配合飼料和冰鮮餌料對擬穴青蟹養(yǎng)殖的影響

周 凡，彭 建，陳麗芝，線 婷，王芳芳，王 政，陳劉浦，貝亦江，阮贇杰，丁雪燕*

(1.浙江省水產(chǎn)技術推廣總站，浙江 杭州 310023；2.浙江省三門縣水產(chǎn)技術推廣站，浙江 三門 317100；3.浙江大學新農(nóng)村發(fā)展研究院，浙江 杭州 310058)

青蟹，隸屬于甲殼綱、十足目、梭子蟹科，青蟹屬；因其肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富，兼有滋補強身功效，素有“海上人參”之稱[1-2]。據(jù)《2019年中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒》，全國青蟹養(yǎng)殖產(chǎn)量達15.77×104t，主要分布在廣東(6.06×104t)、福建(3.63×104t)、浙江(2.54×104t)、廣西(1.95×104t)、海南(1.38×104t)等沿海省份[3]，是重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟蟹類。傳統(tǒng)青蟹養(yǎng)殖基本是投喂冰鮮餌料，這種粗放型“以魚養(yǎng)蟹”的模式對海洋漁業(yè)資源和環(huán)境影響較大，且冰鮮餌料常攜帶寄生蟲和病菌，易導致水體污染和病害暴發(fā)，造成養(yǎng)殖效益不穩(wěn)定。因此，在青蟹養(yǎng)殖中示范與推廣使用配合飼料，對于推動青蟹養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展和轉(zhuǎn)型升級具有重要意義。

本試驗選擇浙江沿海養(yǎng)殖的擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)及池塘蟹-蝦-貝的混養(yǎng)模式[4]，對比分析了配合飼料和冰鮮餌料對擬穴青蟹肌肉營養(yǎng)組成、消化酶活性、水質(zhì)指標、環(huán)境微生物菌以及養(yǎng)殖效益的影響，旨在為配合飼料在青蟹養(yǎng)殖業(yè)中的推廣應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗對象與飼料

養(yǎng)殖試驗在浙江省三門縣金嶼水產(chǎn)養(yǎng)殖專業(yè)合作社進行。選取養(yǎng)殖池塘2口，其中一口池塘投喂冰鮮餌料(1.2 hm2)，設為對照塘，另一口池塘投喂青蟹膨化配合飼料(0.8 hm2)，設為試驗塘。青蟹膨化配合飼料由寧波天邦股份有限公司生產(chǎn)，基本營養(yǎng)組成為粗蛋白42.3%、粗脂肪8.6%、粗灰分13.9%、水分10.2%；飼料粒徑2.2 mm，水中穩(wěn)定性2 h以上。

本試驗所用的擬穴青蟹幼蟹規(guī)格整齊，附肢健全，初始體質(zhì)量30 g，放養(yǎng)量1 200只/667 m2；脊尾白蝦(ExopalaemoncarinicaudaHolehuis)蝦苗放養(yǎng)密度為0.2 kg/667 m2。縊蟶(Sinonovaculaconstricta)和泥蚶(TegillarcagranosaLinnaeus)苗種投放量分別為10 kg/667 m2和38 kg/667 m2。

1.2 養(yǎng)殖試驗

投喂管理：養(yǎng)殖期間，每日投喂兩次，冰鮮餌料塘日投飼率從15%～30%(甲殼寬<8 cm)減少到8%～12%(甲殼寬>8 cm)；配合飼料塘日投飼率與冰鮮餌料塘比為1∶4左右。飼料散投在池塘四周的固定灘面，上午06：00～07：00，投喂量占30%，下午17：00～18：00，投喂量占70%；每次投喂量以2 h內(nèi)攝食完畢為宜，視青蟹的生長、攝食和天氣等情況適當調(diào)整。養(yǎng)殖飼喂周期5個月。

日常管理：池塘水位以保持在1 m左右，高溫期提高至1.2～1.5 m；3～4 d換水一次，日換水量20%～30%；養(yǎng)殖前、后期水溫在15℃以上時采用EM菌+芽孢桿菌+紅糖培水。池塘養(yǎng)殖每天早晚各巡池一次，檢查閘門、堤壩、防逃等設施和水色、水位，觀察青蟹的活動和攝食情況，及時清除殘餌和死蟹。養(yǎng)殖期間未爆發(fā)疾病，也無缺氧、翻塘等現(xiàn)象發(fā)生。

1.3 試驗分析

1.3.1 生物樣品采集與分析

養(yǎng)殖5個月后，使用籠捕法從每個池塘隨機采樣10只青蟹，游標卡尺逐一測量形體數(shù)據(jù)，并用電子天平稱重；打開甲殼，分離雌蟹的肝胰腺與卵巢；同時取其頭胸甲覆蓋下方的軀干部肌肉，均分成3份，用于常規(guī)營養(yǎng)成分檢測。在冰盤上分離胃和腸道組織，用冰凍雙蒸水沖洗組織內(nèi)壁，勻漿器中加入樣品和9倍去離子水，高速冷凍離心機(3 000 r·min-1)離心10 min，所得上清液置于-20℃冰箱中保存，用于消化酶活性檢測。

肌肉常規(guī)成分參照AOAC(2006)方法測定[5]：水分采用105℃烘干法、粗蛋白用凱氏定氮法(N×6.25)、粗脂肪用索氏乙醚浸提法、粗灰分用550℃馬福爐灼燒法。磷含量采用GB/T 6437—2002標準測定。消化酶活性測定使用試劑盒(南京建成生物工程研究所)。酶液蛋白濃度采用考馬斯亮藍法進行測定；胃蛋白酶活性定義為每mg組織蛋白在37℃每min分解蛋白生成1 μg氨基酸為1個酶活單位；胰蛋白酶活性定義為在pH 8.0和37℃條件下，每mg蛋白中含有的胰蛋白酶每min使吸光度變化0.003為1個酶活力單位；脂肪酶活力定義為在37℃時每g組織蛋白在反應體系中與底物反應1 min，每消耗1 μmol底物為1個酶活單位；淀粉酶活力定義為每mg組織蛋白在37℃與底物作用30 min，水解10 mg淀粉定義為1個酶活單位。

1.3.2 形態(tài)學指標計算

擬穴青蟹的肝胰腺指數(shù)(HSI)和性腺指數(shù)(GSI)計算公式如下：

肝胰腺指數(shù)(HSI，%)=(肝胰腺濕重/蟹體濕重)×100；

性腺指數(shù)(GSI，%)=(性腺濕重/蟹體濕重)×100。

1.3.3 底泥和水樣采集與分析

在養(yǎng)殖高溫期，利用5點采樣法采集樣品，即選取兩個養(yǎng)殖塘對角線的交點以及對角線上與交點等距的4個點作為采樣點。每個點使用2.5 L有機玻璃采水器取距離水面40 cm處的水樣，均勻混合作為供試水樣；池塘沉積物也按照5點采樣方式采集，沉積物利用沉積物柱狀采集器收集10 cm左右處的塘底沉積物。樣品均于4℃保存，DNA提取在24 h內(nèi)完成。過濾后的水樣，參考海洋監(jiān)測規(guī)范(GB 17378—2007)，測定包括氨氮、亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮、活性磷酸鹽和總有機碳等常規(guī)水質(zhì)指標。

取采集的兩個池塘水樣各100 mL，經(jīng)0.22 μm無菌纖維素濾膜過濾后用無菌剪刀剪碎濾膜，用于DNA提取；取采集的兩個池塘的沉積物樣各500 mg，分別提取DNA。上述水體、沉積物的總DNA提取均使用Power Soil DNA試劑盒(Mo Bio Laboratories，Carlsbad，CA，USA)，按照試劑盒說明書進行。將提取的細菌總DNA作為模板，設計含有bar-code的16S DNA的V3～V4可變區(qū)擴增引物341F(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和805R(5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)引物擴增細菌16S rRNA的V3～V4區(qū)。PCR擴增的程序參考Deng等[6]的方法。PCR擴增產(chǎn)物使用瓊脂糖2%凝膠電泳檢測質(zhì)量后，用Gene JET凝膠提取試劑盒(Thermo Scientific，Waltham，MA，USA)進行純化。使用Illumina Hi Seq平臺對定量的DNA進行16S rDNA擴增子測序(參考NCBI數(shù)據(jù)庫，序列號PRJNA561204)。

通過UCHIME Algorithm與數(shù)據(jù)庫Gold database對測序數(shù)據(jù)進行去雜質(zhì)控，得到有效數(shù)據(jù)。利用Uparse(V8.1.1861)對所有樣品的全部Effective Tags進行聚類，默認以97%的一致性(Identity)將序列聚類成為OTUs。根據(jù)Silva數(shù)據(jù)庫將檢測到的OTU進行分類分析。以OTU的物種分類譜系結(jié)果為依據(jù)，在門和屬的分類水平對各樣本進行豐度分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)±標準差(Mean±SD)，經(jīng)SPSS 16.0軟件進行T檢驗分析，并采用Tukey’s多重比較檢驗均值的差異顯著性，顯著性水平P為0.05。

2 結(jié)果

2.1 兩種飼料對青蟹生長指標的影響

對養(yǎng)成的擬穴青蟹抽樣分析，發(fā)現(xiàn)兩種飼料組養(yǎng)成的青蟹在形體學指標(全甲寬、甲長、體高)以及平均體質(zhì)量均無顯著差異(P>0.05)；肝胰腺指數(shù)和性腺指數(shù)以冰鮮餌料組略高，但無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(表1)。

表1 兩種飼料對青蟹生長指標的影響

2.2 兩種飼料對青蟹肌肉常規(guī)營養(yǎng)組成的影響

兩種飼料養(yǎng)成的擬穴青蟹肌肉常規(guī)營養(yǎng)組成見表2。冰鮮餌料組的青蟹肌肉中水分含量(78.14%)要高于配合飼料組(76.89%)(P>0.05)；配合飼料組的青蟹肌肉粗蛋白含量(20.12%)則顯著高于冰鮮餌料組(18.73%)(P<0.05)。兩組青蟹的肌肉粗脂肪和粗灰分含量無顯著性差異(P>0.05)。

表2 兩種飼料對青蟹肌肉常規(guī)營養(yǎng)組成的影響

2.3 兩種飼料對青蟹消化酶活性的影響

試驗青蟹胃和腸道消化酶活性測定結(jié)果如表3所示。配合飼料組的青蟹胃蛋白酶活性顯著高于冰鮮餌料組(P<0.05)，但胃淀粉酶活性顯著低于冰鮮餌料組(P<0.05)。胃脂肪酶活性2組間無顯著差異(P>0.05)。腸道消化酶活性，冰鮮餌料組的青蟹腸蛋白酶活性顯著高于配合飼料組(P<0.05)，脂肪酶和淀粉酶活性則相對穩(wěn)定，不受飼料處理的影響(P>0.05)(表3)。

表3 兩種飼料對青蟹消化酶活性的影響

2.4 兩種飼料投喂對池塘水質(zhì)和微生物組成的影響

表4所示為兩個試驗池塘水質(zhì)指標測定結(jié)果。氨氮、亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮、磷酸鹽和總有機碳等5項水質(zhì)指標均為冰鮮餌料組的池塘高于配合飼料組的池塘；但各組指標之間無顯著性差異(P>0.05)。

表4 兩個飼料組的池塘水質(zhì)指標

圖1顯示了試驗樣品中在門水平(a)和屬水平(b)下最豐富的10個菌群。在門水平上(圖1-a)，水體和沉積物樣品中菌群以變形菌門(Proteobacteria)為主，底泥中平均占61.9%、水體中平均占40.1%；其次為水體中的藍藻門(Cyanobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)，以及沉積物中的擬桿菌門(Bacteroidetes)(圖1-a)。此外還有放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、綠菌門(Chlorobi)、綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、螺旋體菌門(Spirochaetae)為前10最豐富門。在屬的水平上(圖1-b)，聚球藻屬(Synechococcus)、Sulfurovum屬、脫硫葉菌屬(Desulfobulbus)、Phaeodactylibacter屬、白念珠菌屬(Candidatusaquiluna)、Marinicella屬、Salinihabitans屬、假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)屬、海命菌屬(Marivita)和奧文氏菌屬(Owenweeksia)為前10最豐富屬。

分析兩個池塘中采集的水樣和底泥樣品中菌群在屬水平上的平均相對豐度，發(fā)現(xiàn)水樣中有海命菌屬等7種微生物菌的平均相對豐度具有顯著差異，且均為對照塘的菌群平均相對豐度顯著高于試驗塘(P<0.05)(表5)。底泥樣品中，測得有9種微生物在屬水平上的平均相對豐度具有顯著差異，其中，試驗塘底泥除了雙歧桿菌屬的平均相對豐度高于對照塘以外(P<0.05)，其他如地桿菌屬等8種微生物的平均相對豐度均顯著低于對照塘(P<0.05)。

表5 屬水平上水樣和底泥中具有顯著性差異的菌群的平均相對豐度

在所有養(yǎng)殖動物起捕完畢后，對兩個池塘的生產(chǎn)效益的分析結(jié)果如表6所示。兩個飼料組的青蟹產(chǎn)量相當；但配合飼料組的脊尾白蝦產(chǎn)量和貝類總產(chǎn)量分別比對照塘高出18.2%和4.0%。配合飼料組每667 m2水產(chǎn)品總產(chǎn)量為374 kg，比冰鮮餌料組總產(chǎn)量353 kg增加5.9%。養(yǎng)殖成本方面，配合飼料組的每667 m2飼料成本為1 615元，相比于冰鮮餌料組的2 250元，每667 m2飼料成本下降28.2%；配合飼料組總成本為10 720元/667 m2，比冰鮮餌料組總成本(11 655元/667 m2)減少8.0%。配合飼料組每667 m2利潤6 210元，冰鮮餌料組4 355元，配合飼料組增收1 855元/667 m2(表6)。

表6 兩個飼料組的池塘養(yǎng)殖效益分析

續(xù)表6

3 討論

近年來已有關于青蟹配合飼料營養(yǎng)需求的研究[7-9]，但對生產(chǎn)實踐中應用效果的報道還較少。2016年以來，在浙江省漁業(yè)主管部門支持下，全省水產(chǎn)技術推廣系統(tǒng)圍繞青蟹、大口黑鱸(Micropterussalmoides)、大黃魚(Larimichthyscrocea)等海、淡水主導品種，開展了配合飼料替代冰鮮餌料養(yǎng)殖的聯(lián)合推廣行動。其中，青蟹配合飼料的示范推廣打破了青蟹傳統(tǒng)養(yǎng)殖配合飼料“零應用”的局面，取得了明顯成效。本試驗的結(jié)果表明，擬穴青蟹池塘混養(yǎng)模式下使用配合飼料養(yǎng)殖，抽樣青蟹的個體規(guī)格和性腺發(fā)育等與投喂冰鮮餌料無顯著差異，青蟹產(chǎn)量基本保持穩(wěn)定，混養(yǎng)的脊尾白蝦和貝類產(chǎn)量有明顯增加，養(yǎng)殖綜合效益提升明顯。

研究表明，飼料類型及其營養(yǎng)水平會影響水產(chǎn)動物機體的營養(yǎng)組成。本試驗觀察到青蟹攝食膨化飼料后，肌肉水分含量有所降低，蛋白質(zhì)含量顯著增加；對大口黑鱸(M.salmoides)[10]、烏鱧(Channaargus)[11]、大黃魚(L.crocea)[12]等魚類以及中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)[13]的研究發(fā)現(xiàn)，相比于投喂冰鮮餌料，投喂配合飼料養(yǎng)成的水產(chǎn)品肌肉品質(zhì)有所改善。

蝦蟹類的消化酶活性取決于其自身的消化生理特性和所攝食的餌料，其中餌料營養(yǎng)素的質(zhì)和量是影響其消化酶分泌與活性強弱的關鍵因素[14-15]。研究報道，青蟹主要由胃分泌消化蛋白質(zhì)、淀粉和纖維素的酶，腸道也能分泌一部分淀粉酶和少量其他酶類，但主要功能為吸收營養(yǎng)[16]。本試驗結(jié)果顯示，攝食配合飼料的擬穴青蟹胃蛋白酶活性顯著高于冰鮮餌料組，在三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)[17]、中華絨螯蟹[18]和日本對蝦(Penaeusjaponicus)[19]的研究中也有相似報道。本試驗還發(fā)現(xiàn)攝食冰鮮餌料后青蟹腸道胰蛋白酶活性較高，脂肪酶在兩個組織中的活性差異大不，胃的淀粉酶活性則明顯高于腸道。消化酶活性變化的原因可能與兩種餌料的營養(yǎng)組成以及配合飼料的加工工藝等因素有關，擬穴青蟹的消化酶分泌做了適應性調(diào)節(jié)。

養(yǎng)殖池塘水質(zhì)指標對于水產(chǎn)動物的生長和健康狀況起到關鍵影響[20]，海水養(yǎng)殖尾水的無機氮和活性磷酸鹽含量超標又是造成近海海域污染的主要因素之一[21-22]；加強養(yǎng)殖過程的投入品源頭和養(yǎng)殖過程管控對海水養(yǎng)殖可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。本試驗觀察到投喂配合飼料的試驗塘的氨氮、亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮、活性磷酸鹽和總有機碳等水質(zhì)指標均低于投喂冰鮮餌料的對照塘，表明在基本相同的養(yǎng)殖管理下，投喂配合飼料對于改善養(yǎng)殖水質(zhì)，從而減輕水體有害物質(zhì)對養(yǎng)殖生物的脅迫效應具有積極作用。

微生物群落結(jié)構是反映養(yǎng)殖系統(tǒng)狀態(tài)改變和水體健康程度的重要指標[23]；分析菌群中的優(yōu)勢菌群和相對豐度的變化，對維持和調(diào)控養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)，促進養(yǎng)殖生物的生長和抗病力具有重要的意義[24]。本試驗觀察到變形菌門和藍藻門是池塘水體中最豐富的兩個菌群門類。變形菌門是海洋或陸地上的高鹽湖泊中最主要的細菌類群之一[25]，被認為是水產(chǎn)養(yǎng)殖中的共生菌[26]。藍藻細菌則是誘發(fā)養(yǎng)殖水體藍藻暴發(fā)的重要菌群，會引起水產(chǎn)動物中毒與缺氧死亡[27]。本試驗中，投喂冰鮮餌料的池塘水體中檢測到相對較高的無機養(yǎng)分水平可能更有利于藍藻生長。同時，水樣中在屬水平上相對豐度具有顯著性差異的7種菌群也均出現(xiàn)在投喂冰鮮餌料的池塘；其中，海命菌屬、熱帶單胞屬、海洋柄菌屬和海洋桿菌屬均屬于變形菌門。變形菌門是一種多功能菌群，具有脫氮除磷、降解有機質(zhì)和降低化學需氧量的功能，在污染嚴重的廢水中具有較高的豐度[28]；另有研究發(fā)現(xiàn)，水產(chǎn)動物腸道菌群多樣性降低、變形菌門細菌增多會引發(fā)腸道炎癥反應[29]。奧文氏菌屬和Rubidimonas屬于擬桿菌門，擬桿菌門的細菌與DNA、脂類和蛋白質(zhì)等有機物質(zhì)的轉(zhuǎn)換密切相關，對這些有機物質(zhì)的吸收和利用是水體環(huán)境中碳循環(huán)的重要組成部分[30]；冰鮮餌料組的池塘水樣中擬桿菌表現(xiàn)出較高的相對豐度可能與該池塘需降解復雜有機物，特別是多糖和蛋白質(zhì)(如動物性餌料和藻類等)的活性有關。差異菌群可通過其代謝活動影響營養(yǎng)元素的物質(zhì)循環(huán)，決定水質(zhì)的狀況，從而影響水生動物的生存狀態(tài)和健康狀況。池塘的底質(zhì)可作為氨、硫化物和活性磷酸鹽的“培養(yǎng)基”，是池塘中涉及有機物和養(yǎng)分循環(huán)最活躍的微生物轉(zhuǎn)化場所[31]，但本試驗中冰鮮餌料組和配合飼料組的池塘底泥中占比在前10位的菌群在屬水平上的相對豐度上并無顯著差異。

綜上，投喂配合飼料對于提高擬穴青蟹池塘養(yǎng)殖效益、改良養(yǎng)殖環(huán)境方面具有積極作用，表明了在青蟹生產(chǎn)實踐中應用配合飼料替代冰鮮餌料的可行性；試驗結(jié)果為促進青蟹健康養(yǎng)殖模式的轉(zhuǎn)型發(fā)展提供了理論依據(jù)。