活絡(luò)效靈丹通過激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號通路降低青光眼兔視神經(jīng)損傷的研究※

歐陽云 劉正立 徐春龍 吳加亮 彭 俊 彭清華

(江蘇省鹽城市中醫(yī)院眼科，江蘇 鹽城 224000)

青光眼是眼科臨床最常見的不可逆致盲性眼部疾病，以病理性高眼壓導(dǎo)致的視神經(jīng)損傷為主要特點，以視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡及視野特征性缺損為共同特征。目前全球有超過7 000萬人受青光眼疾病的困擾，其中約10%雙眼致盲，占失明病例的12%[1]。隨著年齡增長，青光眼發(fā)病率、致盲率顯著增加[2]。目前，青光眼的發(fā)病機制尚未完全清楚，研究認(rèn)為局部缺血、氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)引發(fā)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡和視神經(jīng)軸退化是青光眼的重要發(fā)病機制[3-4]。眼壓升高是青光眼公認(rèn)的危險因素，因此治療的主要措施是采取降眼壓藥物，或?qū)嵤V過手術(shù)以降低眼壓。但是，僅采取降低眼壓的治療措施并不能完全阻止視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡和視神經(jīng)的萎縮，進而導(dǎo)致很大一部分患者視力持續(xù)受損，甚至喪失視力。因此，有效的藥物保護視神經(jīng)是青光眼治療的重要方向。

本實驗通過單眼前房內(nèi)灌注法建立兔青光眼模型，予活絡(luò)效靈丹治療，觀察其降低眼壓、保護視神經(jīng)的作用，并通過比較治療前后凋亡蛋白活性半胱天冬酶3(cleaved-caspase-3)、活性半胱天冬酶9(cleaved-caspase-9)、B細(xì)胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)、B細(xì)胞淋巴瘤因子2相關(guān)X蛋白(Bax)和B細(xì)胞淋巴瘤因子2相關(guān)XL蛋白(Bcl-xl)表達變化，以及磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路的狀態(tài)，探討活絡(luò)效靈丹治療青光眼的作用機制，為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康成年新西蘭長耳兔36只，體質(zhì)量2.5～3 kg，雌雄各半。購自南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場，動物合格證號：SCXK(蘇)2017-0001。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度20～25 ℃，濕度40%，自由飲食、飲水，每日光照12 h。

1.1.2 實驗藥物及試劑 活絡(luò)效靈丹藥物組成：當(dāng)歸15 g，丹參15 g，制乳香15 g，制沒藥15 g。上藥用10倍量水浸泡30 min，武火煮沸后文火煎10 min，用2層紗布過濾，將過濾液濃縮，最終含生藥濃度0.15 g/mL，使用微孔孔徑0.22 μm尼龍濾膜過濾，分別濃縮至0.2、0.6、1.8 g/mL生藥濃度，分裝于50 mL的一次性離心管中，于4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?%戊巴比妥鈉溶液[默克化工技術(shù)(上海)有限公司]；注射用鼠神經(jīng)生長因子[舒泰神(北京)生物制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字S20060023]；3%復(fù)合卡波姆溶液(北京索萊寶科技有限公司)；原位末端標(biāo)記(TUNEL)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒[內(nèi)含蛋白酶K工作液、TUNEL反應(yīng)混合液、末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶(TDT酶)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)溶液等](美國Biovision公司)；蘇木素—伊紅(HE)染色試劑盒(內(nèi)含蘇木素染液、分化液、伊紅染液)[北京索萊寶科技有限公司]；蛋白定量試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)；cleaved-caspase-3抗體、cleaved-caspase-9抗體、Bcl-2抗體、Bax抗體、Bcl-xl抗體、PI3K抗體、Akt抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體(英國Abcam公司)；化學(xué)發(fā)光液(美國Biosciences公司)；鹽酸莫西沙星滴眼液(美國Alcon Laboratories公司，進口藥品注冊證號H20180089)；硫酸慶大霉素溶液(北京索萊寶科技有限公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS)[生工生物工程(上海)股份有限公司]；中性福爾馬林固定液(北京索萊寶科技有限公司)；二甲苯溶液[生工生物工程(上海)股份有限公司]；4×蛋白上樣緩沖液、含吐溫-20的磷酸鹽緩沖液(PBST)(北京索萊寶科技有限公司)。

1.1.3 實驗儀器 眼科手術(shù)顯微鏡、眼科彎鑷、眼科彎剪(蘇州六六視覺科技股份有限公司)；病理切片機(德國Leica公司)；筆式眼壓計(美國Mentor公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 將36只兔按照隨機數(shù)字表法分為6組，即空白組、模型組、對照組及活絡(luò)效靈丹低、中、高劑量組，各6只。

1.2.2 模型制備 實驗前將兔在正常條件下飼養(yǎng)1周，以熟悉環(huán)境。造模方法：兔耳緣靜脈注射1%戊巴比妥鈉溶液3 mL/kg麻醉，對兔右眼進行手術(shù)制備青光眼模型。除空白組外，其余各組行前房穿刺，抽出房水0.1 mL，緩慢灌注3%復(fù)合卡波姆溶液0.1 mL，空白組注射等容積的0.9%氯化鈉注射液，術(shù)后統(tǒng)一予鹽酸莫西沙星滴眼液1滴滴術(shù)眼，每日3次，連續(xù)用藥4 d。術(shù)后檢測眼壓，發(fā)現(xiàn)兔眼壓持續(xù)升高，>24 mmHg(1 mmHg≈0.133 kPa)，證明模型制備成功。

1.2.3 給藥方法 造模成功后持續(xù)用藥4周?？瞻捉M、模型組予0.9%氯化鈉注射液5 mL/(kg·d)灌胃，每日1次；對照組予注射用鼠神經(jīng)生長因子1.635 μg/kg肌肉注射，每日1次；活絡(luò)效靈丹低、中、高劑量組分別予活絡(luò)效靈丹1.0、3.0、9.0 g/(kg·d)灌胃，根據(jù)臨床成人用藥劑量的1、3、9倍計算，藥物用蒸餾水溶解。

1.3 觀察指標(biāo)及方法

1.3.1 眼壓測量 分別于給藥1、2、4周測量兔右眼眼壓(1 mmHg≈0.133 kPa)。應(yīng)用筆式眼壓計進行眼壓測量，均在固定時間10:00進行，每只兔重復(fù)6次，取平均值并記錄，測量完成后用鹽酸莫西沙星滴眼液滴眼。

1.3.2 視網(wǎng)膜獲取及切片制備 給藥結(jié)束后通過空氣栓塞法處死兔，摘取眼球，使用冰PBS沖洗后，置于中性福爾馬林固定液中固定30 min。將固定好的眼球取出，吸干表面殘留的中性福爾馬林固定液后，沿角膜緣剪開，將角膜、晶狀體、玻璃體去除后，剝離視網(wǎng)膜并繼續(xù)置于中性福爾馬林固定液中固定2 h。使用梯度乙醇(分別為85%、95%、無水乙醇)脫水，用二甲苯溶液透明組織，石蠟塊包埋，切片完成后置于-20 ℃冷凍保存。

1.3.3 HE染色 將石蠟切片取出，置于二甲苯溶液，浸洗2次，每次5 min，脫蠟，依次浸泡于梯度乙醇(分別為100%、95%、85%、70%)，每個濃度浸泡3 min脫水。使用蘇木素染液染色10 min后，PBS洗去多余染料，置于分化液分色5 min，再使用伊紅染色5 min，依次浸泡于梯度乙醇(分別為無水乙醇、95%、85%、70%)，每個濃度浸泡3 min，用二甲苯溶液透明組織，樹脂膠封片后即可置于400倍光學(xué)顯微鏡下，觀察染色情況。每組隨機取2張切片，每個切片選5個視野，使用Image pro plus軟件讀取5個視野中視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量，并取其均值。

1.3.4 TUNEL檢測 將石蠟切片取出，置于二甲苯溶液，潤洗2次，每次5 min，脫蠟，依次浸泡于梯度乙醇(分別為100%、95%、85%、70%),每個濃度浸泡3 min脫水。PBS潤洗2次，用蛋白酶K工作液處理組織，37 ℃處理15 min后滴加TUNEL反應(yīng)混合液，37 ℃暗室反應(yīng)1 h。PBS潤洗2次后放入3%過氧化氫(H2O2)溶液中，室溫孵育15 min，TDT酶37 ℃連接1 h；辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體37 ℃標(biāo)記30 min；潤洗后滴加DAB溶液50 μL，蘇木素染液染色25 s，再次使用梯度乙醇(分別為85%、95%、無水乙醇)脫水，用二甲苯溶液透明組織，樹脂膠封片后即可置于400倍光學(xué)顯微鏡下，觀察染色情況。切片底色為白色，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡陽性細(xì)胞核呈淺褐色。每組隨機取2張切片，每個切片選5個視野，使用Image pro plus軟件讀取5個視野中的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡陽性細(xì)胞數(shù)，并取其均值，細(xì)胞凋亡率=凋亡陽性細(xì)胞數(shù)/視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.3.5 免疫印跡(Western Blot)檢測 將視網(wǎng)膜充分剪碎后置于冰上勻漿，加入適量裂解液處理30 min，12 000 r/min，4 ℃離心10 min，取其上清為蛋白溶液，然后用蛋白定量試劑盒對樣品蛋白溶液進行定量。樣品加入4×蛋白上樣緩沖液后取20 μL加入上樣槽，按照濃縮膠50 V、分離膠100 V電壓進行電泳。電泳完成后進行轉(zhuǎn)膜，按照濾紙、凝膠、硝酸纖維素膜、濾紙的順序依次放置，恒流200 mA轉(zhuǎn)膜2 h。轉(zhuǎn)膜完成的硝酸纖維素膜放入3%脫脂乳中封閉后即可孵育一抗、二抗，一抗于4 ℃過夜孵育，二抗于室溫孵育1 h。經(jīng)PBST(PBS+TWeen-20)洗滌3～5次后使用化學(xué)發(fā)光法，在硝酸纖維素膜上滴加化學(xué)發(fā)光液，置于暗箱中曝光。用Imag J圖像處理軟件進行灰度分析，用目標(biāo)蛋白與對應(yīng)的內(nèi)參(GAPDH)的比值，得出目標(biāo)蛋白的表達量。

2 結(jié) 果

2.1 各組兔右眼給藥1、2、4周眼壓比較 見表1。

由表1可見，給藥1、2、4周，模型組兔右眼眼壓均高于空白組(P<0.05)。給藥1周，對照組、活絡(luò)效靈丹高劑量組兔右眼眼壓高于模型組(P<0.05)；給藥2、4周，對照組及活絡(luò)效靈丹低、中、高劑量組兔右眼眼壓均低于模型組(P<0.05)。給藥1周，活絡(luò)效靈丹低、中劑量組兔右眼眼壓低于對照組(P<0.05)；給藥2、4周，活絡(luò)效靈丹低、中劑量組兔右眼眼壓高于對照組(P<0.05)。給藥1、2、4周，對照組與活絡(luò)效靈丹高劑量組兔右眼眼壓比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。給藥1周，活絡(luò)效靈丹低、中、高劑量組兔右眼眼壓比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；給藥2、4周，活絡(luò)效靈丹低、中、高劑量組兔右眼眼壓組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組兔右眼給藥1、2、4周眼壓比較

2.2 各組兔視網(wǎng)膜組織HE染色比較 空白組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)保留完整且排列整齊，層次分明，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞呈橢圓形；模型組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)發(fā)生斷裂，厚度明顯變薄，間質(zhì)出現(xiàn)水腫，且神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量減少，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則；對照組與空白組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)形態(tài)相近；活絡(luò)效靈丹低劑量組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)較模型組稍有改善；活絡(luò)效靈丹中、高劑量組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)基本正常，層次較為分明，僅活絡(luò)效靈丹中劑量組部分視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變。見封3，圖1。

2.3 各組兔視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量比較 見表2。

表2 各組兔視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量比較

個

由表2可見，模型組兔視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量低于空白組(P<0.05)。對照組及活絡(luò)效靈丹中、高劑量組兔視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量高于模型組(P<0.05)?；罱j(luò)效靈丹低劑量組兔視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量低于對照組(P<0.05)。對照組與活絡(luò)效靈丹中、高劑量組兔視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)?；罱j(luò)效靈丹中、高劑量組兔視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量均高于活絡(luò)效靈丹低劑量組(P<0.05)；活絡(luò)效靈丹中劑量組與活絡(luò)效靈丹高劑量組兔視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 各組兔視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡率比較 見表3。

表3 各組兔視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡率比較

由表3可見，模型組兔視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡率高于空白組(P<0.05)；對照組及活絡(luò)效靈丹中、高劑量組兔視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡率均低于模型組(P<0.05)；活絡(luò)效靈丹低、中、高劑量組兔視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡率均高于對照組(P<0.05)；活絡(luò)效靈丹低、中、高劑量組兔視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡率組間兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。各組兔視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡表達見封3，圖2。

2.5 各組兔視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡蛋白表達水平比較 見表4。

表4 各組兔視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡蛋白表達水平比較

由表4可見，模型組cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9、Bax表達水平均高于空白組(P<0.05)，Bcl-2、Bcl-xl表達水平均低于空白組(P<0.05)；對照組及活絡(luò)效靈丹低、中、高劑量組cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9、Bax表達水平均低于模型組(P<0.05)，Bcl-2、Bcl-xl表達水平均高于模型組(P<0.05)；活絡(luò)效靈丹低、中、高劑量組cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9、Bax表達水平均高于對照組(P<0.05)，Bcl-2、Bcl-xl表達水平均低于對照組(P<0.05)；活絡(luò)效靈丹高劑量組cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9、Bax表達水平均低于活絡(luò)效靈丹低、中劑量組(P<0.05)，Bcl-2、Bcl-xl表達水平均高于活絡(luò)效靈丹低、中劑量組(P<0.05)。對照組cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9、Bcl-2、Bcl-xl、Bax與空白組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。各組兔視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡蛋白表達條帶圖見圖3。

注：①空白組；②模型組；③對照組；④活絡(luò)效靈丹低劑量組；⑤活絡(luò)效靈丹中劑量組；⑥活絡(luò)效靈丹高劑量組

2.6 各組兔PI3K/Akt信號通路蛋白表達水平比較 見表5。

表5 各組兔PI3K/Akt信號通路蛋白表達水平比較

由表5可見，模型組PI3K、Akt蛋白表達水平均低于空白組(P<0.05)；對照組、活絡(luò)效靈丹高劑量組PI3K蛋白表達水平均高于模型組(P<0.05)，對照組及活絡(luò)效靈丹中、高劑量組Akt蛋白表達水平均高于模型組(P<0.05)?；罱j(luò)效靈丹低、中劑量組PI3K、Akt蛋白表達水平均低于對照組(P<0.05)?；罱j(luò)效靈丹高劑量組PI3K、Akt蛋白表達水平均高于活絡(luò)效靈丹低、中劑量組(P<0.05)；活絡(luò)效靈丹高劑量組PI3K、Akt蛋白表達水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。各組兔PI3K/Akt信號通路蛋白表達條帶圖見圖4。

注：①空白組；②模型組；③對照組；④活絡(luò)效靈丹低劑量組；⑤活絡(luò)效靈丹中劑量組；⑥活絡(luò)效靈丹高劑量組

3 討 論

目前，青光眼的發(fā)病機制尚未完全清楚，但視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡和視神經(jīng)軸退化對青光眼的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要。臨床治療青光眼主要以降低并維持正常眼壓為目的，包括激光、藥物及手術(shù)等[5-6]。許多青光眼患者眼壓雖已降至正常范圍，但視野損害依然持續(xù)[7]，因此單純降低眼壓的治療手段并不能真正有效地改善青光眼所造成的損傷，更重要的是阻止視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡和視神經(jīng)萎縮，最大程度地保護現(xiàn)有的視力、視野。

中醫(yī)學(xué)對青光眼的認(rèn)識最早可追溯至《神農(nóng)本草經(jīng)》中“青盲”這一病癥?！睹貍餮劭讫埬菊摗穼⑶喙庋蹥w屬于“五風(fēng)內(nèi)障”，并根據(jù)發(fā)病原因、臨床特征、預(yù)后分為“綠風(fēng)”“黑風(fēng)”“青風(fēng)”“烏風(fēng)”及“黃風(fēng)”5種內(nèi)障?！夺t(yī)宗金鑒》提出五風(fēng)內(nèi)障治療應(yīng)以祛風(fēng)散熱、益精明目為主，《審視瑤函》提出“補肝滋腎，瞳仁乃固”。我們認(rèn)為，青光眼由風(fēng)、火、痰所致，脈絡(luò)瘀滯，脈絡(luò)阻塞致神水流出，積聚于眼內(nèi)，又加重脈絡(luò)瘀滯，互為因果，形成惡性循環(huán)。治宜理氣活血，化瘀通絡(luò)?；罱j(luò)效靈丹出自張錫純《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》，最初用于治療各種瘀血阻滯之痛，現(xiàn)用于治療各種氣血瘀滯、經(jīng)絡(luò)受阻類疾病。方中當(dāng)歸、丹參補血活血；制乳香、制沒藥辛溫通散，活血行氣。現(xiàn)代藥理研究表明，丹參提取物能改善微循環(huán)，改善視網(wǎng)膜神經(jīng)元間的物質(zhì)傳遞與運輸，從而提高視網(wǎng)膜血管和神經(jīng)的耐缺氧能力，改善青光眼缺血性視神經(jīng)病變的缺血、缺氧狀況[8-10]；當(dāng)歸提取物能有效降低大鼠眼壓及視網(wǎng)膜組織丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)水平，清除活性氧自由基[11]；乳香能抑制白細(xì)胞介素1(IL-1)介導(dǎo)的兔視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞遷移及核因子κB(NF-κB)核轉(zhuǎn)移[12-13]。

本實驗以復(fù)合卡波姆溶液前房注射造成的青光眼兔為研究對象，觀察活絡(luò)效靈丹對青光眼的治療效果。神經(jīng)生長因子是一種重要的神經(jīng)生長調(diào)節(jié)因子，對神經(jīng)細(xì)胞的生長、發(fā)育及再生有重要的調(diào)節(jié)作用，青光眼視神經(jīng)中神經(jīng)生長因子和神經(jīng)生長因子受體蛋白表達下降，神經(jīng)生長因子注射液能阻止或延緩視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷，改善青光眼癥狀及預(yù)后。此外，神經(jīng)生長因子是具有營養(yǎng)神經(jīng)元和促進軸突生長雙重生物學(xué)功能的神經(jīng)細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子，可有效減少急性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡，因此本實驗以神經(jīng)生長因子注射液為陽性藥物對照。

因為復(fù)合卡波姆溶液誘發(fā)的兔青光眼模型能長時間引起眼壓中度、穩(wěn)步升高[14]，本研究成功建立了兔青光眼模型。首先需檢測活絡(luò)效靈丹給藥前后模型兔眼壓變化。結(jié)果顯示在模型建立成功4周后，模型組兔依然保持較高眼壓，活絡(luò)效靈丹組青光眼兔眼壓下降，并表現(xiàn)出劑量依賴性，證明活絡(luò)效靈丹具有降低復(fù)合卡波姆溶液造成的高眼壓癥狀。

通過各組兔視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量比較發(fā)現(xiàn)，對照組及活絡(luò)效靈丹中、高劑量組均高于模型組(P<0.05)；各組兔視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡率比較，對照組及活絡(luò)效靈丹中、高劑量組凋亡率均低于模型組(P<0.05)，活絡(luò)效靈丹中、高劑量組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡率與劑量成反比。說明注射用鼠神經(jīng)生長因子和活絡(luò)效靈丹高劑量組均具有抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的作用，且作用效果相似。

視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡導(dǎo)致的視神經(jīng)細(xì)胞丟失是青光眼重要的發(fā)生發(fā)展機制。青光眼通常伴隨視網(wǎng)膜細(xì)胞Bcl-xl、Bax、cleaved-caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白的下調(diào)或上調(diào)，通過抑制凋亡蛋白cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9、Bax能延緩視神經(jīng)細(xì)胞損失。本實驗進一步TUNEL染色和凋亡相關(guān)蛋白表達水平檢測證實，抗凋亡因子Bcl-2、Bcl-xl的表達在空白組中最高，在模型組中表達急劇下降，促凋亡因子Bax、cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9、Bax則正好相反。在活絡(luò)效靈丹低、中、高劑量組中Bcl-2、Bcl-xl的表達較模型組上升(P<0.05)，cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9、Bax的表達較模型組下降(P<0.05)，且在高劑量組中效果最佳。對照組的表達趨勢一直與空白組相似。說明活絡(luò)效靈丹和注射用鼠神經(jīng)生長因子能有效抑制細(xì)胞凋亡，活絡(luò)效靈丹在一定程度上延緩視神經(jīng)細(xì)胞損傷，抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡，以此保護青光眼兔視力，其中活絡(luò)效靈丹高劑量組效果優(yōu)于低、中劑量組。

PI3K能通過催化其底物磷脂酰肌醇的肌醇環(huán)發(fā)生磷酸化的方式，激活細(xì)胞中酶級聯(lián)反應(yīng)，調(diào)控各種不同細(xì)胞功能，包括代謝、生長、增殖、存活、轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)合成，是生命活動的重要調(diào)節(jié)信號分子。Akt是PI3K信號通路下游的重要組成成分，是一種絲氨酸、蘇氨酸蛋白激酶，與蛋白激酶A、蛋白激酶C的蛋白序列高度相似。Akt的氨基端有一個普列克底物蛋白同源物樣域，能特異性結(jié)合底物的絲氨酸、蘇氨酸殘基，并使之磷酸化，這是Akt蛋白傳導(dǎo)信號并介導(dǎo)信號分子間相互作用的主要方式。PI3K能催化Akt第308位蘇氨酸及第473位絲氨酸發(fā)生磷酸化，從而介導(dǎo)后續(xù)的信號傳遞，調(diào)控核糖體、線粒體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞系發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡等作用。有研究報道PI3K/Akt信號通路參與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分化中神經(jīng)突的生長，并且PI3K/Akt信號通路的激活在缺氧引起的視神經(jīng)損傷模型中起到保護視神經(jīng)的作用[15]。為進一步研究活絡(luò)效靈丹降低青光眼兔視神經(jīng)損傷的分子機制，我們對PI3K/Akt信號通路的蛋白表達水平進行了檢測。結(jié)果：對照組、活絡(luò)效靈丹高劑量組PI3K、Akt蛋白表達水平均高于模型組(P<0.05)，說明注射用鼠神經(jīng)生長因子和活絡(luò)效靈丹高劑量組激活PI3K/Akt信號通路，從而抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡，保護視力。故活絡(luò)效靈丹可能通過激活PI3K/Akt信號通路，從而抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡，保護視力。

綜上所述，活絡(luò)效靈丹能降低復(fù)合卡波姆溶液誘發(fā)的青光眼兔眼壓，降低視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡率，從而抑制視網(wǎng)膜損傷，PI3K/Akt信號通路激活可能是活絡(luò)效靈丹治療青光眼的分子機制。