金納米棒免疫層析試紙條定量檢測前列腺特異性抗原

張婳　李群　劉桂鋒

摘 要 建立了一種基于金納米棒（GNR）的免疫層析方法，用于快速定量檢測前列腺特異性抗原（PSA）。以GNR為標(biāo)記探針，通過包裹羧基化的聚合物后，采用共價(jià)偶聯(lián)的方式連接抗PSA單克隆抗體形成偶聯(lián)物，以鼠抗PSA單克隆抗體和羊抗鼠IgG分別噴涂硝酸纖維素膜，形成試紙條的檢測線和質(zhì)控線，采用三明治夾心法構(gòu)建GNR免疫層析試紙條，用于PSA的定量檢測。結(jié)果表明，GNR免疫層析試紙條特異性強(qiáng)，穩(wěn)定性好，靈敏度高，對(duì)PSA檢測的線性范圍為0.1～50 ng/mL，檢出限為0.1 ng/mL，批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于10%，且具有良好的保存穩(wěn)定性。本方法可用于檢測血清中PSA的濃度水平，對(duì)于前列腺癌的早期診斷、監(jiān)測治療及預(yù)后判斷具有重要意義。

關(guān)鍵詞 金納米棒; 免疫層析; 前列腺特異性抗原; 定量檢測

1 引 言

前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，占惡性腫瘤男性病死率的第二位，最常用的檢查是前列腺特異性抗原（Prostate specific antigen， PSA）篩查，即測定血清中的PSA濃度水平[1，2]。PSA作為前列腺癌的標(biāo)志物，具有敏感性和特異性強(qiáng)及檢查的無創(chuàng)性等特點(diǎn)，在前列腺癌的診斷中發(fā)揮了重要作用。PSA是一種主要由前列腺泡和導(dǎo)管上皮細(xì)胞分泌的單鏈糖蛋白，在功能上屬于類激肽釋放酶的一種絲氨酸蛋白酶，參與精液的液化過程，被分泌入前列腺液或精液中，以有活性的游離形式（f-PSA）存在，而血清中的PSA主要以結(jié)合形式（c-PSA）存在，通常以f-PSA與c-PSA之和代表血清總的PSA水平[3，4]。血清PSA測定的準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定且重復(fù)性好，是常規(guī)臨床用于前列腺良性與惡性疾病診斷及前列腺癌患者術(shù)后跟蹤的重要指標(biāo)。在正常生理?xiàng)l件下，前列腺導(dǎo)管系統(tǒng)與周圍環(huán)境在屏障作用下，血清中僅有微量的PSA; 當(dāng)腫瘤、增生或炎癥發(fā)生時(shí)，正常腺管結(jié)構(gòu)遭到破壞，引起血清中PSA濃度升高[5]。血清PSA正常濃度低于4.0 ng/mL; PSA濃度高于10 ng/mL時(shí)，患前列腺癌的危險(xiǎn)性增加，需要進(jìn)行前列腺活組織穿刺檢查[6]。檢驗(yàn)血清中PSA的水平有助于前列腺癌的早期診斷、監(jiān)測治療及預(yù)后判斷，對(duì)高危人群，尤其是50歲以上男性前列腺癌的普查具有重要意義。目前已發(fā)展了一系列高靈敏的檢測方法用于PSA的檢測，如電化學(xué)發(fā)光法[7]、表面增強(qiáng)拉曼光譜法[8，9]、比色分析法[10]、光電化學(xué)免疫分析法[11，12]等，但這些方法多需要昂貴的儀器設(shè)備、專業(yè)的操作人員和復(fù)雜的處理過程，且耗時(shí)較長。臨床上對(duì)血清PSA的檢測方法有放射免疫分析法、酶聯(lián)免疫分析法和化學(xué)發(fā)光免疫分析法，其中，放射免疫分析法具有較高的靈敏度、準(zhǔn)確度和精確度，但試劑存在放射性污染，并且標(biāo)記物半衰期短; 酶聯(lián)免疫分析法操作步驟相對(duì)繁瑣，靈敏度有待提高; 化學(xué)發(fā)光免疫分析法雖可實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化檢測，靈敏度高，但發(fā)光強(qiáng)度受環(huán)境因素影響較大，工作曲線隨時(shí)間漂移。因此，有必要發(fā)展一種快速、簡便且靈敏的PSA檢測方法。

免疫層析技術(shù)是一種簡便、快速的診斷方法，也是現(xiàn)場即時(shí)檢測（Point of care testing， POCT）的重要工具[13～15]，最早用于人絨毛膜促性腺激素HCG的檢測，以此作為早期懷孕的診斷依據(jù)。免疫層析技術(shù)主要借助免疫層析試紙條完成，其檢測原理分為雙抗體夾心法和競爭反應(yīng)法，其中，雙抗體夾心法適于檢測大分子物質(zhì)（如腫瘤標(biāo)志物、酶等），而競爭法適于檢測小分子物質(zhì)（如毒素、毒品等）[16，17]。免疫層析技術(shù)不僅操作簡便、檢測快速、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好，而且攜帶方便，已廣泛應(yīng)用于臨床診斷、食品安全、藥物檢測、環(huán)境污染等領(lǐng)域[18～20]。目前，市場上基于免疫層析檢測產(chǎn)品的數(shù)量持續(xù)上升，主要是由于試紙條的各組件價(jià)格低廉，性價(jià)比高，適合現(xiàn)場快速檢測和診斷。近年來，一些納米材料（如量子點(diǎn)、磁納米粒子、上轉(zhuǎn)換納米粒子等）被應(yīng)用于免疫層析檢測研究中[21～23]，提高了檢測的靈敏度，并實(shí)現(xiàn)了定量檢測。貴金屬納米粒子，特別是金和銀納米粒子，具有與其自身及外界環(huán)境相關(guān)的局域表面等離子體共振（LSPR）光散射性質(zhì)，適于作為光散射分析探針。近年發(fā)展最為成熟的膠體金免疫層析技術(shù)，是以膠體金納米顆粒作為免疫標(biāo)記物的一種免疫層析檢測方法，結(jié)果判讀直觀，并且無需任何儀器設(shè)備，因而引起了廣泛關(guān)注[24～26]。盡管膠體金免疫層析技術(shù)具有偶聯(lián)過程簡單、可肉眼直接觀察結(jié)果等優(yōu)點(diǎn)，但膠體金通過疏水鍵與蛋白偶聯(lián)形成免疫標(biāo)記探針，其穩(wěn)定性易受環(huán)境中離子濃度和pH值的影響，且膠體金免疫層析試紙條的靈敏度普遍不高，難以實(shí)現(xiàn)定量測定，因此，許多研究工作圍繞著尋找新的標(biāo)記材料而展開。

相比于球形的膠體金納米粒子，一維金納米棒（GNR）具有獨(dú)特的光學(xué)性能、催化活性強(qiáng)、穩(wěn)定性和生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)，其消光系數(shù)（～109 L/（mol·cm））高于球形金納米粒子（～108 L/（mol·cm））。由于各向異性的形狀，GNR表現(xiàn)出兩個(gè)LSPR吸收峰（橫向和縱向吸收峰），分別由沿著納米粒子寬端和長端的電子振蕩產(chǎn)生[27]，且可通過改變長徑比，使縱向吸收峰位于可見光區(qū)域至近紅外區(qū)域，對(duì)周圍環(huán)境介電性質(zhì)的變化更加敏感[28～30]。因此，GNR用于生物分子檢測時(shí)更靈敏。本研究結(jié)合GNR標(biāo)記技術(shù)和免疫層析技術(shù)，構(gòu)建了基于GNR的免疫層析試紙條用于PSA的檢測，建立了一種快速、靈敏的PSA定量檢測技術(shù)，為前列腺癌等疾病的篩查及早期診斷提供了新方法。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

UVmini-1240紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津公司）; ELAN 9000/DRC電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS，美國Thermo Fisher Scientific公司）; HITACHI H-600型透射電子顯微鏡（日本Hitachi公司）; Arrayit微陣列掃描儀（美國Telechem公司）; 5415R型高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司）; Nano-ZS粒度儀（英國Malvern公司）; HPC-250CL恒溫恒濕箱（上海申賢恒溫設(shè)備廠）; SG-ZKX250真空干燥箱（上海大恒光學(xué)精密機(jī)械有限公司）; HM3030 XYZ三維劃膜儀、ZQ2002微電腦斬切機(jī)、GD300滾動(dòng)式手動(dòng)裁紙刀（上海金標(biāo)生物科技公司）; 硝酸纖維素膜（NC膜，135 s）、樣品墊（CFSP001700）、結(jié)合墊（GFDX203000）、吸水墊（CFSP223000）及PVC底板（HF000MC100）均購自美國Millipore公司。

N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、聚丙烯酸鈉（PAA）、HAuCl4·3H2O（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）;? NaBH4、AgNO3（北京化工廠）; 抗壞血酸（AA，上海藍(lán)季生物）; 十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、2-（N-嗎啉）乙磺酸（MES）、牛血清白蛋白（BSA）（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司）; PSA、鼠抗PSA單克隆抗體（L1C00401，cAb）、鼠抗PSA單克隆抗體（L1C00402，dAb）、羊抗鼠IgG、AFP、CA125、CA19-9（上海領(lǐng)潮生物科技有限公司）; 其它試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）制備的超純水（18.2 MΩ cm）。

2.2 金納米棒-抗體（GNR-dAb）偶聯(lián)物的制備

采用種子生長法合成GNR[26]，再包裹上PAA后，用于抗體的偶聯(lián)，具體步驟如下：取1 mL GNR溶液，與100 μL 1% PAA混合攪拌2 h，9000 r/min離心后，分散于10 mmol/L MES緩沖溶液（pH=7.0）中，加入10 μL 100 mmol/L EDC和10 μL 100 mmol/L NHS活化30 min，再加入10 μg dAb，繼續(xù)反應(yīng)3 h，加入10 μL 10 mg/mL BSA封閉30 min，離心，沉淀重新分散在100 μL 20 mmol/L Tris-HCl（pH=8.0，含1% BSA，0.2 mg/mL NaN3，20%蔗糖和5%海藻糖）中，即得到GNR-dAb偶聯(lián)物。

2.3 GNR免疫層析試紙條的制備及檢測過程

將NC膜貼在帶有粘性的PVC底板對(duì)應(yīng)區(qū)域，利用HM3030三維劃膜儀將羊抗鼠IgG（1 mg/mL）和PSA單克隆抗體cAb（1 mg/mL）按1 μL/cm劃線量分別噴涂于NC膜上作為質(zhì)控線（C線）和檢測線（T線），37℃烘干過夜。然后，將樣品墊、結(jié)合墊和吸水墊粘貼在PVC底板相應(yīng)位置，其中樣品墊預(yù)先用處理液（20 mmol/L Tris-HCl， pH=8.0， 0.1% Tween 20， 0.5% PVP）浸泡后，于37℃真空干燥2 h，利用ZQ2002自動(dòng)斬切機(jī)將大板切割成3 mm寬試紙條，室溫干燥，保存?zhèn)溆?。將適量GNR-dAb加到試紙條結(jié)合墊上，37℃干燥0.5 h，將待測樣品滴加到樣品墊上，15 min后觀察結(jié)果，并利用Arrayit微陣列掃描儀采集信號(hào)。

2.4 GNR免疫層析試紙條靈敏度考察

分別用0.01 mol/L PBS（pH=7.4）配制濃度為0、0.1、1、5、10、50和100 ng/mL的PSA溶液，滴加至樣品墊上進(jìn)行檢測，15 min后進(jìn)行信號(hào)采集，每個(gè)濃度重復(fù)檢測3次。

2.5 GNR免疫層析試紙條特異性考察

分別配制PSA（100 ng/mL）、甲胎蛋白AFP（100 ng/mL）、腫瘤標(biāo)志性糖類抗原CA-125（100 U/mL）和CA-199（100 U/mL）及其混合液，滴加至樣品墊上進(jìn)行檢測，15 min后觀察顯色情況并進(jìn)行信號(hào)采集，每個(gè)樣品重復(fù)檢測3次，判斷試紙條的特異性。

2.6 GNR免疫層析試紙條性能評(píng)價(jià)

血清樣本取自吉林大學(xué)第一醫(yī)院某男性病人，無前列腺疾病，患者已知情同意。分別向血清中加入PSA至其終濃度為1、10和50 ng/mL，血清濃度均為20%，將混合溶液滴加到樣品墊上，孵育15 min后進(jìn)行信號(hào)采集，每個(gè)濃度重復(fù)檢測3次，考察試紙條的準(zhǔn)確度和精密度。

將試紙條密封，于4℃保存不同時(shí)間，分別取出用于PSA的檢測，考察其保存穩(wěn)定性。取同一批次和不同批次的試紙條分別對(duì)不同濃度PSA進(jìn)行檢測，評(píng)價(jià)試紙條的批內(nèi)穩(wěn)定性和批間穩(wěn)定性。

3 結(jié)果與討論

3.1 GNR免疫層析試紙條的檢測原理

采用雙抗體夾心法構(gòu)建GNR免疫層析試紙條的檢測流程如圖1所示。當(dāng)待測樣品中含有PSA時(shí)，首先與結(jié)合墊上的GNR-dAb結(jié)合，再層析到NC膜上T線區(qū)域與鼠抗PSA單克隆抗體cAb結(jié)合，形成雙抗體夾心免疫復(fù)合物，T線顯色，其顏色深淺/信號(hào)強(qiáng)度與PSA濃度正相關(guān)，未與cAb結(jié)合的偶聯(lián)物繼續(xù)層析至C線區(qū)域，

與羊抗鼠IgG相結(jié)合而C線顯色，判定為陽性結(jié)果; 反之，當(dāng)待測樣品中不含PSA時(shí)，樣品與偶聯(lián)物不反應(yīng)，不能被T線上的單克隆抗體捕獲，無法形成夾心，進(jìn)而T線不顯色，僅C線顯色，判定為陰性結(jié)果。若C線不顯色，則檢測無效。反應(yīng)完成后，利用微陣列掃描儀采集信號(hào)并提取相應(yīng)強(qiáng)度值，實(shí)現(xiàn)對(duì)PSA的定量檢測。

3.2 GNR-dAb偶聯(lián)物的制備及表征

采用種子生長法制備的GNR為棒狀結(jié)構(gòu)（圖2A），分散性良好，尺寸為（45±3）nmSymboltB@（10±2）nm。圖2B為GNR的吸收光譜圖，在519和743 nm處有兩個(gè)明顯的吸收峰，分別對(duì)應(yīng)GNR橫向和縱向的吸收峰。在GNR表面修飾上dAb后，橫向吸收峰和縱向吸收峰均明顯紅移，分別位移至526 nm和755 nm，這主要是由于連接上抗體后，納米粒子表面的介電性質(zhì)發(fā)生改變，這也表明dAb成功地連接在GNR表面，形成了偶聯(lián)物。

3.3 GNR免疫層析試紙條的優(yōu)化

GNR-dAb偶聯(lián)物的用量及待測樣品用量均會(huì)影響GNR試紙條檢測的靈敏度。分別將4、6、8、10 μL GNR-dAb滴加至結(jié)合墊上，在樣品墊上滴加60 μL 100 ng/mL PSA溶液進(jìn)行檢測，從圖3可見，隨著GNR-dAb偶聯(lián)物體積的增加，信噪比（S/N，目標(biāo)物T線信號(hào)強(qiáng)度與空白T線信號(hào)強(qiáng)度的比值）逐漸增大，當(dāng)體積為8 μL時(shí)達(dá)到最大。繼續(xù)增加偶聯(lián)物體積，S/N反而下降，可能是由于偶聯(lián)物數(shù)量過多，大量分布在NC膜上，導(dǎo)致背景信號(hào)過高，影響定量檢測的準(zhǔn)確性。選擇GNR-dAb偶聯(lián)物的用量為8 μL。在試紙條樣品墊上分別滴加40、60、80和100 μL PSA溶液（50 ng/mL）的進(jìn)行檢測。當(dāng)在樣品墊上滴加40 μL樣品時(shí)，由于結(jié)合墊上偶聯(lián)物未能完全釋放，C線和T線上信號(hào)都很微弱; 滴加100 μL樣品時(shí)，由于大量溶液停滯在NC膜上，未能向吸水墊遷移，主要是由于液體量超過了吸水墊的吸收能力; 只有使用60和80 μL樣品量時(shí)，偶聯(lián)物很好地被釋放且沿著NC膜順利遷移至吸水墊，C線和T線均顯示出較強(qiáng)的信號(hào)?？紤]到樣品的消耗量，選擇60 μL為樣品檢測的最佳體積。

3.4 GNR免疫層析試紙條檢測PSA的靈敏度

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，利用構(gòu)建的GNR免疫層析試紙條分別對(duì)不同濃度的 PSA溶液進(jìn)行檢測，觀察顯色情況并采集信號(hào)，結(jié)果如圖4所示。T線顏色隨PSA濃度的增加而逐漸加深，S/N值隨著PSA濃度的增加而增大，且在0.1～50 ng/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性，線性方程為y=0.064x+3.349（R2=0.994）。當(dāng)PSA濃度低于0.1 ng/mL時(shí)，微陣列掃描儀采集不到T線信號(hào)強(qiáng)度值，因此對(duì)PSA檢測的檢出限為0.1 ng/mL。與臨床常用酶聯(lián)免疫分析方法和化學(xué)發(fā)光免疫分析方法相比，GNR免疫層析試紙條操作簡便，檢測快速（僅需15 min），且不需昂貴的設(shè)備及專業(yè)的操作的人員，適合于現(xiàn)場檢測。

3.5 GNR免疫層析試紙條的特異性

利用GNR試紙條分別對(duì)PSA、AFP、CA-125、CA-199，及其混合液進(jìn)行檢測，由圖5可見，只有滴加PSA和含PSA的混合液的試紙條均出現(xiàn)明顯的T線和C線，而滴加AFP、CA-125和CA-199的試紙條只出現(xiàn)C線，表明此試紙條與其它蛋白沒有交叉反應(yīng)，對(duì)PSA檢測具有較好的特異性。此外，為了考察構(gòu)建的GNR試紙條用于血清檢測時(shí)樣品基質(zhì)的抗干擾特性，對(duì)10%胎牛血清（FBS）進(jìn)行了檢測，也僅出現(xiàn)C線而無T線，表明FBS中成分對(duì)GNR試紙條檢測無影響。

3.6 GNR免疫層析試紙條性能評(píng)價(jià)

采用GNR免疫層析試紙條進(jìn)行血清樣品的檢測。在血清樣本中添加不同濃度的PSA，利用GNR免疫層析試紙條進(jìn)行檢測，結(jié)果如表1所示，加標(biāo)回收率在97.9%～113.1%之間， RSD在2.2%～5.9%之間，表明GNR免疫層析試紙條檢測血清中的PSA具有良好的回收率及準(zhǔn)確度，可用于快速、靈敏地定量檢測血清中PSA。

將GNR免疫層析試紙條密封，于4℃保存一定時(shí)間后，分別對(duì)5和50 ng/mL PSA溶液進(jìn)行檢測，由圖6可見，60天內(nèi)信號(hào)值未發(fā)生明顯的變化，說明GNR免疫層析試紙條在4℃條件下保存穩(wěn)定性良好。

此外，考察了同一批次和不同批次的試紙條分別對(duì)5和50 ng/mL PSA溶液檢測結(jié)果，由表2可知，批內(nèi)和批間變異系數(shù)（Coefficient of variation， CV）均小于10%。以上結(jié)果表明，本方法具有較好的準(zhǔn)確性和精確度。

4 結(jié) 論

構(gòu)建了一種基于GNR的免疫層析試紙條用于PSA的快速定量檢測，此試紙條具有靈敏度高、特異性強(qiáng)和穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。以GNR作為標(biāo)記探針，抗體通過共價(jià)鍵結(jié)合在GNR表面形成的偶聯(lián)物具有更好的穩(wěn)定性。GNR免疫層析試紙條可實(shí)現(xiàn)直觀可視的判讀結(jié)果，也可利用GNR優(yōu)異的LSPR光散射信號(hào)實(shí)現(xiàn)定量檢測。對(duì)PSA的檢出限為0.1 ng/mL， 線性范圍為0.1～50.0 ng/mL，批間和批內(nèi)變異系數(shù)均小于10%，在15 min即可完成檢測，適合于即時(shí)、快速檢測。本方法具有高的靈敏度、準(zhǔn)確性、可靠性和穩(wěn)定性，檢測時(shí)間短，具有良好的實(shí)用價(jià)值和應(yīng)用前景。

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Gold Nanorods-based Immunochromatographic Strip for Rapid

and Quantitative Detection of Prostate Specific Antigen

ZHANG Hua2， LI Qun1， LIU Gui-Feng*1

1（Department of Radiology， China-Japan Union Hospital of Jilin University， Changchun 130033， China）

2（State Key Laboratory of Electroanalytical Chemistry， Changchun Institute of Applied Chemistry，

Chinese Academy of Sciences， Changchun 130022， China）

Abstract A gold nanorod （GNR）-based immunochromatographic strip was developed for rapid and quantitative detection of prostate specific antigen （PSA）. GNR was used as the labeled probe and coated with sodium polyacrylate. Then the anti-PSA monoclonal antibody （dAb） was immobilized on the surface of GNR through covalent attachment to form the GNR-dAb conjugates. The mouse anti-PSA monoclonal antibody and the goat anti-mouse IgG were sprayed onto the nitrocellulose membrane as test line and control line， respectively. The resultant GNR-dAb conjugates were introduced to construct the immunochromatographic strip for the quantitative detection of PSA by a sandwich method. The proposed GNR-based immunochromatographic strip exhibited good specificity， high stability and high sensitivity. The experimental results indicated that GNR-based immunochromatographic strip showed a good linear range from 0.1 ng/mL to 50 ng/mL with a limit of detection of 0.1 ng/mL， and the relative standard deviation was less than 10%. The established assay could be successfully applied for PSA detection in serum， which was beneficial for early diagnosis， treatment and prognosis of prostate cancer.

Keywords Gold nanorod; Immunochromatography; Prostate specific antigen; Quantitative detection

（Received 14 March 2020; accepted 20 May 2020）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No.61901438）.

2020-03-14收稿; 2020-05-20接受

本文系國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No. 61901438）資助

* E-mail： gfliu@jlu.edu.cn