CCNB2作為潛在生物標志物在腎透明細胞癌組織中的表達及臨床意義

李伯全 康勝虎 王蕊

中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第983醫(yī)院泌尿外科，天津300142

0 引言

腎細胞癌（腎癌）是常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，其約占成人癌癥病例的3%[1-2]。統(tǒng)計結果顯示，每年約有20.9萬新發(fā)腎癌病例和10.2萬因腎癌死亡病例[3]，其中初診即被診斷為轉移性腎癌的患者約占30%。一旦腎癌進入轉移期，其治療就非常困難，因此這類患者的5年生存率普遍較低[4-5]。

腎透明細胞癌約占所有腎癌的80%，其對放射治療（放療）和化學治療（化療）均不敏感[6]，手術治療仍然是其主要治療手段，但手術后的復發(fā)率約33%[7]。因此，有必要針對腎透明細胞癌的基因靶點展開研究，以便為腎透明細胞癌的靶向治療提供依據(jù)。

細胞周期蛋白 B2（cyclin B2，CCNB2）與 CCNB1均為細胞周期蛋白B族的重要成員，在調(diào)節(jié)細胞周期方面發(fā)揮重要作用[8]。CCNB1和CCNB2在不同分裂期細胞定位方面存在很大差異：在分裂間期，CCNB1定位于微粒體，CCNB2則定位于高爾基體；在分裂期，CCNB1定位于細胞核，CCNB2則分散在細胞中[9-10]。多項研究結果表明，CCNB2參與腫瘤的進展。因此，對CCNB2開展研究有望揭示腫瘤發(fā)病的一些分子機制[11]。CCNB2參與很多腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，如非小細胞肺癌、乳腺癌等[11-12]，其中患者的CCNB2表達水平明顯升高[13-14]。

目前，關于CCNB2在腎透明細胞癌發(fā)展中的相關功能和分子機制的研究較少，本研究中主要研究腎透明細胞癌患者CCNB2的mRNA在腫瘤組織與癌旁正常組織中的表達，分析CCNB2與腎透明細胞癌患者的臨床病理特征之間的關系，并研究CCNB2蛋白表達水平與腎透明細胞癌患者的預后生存之間的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2010年10月至2019年12月，中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第983醫(yī)院泌尿外科收治的經(jīng)手術治療的腎透明細胞癌患者98例。其中，男性54例，女性44例，年齡（53.2±9.8）歲。全部病例均經(jīng)過臨床病理證實，并具有完整的病例資料。收集患者的腫瘤組織和相應的癌旁正常組織樣本。臨床病理特征包括患者性別、年齡、腫瘤分期、腫瘤分級、腫瘤大小。根據(jù)AJCC-TNM-2010分類系統(tǒng)和WHO/ISUP-2016系統(tǒng)分別評估腫瘤分期和分級[15-16]。本研究以1964年赫爾辛基宣言和隨后所有修訂案中規(guī)定的道德標準為基礎，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 主要材料與儀器

山羊血清封閉液、免疫組化二抗試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司），3，3'-二氨基聯(lián)苯胺（3，3'-diaminobenzidine，DAB）（美國 Cell Signaling Technology公司）。

RM2235型石蠟切片機（德國Leica公司），BX51型顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

1.2.2 免疫組織化學檢測

所有的組織切片經(jīng)福爾馬林固定，石蠟包埋，4℃切片保存。將組織切片放入60℃的烘箱中30 min；然后將切片先后浸入二甲苯罐處理3次，每次10 min；梯度乙醇溶液水化處理5次，每次5 min；將處理過的切片用蒸餾水沖洗5 min，然后用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌 5 min，重復2次；將切片浸泡在體積分數(shù)為3%的H2O2溶液中10 min；PBS洗滌3次；將切片放入修復液，煮沸至120℃，5 min后冷卻至室溫，以修復抗原；將山羊血清滴加到組織塊上，室溫封閉50 min；根據(jù)切片上組織的大小加入一抗，室溫孵育1 h；PBS洗滌4次，每次5 min；吸取適量二抗滴加于組織切片上，孵育40 min；PBS洗滌4次，每次5 min；滴加鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶（streptavidin-perosidase，SP）后，孵育 40 min；PBS 沖洗 4 次，每次 5 min；滴加DAB顯色液，顯色3 min，沖洗，并用適量蘇木精復染；將組織切片用梯度乙醇溶液處理（80%、11 s，90%、11 s，100%、6 min、100%、6 min）；將切片浸入二甲苯中處理3次，每次5 min；用中性樹膠進行封片，晾干；用顯微鏡觀察并采集圖像。

組織中出現(xiàn)棕黃色顆粒，則認為該組織為陽性染色，隨機選取5個不同的視野，依照陽性細胞著色面積及強度進行評定。陽性細胞著色面積評分標準：陽性細胞著色面積＜10%，記0分；著色面積在10%～25%時，記1分；著色面積在26%～75%時，記2分；著色面積＞75%時，記3分。陽性染色強度評分標準：陰性染色記0分；弱陽性染色記1分；中陽性染色記2分；強陽性染色記3分。以陽性細胞著色面積評分和染色強度評分之和判斷表達情況，結果＜5分，為低表達；結果≥5分，為高表達。

1.2.3 臨床樣本生物信息學分析

通過基因表達譜交互分析（gene expression profiling interactive analysis，GEPIA）數(shù)據(jù)庫獲取臨床樣本615例，其中包括515例腎透明細胞癌組織樣本和100例癌旁正常組織樣本。通過GEPIA數(shù)據(jù)庫分析CCNB2的mRNA在腎透明細胞癌組織和癌旁正常組織中的差異。數(shù)據(jù)庫的網(wǎng)址為http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php?gene=CCNB2。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS13.0軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料采用均值±標準差（Mean±SD）表示；組間比較采用學生t檢驗；利用χ2檢驗分析臨床病理特征與蛋白表達的關系；生存分析采用Kaplan-Meier法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 生物信息學分析結果

為了更好地闡明CCNB2在腎透明細胞癌組織中的作用，通過GPEIA分析CCNB2的mRNA在腎透明細胞癌組織和正常組織中的表達情況，共分析腎透明細胞癌組織515例及正常組織100例。結果表明，CCNB2的mRNA在腎透明細胞癌組織中顯著高表達（圖1），表明CCNB2參與腎透明細胞癌的發(fā)展。為了進一步研究CCNB2的表達與腎透明細胞癌患者長期預后的關系，利用Kaplan-Meier曲線分析了CCNB2在腎透明細胞癌患者預后中的作用。結果表明，CCNB2表達較低的患者中，總生存率和無病生存率都較高（圖2A和圖2B）。結果提示，CCNB2的表達與腎透明細胞癌患者的生存期具有顯著的相關性，提示CCNB2的異常表達可能與腎透明細胞癌患者的不良預后相關（圖2）。

2.2 CCNB2在腎透明細胞癌組織中的表達

免疫組化結果顯示，CCNB2在腎透明細胞癌組織中高表達（圖3A），而在癌旁正常組織中CCNB2的表達顯著降低（圖3B），這表明CCNB2可能影響腎透明細胞癌的生長和發(fā)展。根據(jù)染色強度，將腎透明細胞癌患者分為CCNB2高表達組和CCNB2低表達組。

2.3 CCNB2蛋白表達水平與腎透明細胞癌患者的臨床病理特征的相關性

為了闡明CCNB2在腎透明細胞癌進展中的作用，分析比較了CCNB2高表達組和CCNB2低表達組患者的臨床病理特征差異，包括年齡、性別、腫瘤分期、腫瘤分化程度、腫瘤體積。分析結果表明，CCNB2表達水平與腫瘤分期（P=0.039）和腫瘤大?。≒=0.001）顯著相關，而與年齡（P＞0.05）、性別（P＞0.05）、腫瘤分級（P＞0.05）的相關性無統(tǒng)計學意義。（表 1）

3 討論

腎細胞癌僅次于膀胱癌，是發(fā)病率第二位的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，其中80%以上病例為腎透明細胞癌[17-18]。目前，手術作為腎透明細胞癌的主要治療手段，其復發(fā)率高，且存在很大的局限性。因此，為了開展針對腎透明細胞癌的靶向治療，有必要進對腎透明細胞癌的相關作用蛋白展開研究[19-20]。

圖1 腎透明細胞癌組織中細胞周期蛋白B2（CCNB2）的mRNA表達

圖2 細胞周期蛋白B2表達與腎透明細胞癌患者生存率的相關性

圖3 腎透明細胞癌組織和癌旁正常組織中CCNB2的免疫組化結果

表1 CCNB2蛋白表達與腎透明細胞癌患者臨床病理特征的相關性分析

CCNB1主要通過G2/M過渡發(fā)揮作用，其通過觸發(fā)蛋白質磷酸化來調(diào)控有絲分裂早期活動，還可通過調(diào)節(jié)染色體分離酶的活動在有絲分裂后期發(fā)揮作用[21-22]。而CCNB2參與多種腫瘤的發(fā)展進程，在非小細胞肺癌、乳腺癌、結直腸癌等多種癌癥中有重要作用[23-24]。但目前，CCNB2在腎透明細胞癌中的作用機制及臨床預后等方面尚不清楚。本研究中，通過GEPIA數(shù)據(jù)庫分析了515例腎透明細胞癌組織樣本和100例癌旁正常組織樣本。結果表明，與癌旁正常組織相比，腎透明細胞癌組織CCNB2的mRNA表達水平明顯升高。

Shubbar等[25]的研究結果表明CCNB2表達水平越高，乳腺癌患者的生存期越短，且通過多因素分析證實了胞漿中CCNB2蛋白表達水平是患者生存期的獨立預后因素。Takashima等[11]則發(fā)現(xiàn)肺癌患者的生存期與CCNB2的mRNA表達水平呈明顯的負相關關系。本研究的結果顯示，對于腎透明細胞癌患者，CCNB2表達程度越高，其總生存率和無病生存率越低。

對CCNB2蛋白與腎透明細胞癌患者的臨床病理特征的分析結果表明，CCNB2表達水平與腫瘤分期、腫瘤大小顯著相關（均P＜0.05），但與性別、年齡、腫瘤分級無關（均P＞0.05）。提示可采用CCNB2表達量來預測腫瘤的惡性程度。

綜上，CCNB2參與腎透明細胞癌的發(fā)展進程，且在腫瘤發(fā)展中扮演十分重要的作用。CCNB2高表達，則預示腎透明細胞癌患者的不良預后，且其與腫瘤分期、腫瘤大小有關?？梢哉J為，CCNB2有望成為腎透明細胞癌診斷、治療及預后的潛在靶點。下一步，將通過動物實驗來深入探討CCNB2在腎透明細胞癌發(fā)展、轉移等方面的分子機制。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突