāo)記物的一種免疫層析檢測方法,結(jié)果判讀直觀,并且無需任何儀器設(shè)備,因而引起了廣泛關(guān)注[24~26]。盡管膠體金免疫層析技術(shù)具有偶聯(lián)過程簡單、可肉眼直接觀察結(jié)果等優(yōu)點(diǎn),但膠體金通過疏水鍵與蛋白偶聯(lián)形成免疫標(biāo)記探針,其穩(wěn)定性易受環(huán)境中離子濃度和pH值的影響,且膠體金免疫層析試紙條的靈敏度普遍不高,難以實(shí)現(xiàn)定量測定,因此,許多研究工作圍繞著尋找新的標(biāo)記材料而展開。

    相比于球形的膠體金納米粒子,一維金納米棒(GNR)具有獨(dú)特的光學(xué)性能、催化活性強(qiáng)、穩(wěn)定性和生物相容性好等優(yōu)點(diǎn),其消光系數(shù)(~109 L/(mol·cm))高于球形金納米粒子(~108 L/(mol·cm))。由于各向異性的形狀,GNR表現(xiàn)出兩個(gè)LSPR吸收峰(橫向和縱向吸收峰),分別由沿著納米粒子寬端和長端的電子振蕩產(chǎn)生[27],且可通過改變長徑比,使縱向吸收峰位于可見光區(qū)域至近紅外區(qū)域,對(duì)周圍環(huán)境介電性質(zhì)的變化更加敏感[28~30]。因此,GNR用于生物分子檢測時(shí)更靈敏。本研究結(jié)合GNR標(biāo)記技術(shù)和免疫層析技術(shù),構(gòu)建了基于GNR的免疫層析試紙條用于PSA的檢測,建立了一種快速、靈敏的PSA定量檢測技術(shù),為前列腺癌等疾病的篩查及早期診斷提供了新方法。

    2 實(shí)驗(yàn)部分

    2.1 儀器與試劑

    UVmini-1240紫外-可見分光光度計(jì)(日本島津公司); ELAN 9000/DRC電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS,美國Thermo Fisher Scientific公司); HITACHI H-600型透射電子顯微鏡(日本Hitachi公司); Arrayit微陣列掃描儀(美國Telechem公司); 5415R型高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司); Nano-ZS粒度儀(英國Malvern公司); HPC-250CL恒溫恒濕箱(上海申賢恒溫設(shè)備廠); SG-ZKX250真空干燥箱(上海大恒光學(xué)精密機(jī)械有限公司); HM3030 XYZ三維劃膜儀、ZQ2002微電腦斬切機(jī)、GD300滾動(dòng)式手動(dòng)裁紙刀(上海金標(biāo)生物科技公司); 硝酸纖維素膜(NC膜,135 s)、樣品墊(CFSP001700)、結(jié)合墊(GFDX203000)、吸水墊(CFSP223000)及PVC底板(HF000MC100)均購自美國Millipore公司。

    N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、聚丙烯酸鈉(PAA)、HAuCl4·3H2O(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);? NaBH4、AgNO3(北京化工廠); 抗壞血酸(AA,上海藍(lán)季生物); 十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、2-(N-嗎啉)乙磺酸(MES)、牛血清白蛋白(BSA)(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司); PSA、鼠抗PSA單克隆抗體(L1C00401,cAb)、鼠抗PSA單克隆抗體(L1C00402,dAb)、羊抗鼠IgG、AFP、CA125、CA19-9(上海領(lǐng)潮生物科技有限公司); 其它試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)制備的超純水(18.2 MΩ cm)。

    2.2 金納米棒-抗體(GNR-dAb)偶聯(lián)物的制備

    采用種子生長法合成GNR[26],再包裹上PAA后,用于抗體的偶聯(lián),具體步驟如下:取1 mL GNR溶液,與100 μL 1% PAA混合攪拌2 h,9000 r/min離心后,分散于10 mmol/L MES緩沖溶液(pH=7.0)中,加入10 μL 100 mmol/L EDC和10 μL 100 mmol/L NHS活化30 min,再加入10 μg dAb,繼續(xù)反應(yīng)3 h,加入10 μL 10 mg/mL BSA封閉30 min,離心,沉淀重新分散在100 μL 20 mmol/L Tris-HCl(pH=8.0,含1% BSA,0.2 mg/mL NaN3,20%蔗糖和5%海藻糖)中,即得到GNR-dAb偶聯(lián)物。

    2.3 GNR免疫層析試紙條的制備及檢測過程

    將NC膜貼在帶有粘性的PVC底板對(duì)應(yīng)區(qū)域,利用HM3030三維劃膜儀將羊抗鼠IgG(1 mg/mL)和PSA單克隆抗體cAb(1 mg/mL)按1 μL/cm劃線量分別噴涂于NC膜上作為質(zhì)控線(C線)和檢測線(T線),37℃烘干過夜。然后,將樣品墊、結(jié)合墊和吸水墊粘貼在PVC底板相應(yīng)位置,其中樣品墊預(yù)先用處理液(20 mmol/L Tris-HCl, pH=8.0, 0.1% Tween 20, 0.5% PVP)浸泡后,于37℃真空干燥2 h,利用ZQ2002自動(dòng)斬切機(jī)將大板切割成3 mm寬試紙條,室溫干燥,保存?zhèn)溆?。將適量GNR-dAb加到試紙條結(jié)合墊上,37℃干燥0.5 h,將待測樣品滴加到樣品墊上,15 min后觀察結(jié)果,并利用Arrayit微陣列掃描儀采集信號(hào)。

    2.4 GNR免疫層析試紙條靈敏度考察

    分別用0.01 mol/L PBS(pH=7.4)配制濃度為0、0.1、1、5、10、50和100 ng/mL的PSA溶液,滴加至樣品墊上進(jìn)行檢測,15 min后進(jìn)行信號(hào)采集,每個(gè)濃度重復(fù)檢測3次。

    2.5 GNR免疫層析試紙條特異性考察

    分別配制PSA(100 ng/mL)、甲胎蛋白AFP(100 ng/mL)、腫瘤標(biāo)志性糖類抗原CA-125(100 U/mL)和CA-199(100 U/mL)及其混合液,滴加至樣品墊上進(jìn)行檢測,15 min后觀察顯色情況并進(jìn)行信號(hào)采集,每個(gè)樣品重復(fù)檢測3次,判斷試紙條的特異性。

    2.6 GNR免疫層析試紙條性能評(píng)價(jià)

    血清樣本取自吉林大學(xué)第一醫(yī)院某男性病人,無前列腺疾病,患者已知情同意。分別向血清中加入PSA至其終濃度為1、10和50 ng/mL,血清濃度均為20%,將混合溶液滴加到樣品墊上,孵育15 min后進(jìn)行信號(hào)采集,每個(gè)濃度重復(fù)檢測3次,考察試紙條的準(zhǔn)確度和精密度。

    將試紙條密封,于4℃保存不同時(shí)間,分別取出用于PSA的檢測,考察其保存穩(wěn)定性。取同一批次和不同批次的試紙條分別對(duì)不同濃度PSA進(jìn)行檢測,評(píng)價(jià)試紙條的批內(nèi)穩(wěn)定性和批間穩(wěn)定性。

    3 結(jié)果與討論

    3.1 GNR免疫層析試紙條的檢測原理

    采用雙抗體夾心法構(gòu)建GNR免疫層析試紙條的檢測流程如圖1所示。當(dāng)待測樣品中含有PSA時(shí),首先與結(jié)合墊上的GNR-dAb結(jié)合,再層析到NC膜上T線區(qū)域與鼠抗PSA單克隆抗體cAb結(jié)合,形成雙抗體夾心免疫復(fù)合物,T線顯色,其顏色深淺/信號(hào)強(qiáng)度與PSA濃度正相關(guān),未與cAb結(jié)合的偶聯(lián)物繼續(xù)層析至C線區(qū)域,

    與羊抗鼠IgG相結(jié)合而C線顯色,判定為陽性結(jié)果; 反之,當(dāng)待測樣品中不含PSA時(shí),樣品與偶聯(lián)物不反應(yīng),不能被T線上的單克隆抗體捕獲,無法形成夾心,進(jìn)而T線不顯色,僅C線顯色,判定為陰性結(jié)果。若C線不顯色,則檢測無效。反應(yīng)完成后,利用微陣列掃描儀采集信號(hào)并提取相應(yīng)強(qiáng)度值,實(shí)現(xiàn)對(duì)PSA的定量檢測。

    3.2 GNR-dAb偶聯(lián)物的制備及表征

    采用種子生長法制備的GNR為棒狀結(jié)構(gòu)(圖2A),分散性良好,尺寸為(45±3)nmSymboltB@(10±2)nm。圖2B為GNR的吸收光譜圖,在519和743 nm處有兩個(gè)明顯的吸收峰,分別對(duì)應(yīng)GNR橫向和縱向的吸收峰。在GNR表面修飾上dAb后,橫向吸收峰和縱向吸收峰均明顯紅移,分別位移至526 nm和755 nm,這主要是由于連接上抗體后,納米粒子表面的介電性質(zhì)發(fā)生改變,這也表明dAb成功地連接在GNR表面,形成了偶聯(lián)物。

    3.3 GNR免疫層析試紙條的優(yōu)化

    GNR-dAb偶聯(lián)物的用量及待測樣品用量均會(huì)影響GNR試紙條檢測的靈敏度。分別將4、6、8、10 μL GNR-dAb滴加至結(jié)合墊上,在樣品墊上滴加60 μL 100 ng/mL PSA溶液進(jìn)行檢測,從圖3可見,隨著GNR-dAb偶聯(lián)物體積的增加,信噪比(S/N,目標(biāo)物T線信號(hào)強(qiáng)度與空白T線信號(hào)強(qiáng)度的比值)逐漸增大,當(dāng)體積為8 μL時(shí)達(dá)到最大。繼續(xù)增加偶聯(lián)物體積,S/N反而下降,可能是由于偶聯(lián)物數(shù)量過多,大量分布在NC膜上,導(dǎo)致背景信號(hào)過高,影響定量檢測的準(zhǔn)確性。選擇GNR-dAb偶聯(lián)物的用量為8 μL。在試紙條樣品墊上分別滴加40、60、80和100 μL PSA溶液(50 ng/mL)的進(jìn)行檢測。當(dāng)在樣品墊上滴加40 μL樣品時(shí),由于結(jié)合墊上偶聯(lián)物未能完全釋放,C線和T線上信號(hào)都很微弱; 滴加100 μL樣品時(shí),由于大量溶液停滯在NC膜上,未能向吸水墊遷移,主要是由于液體量超過了吸水墊的吸收能力; 只有使用60和80 μL樣品量時(shí),偶聯(lián)物很好地被釋放且沿著NC膜順利遷移至吸水墊,C線和T線均顯示出較強(qiáng)的信號(hào)??紤]到樣品的消耗量,選擇60 μL為樣品檢測的最佳體積。

    3.4 GNR免疫層析試紙條檢測PSA的靈敏度

    在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下,利用構(gòu)建的GNR免疫層析試紙條分別對(duì)不同濃度的 PSA溶液進(jìn)行檢測,觀察顯色情況并采集信號(hào),結(jié)果如圖4所示。T線顏色隨PSA濃度的增加而逐漸加深,S/N值隨著PSA濃度的增加而增大,且在0.1~50 ng/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性,線性方程為y=0.064x+3.349(R2=0.994)。當(dāng)PSA濃度低于0.1 ng/mL時(shí),微陣列掃描儀采集不到T線信號(hào)強(qiáng)度值,因此對(duì)PSA檢測的檢出限為0.1 ng/mL。與臨床常用酶聯(lián)免疫分析方法和化學(xué)發(fā)光免疫分析方法相比,GNR免疫層析試紙條操作簡便,檢測快速(僅需15 min),且不需昂貴的設(shè)備及專業(yè)的操作的人員,適合于現(xiàn)場檢測。

    3.5 GNR免疫層析試紙條的特異性

    利用GNR試紙條分別對(duì)PSA、AFP、CA-125、CA-199,及其混合液進(jìn)行檢測,由圖5可見,只有滴加PSA和含PSA的混合液的試紙條均出現(xiàn)明顯的T線和C線,而滴加AFP、CA-125和CA-199的試紙條只出現(xiàn)C線,表明此試紙條與其它蛋白沒有交叉反應(yīng),對(duì)PSA檢測具有較好的特異性。此外,為了考察構(gòu)建的GNR試紙條用于血清檢測時(shí)樣品基質(zhì)的抗干擾特性,對(duì)10%胎牛血清(FBS)進(jìn)行了檢測,也僅出現(xiàn)C線而無T線,表明FBS中成分對(duì)GNR試紙條檢測無影響。

    3.6 GNR免疫層析試紙條性能評(píng)價(jià)

    采用GNR免疫層析試紙條進(jìn)行血清樣品的檢測。在血清樣本中添加不同濃度的PSA,利用GNR免疫層析試紙條進(jìn)行檢測,結(jié)果如表1所示,加標(biāo)回收率在97.9%~113.1%之間, RSD在2.2%~5.9%之間,表明GNR免疫層析試紙條檢測血清中的PSA具有良好的回收率及準(zhǔn)確度,可用于快速、靈敏地定量檢測血清中PSA。

    將GNR免疫層析試紙條密封,于4℃保存一定時(shí)間后,分別對(duì)5和50 ng/mL PSA溶液進(jìn)行檢測,由圖6可見,60天內(nèi)信號(hào)值未發(fā)生明顯的變化,說明GNR免疫層析試紙條在4℃條件下保存穩(wěn)定性良好。

    此外,考察了同一批次和不同批次的試紙條分別對(duì)5和50 ng/mL PSA溶液檢測結(jié)果,由表2可知,批內(nèi)和批間變異系數(shù)(Coefficient of variation, CV)均小于10%。以上結(jié)果表明,本方法具有較好的準(zhǔn)確性和精確度。

    4 結(jié) 論

    構(gòu)建了一種基于GNR的免疫層析試紙條用于PSA的快速定量檢測,此試紙條具有靈敏度高、特異性強(qiáng)和穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。以GNR作為標(biāo)記探針,抗體通過共價(jià)鍵結(jié)合在GNR表面形成的偶聯(lián)物具有更好的穩(wěn)定性。GNR免疫層析試紙條可實(shí)現(xiàn)直觀可視的判讀結(jié)果,也可利用GNR優(yōu)異的LSPR光散射信號(hào)實(shí)現(xiàn)定量檢測。對(duì)PSA的檢出限為0.1 ng/mL, 線性范圍為0.1~50.0 ng/mL,批間和批內(nèi)變異系數(shù)均小于10%,在15 min即可完成檢測,適合于即時(shí)、快速檢測。本方法具有高的靈敏度、準(zhǔn)確性、可靠性和穩(wěn)定性,檢測時(shí)間短,具有良好的實(shí)用價(jià)值和應(yīng)用前景。

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    Gold Nanorods-based Immunochromatographic Strip for Rapid

    and Quantitative Detection of Prostate Specific Antigen

    ZHANG Hua2, LI Qun1, LIU Gui-Feng*1

    1(Department of Radiology, China-Japan Union Hospital of Jilin University, Changchun 130033, China)

    2(State Key Laboratory of Electroanalytical Chemistry, Changchun Institute of Applied Chemistry,

    Chinese Academy of Sciences, Changchun 130022, China)

    Abstract A gold nanorod (GNR)-based immunochromatographic strip was developed for rapid and quantitative detection of prostate specific antigen (PSA). GNR was used as the labeled probe and coated with sodium polyacrylate. Then the anti-PSA monoclonal antibody (dAb) was immobilized on the surface of GNR through covalent attachment to form the GNR-dAb conjugates. The mouse anti-PSA monoclonal antibody and the goat anti-mouse IgG were sprayed onto the nitrocellulose membrane as test line and control line, respectively. The resultant GNR-dAb conjugates were introduced to construct the immunochromatographic strip for the quantitative detection of PSA by a sandwich method. The proposed GNR-based immunochromatographic strip exhibited good specificity, high stability and high sensitivity. The experimental results indicated that GNR-based immunochromatographic strip showed a good linear range from 0.1 ng/mL to 50 ng/mL with a limit of detection of 0.1 ng/mL, and the relative standard deviation was less than 10%. The established assay could be successfully applied for PSA detection in serum, which was beneficial for early diagnosis, treatment and prognosis of prostate cancer.

    Keywords Gold nanorod; Immunochromatography; Prostate specific antigen; Quantitative detection

    (Received 14 March 2020; accepted 20 May 2020)

    This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No.61901438).

    2020-03-14收稿; 2020-05-20接受

    本文系國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No. 61901438)資助

    * E-mail: gfliu@jlu.edu.cn

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