不同返青休牧期土壤微生物碳代謝特征及其影響因素研究

王曉麗，溫軍，馬玉壽，王彥龍，施建軍，周華坤

1. 青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院/青海大學(xué)/省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016；2. 流域水循環(huán)與生態(tài)省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/青海省水資源高效利用工程技術(shù)研究中心/青海省水利水電科學(xué)研究院有限公司，青海 西寧 810001；3 青海省寒區(qū)恢復(fù)生態(tài)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所，青海 西寧 810008

三江源區(qū)高寒草甸生態(tài)環(huán)境脆弱，對(duì)自然環(huán)境和人類生產(chǎn)活動(dòng)的干擾較為敏感（杜玉娥等，2011）。研究表明三江源區(qū)高寒草甸持續(xù)退化（趙新全等，2005；Fan et al.，2010；徐翠等，2013），高原地區(qū)過(guò)度放牧是草地退化的直接原因（曹廣民等，2007；樊江文等，2011；韋惠蘭等，2016）。面對(duì)草地退化這一嚴(yán)峻形勢(shì)，科學(xué)制定放牧制度，合理利用高寒草甸牧草資源，才能達(dá)到保護(hù)天然牧場(chǎng)和生態(tài)環(huán)境的目的。

青藏高原地區(qū)，研究人員通常將放牧草場(chǎng)分為暖季草場(chǎng)和冷季草場(chǎng)進(jìn)行研究（董全民等，2012）。由于牧草在春夏和秋冬之交生長(zhǎng)緩慢，再生性能差，此時(shí)最易發(fā)生過(guò)牧，牧草過(guò)高的利用率嚴(yán)重影響了牧草的再生，引起草地的嚴(yán)重退化（胡金梅等，2008）。春季作為關(guān)鍵忌牧期，是牧草貯藏營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)的關(guān)鍵時(shí)期，對(duì)放牧的時(shí)間、強(qiáng)度十分敏感。基于植物生長(zhǎng)發(fā)育節(jié)律在草地放牧敏感期舍飼休牧才是“時(shí)間機(jī)制”的基本內(nèi)涵（李青豐等，2005）。

春季休牧（返青期休牧）在內(nèi)蒙古典型草原被證明可以有效保護(hù)草地生態(tài)環(huán)境，平衡畜牧業(yè)發(fā)展和草地生態(tài)環(huán)境之間的關(guān)系，有利于草地植被的可持續(xù)利用（李青豐，2005；趙鋼等，2006；朱立博等，2008）。研究不同休牧?xí)r間對(duì)草地的影響，對(duì)休牧的可行性進(jìn)行分析，休牧期間采用低投入維持性飼養(yǎng)，顯著降低飼養(yǎng)成本，可提高草地生態(tài)效益、畜牧業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐可行性和經(jīng)濟(jì)合理性（李青豐等，2005）。學(xué)者們從種群分布格局、種間關(guān)系和碳儲(chǔ)量等方面進(jìn)一步研究了春季休牧對(duì)草原植被和土壤的影響。研究表明，植物群落和土壤有機(jī)碳儲(chǔ)量隨著休牧年限的延長(zhǎng)而增多，但在春季休牧?xí)r資源限制了群落內(nèi)植物種群的生長(zhǎng)，種群因占有資源能力不同而產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)作用。在休牧后有放牧干擾時(shí)，家畜牧食行為成為限制植物生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素，資源的限制作用降低（李玉潔等，2013a；衛(wèi)智軍等，2016；呂世杰等，2016）。三江源區(qū)高寒草甸返青期休牧的研究工作尚處于初級(jí)階段，且該區(qū)域高寒草甸生態(tài)系統(tǒng)獨(dú)特、原始和脆弱，亟待在調(diào)控載畜量的基礎(chǔ)上根據(jù)區(qū)域物候期和牧草返青期科學(xué)合理地制定春季休牧制度。土壤微生物作為生態(tài)系統(tǒng)重要的分解者，在物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)化中占有重要地位（Somova et al.，2001；Schimel et al.，2012）。與土壤理化性質(zhì)相比，土壤微生物對(duì)外界環(huán)境的變化更為敏感，常被用作表征土壤質(zhì)量的靈敏性指標(biāo)（Nielsen et al.，2002）。盡管基于生物標(biāo)志物的測(cè)定方法（如磷脂脂肪酸PLFAs法）和分子生物學(xué)方法（DGGE等）可以反映微生物的群落結(jié)構(gòu)信息，但卻無(wú)法獲得有關(guān)微生物群落總體活性與代謝功能的信息，Biolog方法彌補(bǔ)了這一不足（Garland et al.，1991）。

因此，本文擬利用Biolog方法研究三江源區(qū)高寒草甸生態(tài)系統(tǒng)不同返青期休牧?xí)r間下土壤微生物生物生物量碳氮及其碳代謝特征，不僅可以了解高寒草甸生態(tài)系統(tǒng)在不同返青休牧期下微生物的變化特征，而且通過(guò)監(jiān)測(cè)土壤理化性質(zhì)試圖揭示微生物碳代謝對(duì)返青期休牧過(guò)程的響應(yīng)機(jī)理。本研究可為三江源區(qū)高寒草甸的合理利用提供有效措施，為草地畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)，對(duì)優(yōu)化放牧制度、揭示生態(tài)系統(tǒng)退化原因以及提升生態(tài)系統(tǒng)功能具有重要的科學(xué)意義。

1 試驗(yàn)區(qū)域與研究方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于三江源國(guó)家自然保護(hù)區(qū)青海省果洛州瑪沁縣大武鎮(zhèn)永寶村，地理位置為34°24′14″N，100°23′31″E，海拔 3920 m 左右。該區(qū)域?qū)儆诘湫透咴箨懶蜌夂?，寒冷、干旱、多風(fēng)，太陽(yáng)輻射強(qiáng)，日照時(shí)間短，晝夜溫差大。年均溫為?3.9 ℃，最冷月平均氣溫為?12.6 ℃，最熱月平均氣溫為9.7 ℃；年降水量513.2—542.9 mm，多集中在6—9月，年蒸發(fā)量2471.6 mm。牧草生長(zhǎng)季約156 d，全年無(wú)絕對(duì)無(wú)霜期．草地為不同退化程度的高寒矮嵩草（Kobresia humili）草甸，主要草本植物為莎草科、蓼科、菊科和薔薇科等。土壤為高山草甸土。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及測(cè)試方法

2017年5月10日三江源區(qū)果洛地區(qū)的返青期開始，選擇作為冬春草場(chǎng)地勢(shì)平坦的高寒草甸樣地該草地原屬于永寶牧場(chǎng)，近30年來(lái)，一直作為冬春草場(chǎng)使用，在夏秋季節(jié)是休牧的。如表1所述，分別設(shè)置CK（不休牧）、休牧20 d、休牧30 d、休牧40 d和休牧50 d，共5個(gè)處理。所有處理的休牧開始時(shí)間不一致，但結(jié)束時(shí)間統(tǒng)一為轉(zhuǎn)場(chǎng)到夏季牧場(chǎng)的時(shí)間6月30日，其中休牧50 d的時(shí)間為5月10日—6月30日，休牧40 d的時(shí)間為5月20日—6月30日，休牧30 d的時(shí)間為5月30日—6月30日，休牧20 d的時(shí)間為6月10日—6月30日。對(duì)照 CK為不休牧，通過(guò)控制牧草利用率在 30%—50%來(lái)控制，放牧強(qiáng)度約為 0.89—1.45 cattle·hm?2，屬中輕度放牧。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)樣地。

表1 試驗(yàn)中各處理的休牧和放牧?xí)r間Table1 The times of no-grazing and grazing in the treatments

2017年8月在每個(gè)樣地選擇5個(gè)樣方采集表層0—15 cm的土壤樣品，每個(gè)樣方的土樣由3.5 cm直徑的土鉆采集5鉆的土混合而成。在采樣過(guò)程中為避免牲畜排泄物導(dǎo)致的對(duì)土壤特性的影響，絕對(duì)避開牲畜排泄物的，同時(shí)避開牲畜排泄物留存痕跡。同時(shí)，用便攜式土壤三參數(shù)儀測(cè)定土壤的溫度。土壤樣品帶回實(shí)驗(yàn)室后，過(guò)2 mm的土篩，撿出石粒、植物根系及枯落物等，并分成兩份，一份在室內(nèi)自然風(fēng)干后，用于測(cè)定土壤理化性質(zhì)等指標(biāo)；一份在4 ℃冷藏保存，用于測(cè)定土壤微生物生物量碳氮和土壤微生物碳源利用特征及其多樣性等指標(biāo)。土壤有機(jī)碳（SOC）采用重鉻酸鉀氧化法測(cè)定，全氮（TN）和速效氮（NH4+-N和NO3?-N）采用全自動(dòng)間斷化學(xué)分析儀（CleverChem）測(cè)定，全磷（TP）采用鉬銻抗比色法測(cè)定，速效磷（AP）采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法測(cè)定，全鉀（TK）采用火焰光度法測(cè)定（楊劍虹等，2008），土壤微生物生物量碳氮采用氯仿熏蒸提取法測(cè)定（Brookes et al.，1985）。

土壤微生物碳源利用特征及其多樣性分析采用 Biolog-Eco法測(cè)定（Choi et al.，1999；Miki et al.，2018）。采用 Biolog-Eco平板法測(cè)定的數(shù)據(jù)通過(guò)計(jì)算平均顏色變化率（AWCD）、McIntosh指數(shù)（U）、Shannon物種多樣性指數(shù)（H）和Simpson優(yōu)勢(shì)度指數(shù)（D）來(lái)衡量土壤微生物群落碳代謝能力。其中每孔平均顏色變化率（AWCD）反映了土壤微生物群落碳源代謝能力的高低，是土壤微生物活性和多樣性大小的一個(gè)重要指標(biāo)。一般認(rèn)為變化幅度較大的樣品具有較高的碳源利用能力，也往往具有較高的微生物豐度。對(duì)第10天的土壤微生物31種碳源的碳代謝指標(biāo) AWCD進(jìn)行了多樣性指數(shù)的分析，包括微生物群落Shannon多樣性指數(shù)、Simpson優(yōu)勢(shì)度指數(shù)和 McIntosh指數(shù)代表微生物群落功能多樣性（Garland et al.，1991；Garland，1997）。

式中，C為31孔每孔的吸光值；R為對(duì)照孔吸光值；n為碳源種類數(shù)31。

McIntosh指數(shù)（U）來(lái)衡量群落均一性程度；

式中ni為31種碳源的平均值。

采用Shannon物種多樣性指數(shù)（H）和Simpson優(yōu)勢(shì)度指數(shù)（D）反映群落中最常見(jiàn)的物種，評(píng)估微生物群落優(yōu)勢(shì)度；

式中，Pi為每個(gè)孔吸光度/所有吸光度之和。

1.3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 22.0和Excel 2013對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，其中不同休牧期間的差異比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），采用 LSD法或 Tamhane’s進(jìn)行多重比較。利用R軟件的ggplot 2包做了培養(yǎng)第 10天微生物利用 31中碳源的氣泡圖。利用canoco for window 4.5對(duì)拐點(diǎn)時(shí)間第10天的土壤微生物碳代謝指標(biāo) AWCD做主成分分析（principal component analysis，PCA），并且將31中碳源分成六類碳源，即糖類、氨基酸類、酯類、醇類、胺類和羧酸類。然后用第 10天的土壤微生物碳代謝指標(biāo) AWCD與土壤理化性質(zhì)做冗余度分析（redundancy analysis，RDA），同時(shí)進(jìn)行蒙特卡洛（Monte Carlo）檢驗(yàn)選出在0.05水平上顯著的環(huán)境變量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同返青休牧期下土壤碳氮及微生物生物量碳氮特征

不同返青期休牧下土壤有機(jī)碳（SOC）差異顯著（P=0.000），且休牧 20 d（43.57 g·kg?1）顯著高于其他處理，休牧50 d反而最低（22.83 g·kg?1）。土壤全氮（TN）在不同處理間差異顯著（P=0.003），但與SOC的規(guī)律不同，休牧20 d、40 d和CK顯著高于休牧30 d和50 d。土壤碳氮比（SOC：TN）在不同返青期休牧下差異也顯著（P=0.005），休牧20 d和30 d顯著高于對(duì)照和休牧40 d和50 d，不同處理間SOC：TN值在14.84—23.82之間。

不同返青期休牧下土壤微生物生物量碳（MBC）差異不顯著（P=0.711），但在CK、20 d、30 d、40 d和50 d處理下呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，在 30 d處理下 MBC最大，為 56.57 mg·kg?1，在 CK處理下最小，為31.09 mg·kg?1。不同返青期休牧下土壤微生物生物量氮（MBN）差異也不顯著（P=0.064），但休牧20 d和40 d的顯著高于CK和休牧50 d處理。MBN在休牧20 d和休牧40 d處理下分別為 27.20 mg·kg?1和 30.07 mg·kg?1，在 CK 和50 d 處理下分別為 12.81 mg·kg?1和 11.22 mg·kg?1。但MBC：MBN在不同處理間差異顯著（P=0.046），休牧30 d和50 d顯著高于休牧20 d和40 d，其中休牧50 d和30 d為3.83和3.82，休牧20 d和40 d為1.53和1.67（表2）。土壤微生物墑（MBC：SOC）在不同返青期休牧下差異不顯著（P=0.346）。

表2 不同返青期休牧土壤碳氮及微生物生物量碳氮特征Table 2 The properties of soil C and N and soil microbial biomass Cand N in different grazing-rest times

2.2 不同返青休牧期土壤微生物碳代謝分析

圖1為不同返青期休牧處理下土壤微生物群落代謝活性（AWCD）隨培養(yǎng)時(shí)間的變化曲線，在培養(yǎng)初始的 24 h內(nèi)土壤微生物活性較低，24 h后AWCD值快速增長(zhǎng)，在7 d的時(shí)候增加較為緩慢，在第8天出現(xiàn)第二個(gè)快速增長(zhǎng)期，在第10天達(dá)到最大值，但在第11天各處理的AWCD有下降趨勢(shì)。不同返青期休牧下土壤微生物利用碳源能力的順序?yàn)?CK>30 d>40 d>50 d>20 d，AWCD值分別為(0.85±0.09)、(0.82±0.13)、(0.75±0.08)、(0.70±0.05)和 (0.68±0.01)，但各處理間差異并不顯著（P>0.05）。

圖1 不同返青期休牧下土壤微生物群落平均顏色變化率（AWCD）Fig. 1 Soil microbial AWCD in the different grazing-rest times

高寒草地土壤微生物對(duì)不同種類碳源的利用能力是不同，B4在CK顯著高于50 d（P=0.048），C2在 20 d顯著高于 40 d（P=0.015）和 50 d（P=0.028），D2在 50 d顯著低于 20、30、40 d（P=0.012，P=0.018，P=0.013），H4在40 d顯著高于50 d（P=0.032），F(xiàn)2在50 d顯著低于CK、20 d和 30 d（P=0.016，P=0.020，P=0.035），B3 在 30 d顯著高于CK和20 d（P=0.026，P=0.029），H3在50 d顯著高于20 d和30 d（P=0.046，P=0.037）（圖2）。

土壤微生物對(duì) 6類碳源的利用能力也是不同的，依次為羧酸類>氨基酸類>糖類>酯類>醇類>胺類，但不同返青期休牧處理下，只有醇類的代謝差異顯著（P=0.028），且休牧20 d顯著高于40 d和50 d。其他5類碳源的代謝在不同返青期休牧處理下差異不顯著（P>0.05）。不同類的碳源代謝在不同返青期休牧處理下變化很大，很不穩(wěn)定，并未表現(xiàn)出一定的規(guī)律（圖3）。

圖2 不同返青期休牧下土壤微生物對(duì)31類碳源的利用（240 h）Fig. 2 The ability of soil microbial community to utilize the 31 carbon sources in the different grazing-rest times

圖3 不同返青期休牧下土壤微生物對(duì)六類碳源的利用（240 h）Fig. 3 The ability of soil microbial community to utilize the six kinds of carbon sources in the different grazing-rest times

圖4 不同返青期休牧下土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)的比較Fig. 4 Functional diversity indices for soil microbial community in the different grazing-rest times

多樣性指數(shù)可以反映微生物群落代謝功能的多樣性，圖4顯示土壤微生物群落功能Simpson（D）、Shannon（H）、McIntosh指數(shù)（U）和均勻度指數(shù)（J）4個(gè)指數(shù)均在前7天增加較快，7 d以后增加緩慢，且在不同的返青期休牧處理下差異不顯著（P>0.05）。Simpson（D）指數(shù)在培養(yǎng)的第1天表現(xiàn)出20 d>50 d>40 d>30 d>CK的規(guī)律，且值在0.83—0.89之間，但在培養(yǎng)的第11天不同返青期休牧處理下表現(xiàn)出幾乎相等的值，約為0.95—0.96（圖4A）。Shannon（H）在培養(yǎng)第1天也表現(xiàn)出20 d>50 d>40 d>30 d>CK規(guī)律，值在2.25—2.59之間，但在培養(yǎng)的第 11天不同返青期休牧處理下也表現(xiàn)出幾乎相等的值，約為 3.15—3.25之間（圖 4B）。McIntosh指數(shù)（U）在培養(yǎng)的第1天表現(xiàn)出20 d>40 d>CK>30 d>50 d的規(guī)律，且值在0.03—0.08之間，但在培養(yǎng)第11天不同返青期休牧處理下表現(xiàn)出30 d>CK>20 d>40 d>50 d的規(guī)律，值在4.84—5.64之間（圖4C）。均勻度指數(shù)（J）在培養(yǎng)第1天表現(xiàn)出20d最高，CK最低的規(guī)律，在培養(yǎng)第11天CK是較高的（圖4D）。

2.3 土壤微生物特征及其與土壤性質(zhì)的關(guān)系

不同樣點(diǎn)的主成分分析（PCA）結(jié)果表明：不同返青期休牧處理下土壤微生物群落碳代謝在PCA1和 PCA2上差異都不顯著（P>0.05），但在PCA2上，休牧20 d顯著高于休牧40 d（P=0.05）。第一主成分和第二主成分的貢獻(xiàn)率分別為 75.69%和9.75%，累計(jì)貢獻(xiàn)率為85.44%（圖5）。我們將土壤理化性質(zhì)及微生物碳氮指標(biāo)與微生物群落碳代謝功能進(jìn)行冗余度分析（RDA）分析（圖6），結(jié)果表明：土壤理化性質(zhì)及微生物碳氮指標(biāo)解釋了微生物群落碳代謝的91.1%的變異，其中第一主成分解釋了80.9%，第二主成分解釋了10.2%。土壤有機(jī)碳SOC解釋了8%的變異，且顯著影響微生物群落碳代謝（P=0.038）。另外，全磷（TP）解釋了19%的變異（P=0.096），微生物量碳氮比MBC：MBN解釋了15%的變異（P=0.072），硝態(tài)氮（NO3?-N）解釋了14%的變異（P=0.098），微生物生物量碳MBC解釋了9%的變異（P=0.124），但這些因子對(duì)微生物群落碳代謝的影響差異并不顯著。

圖5 不同休牧?xí)r間下土壤微生物碳代謝功能主成分分析Fig. 5 The principal component analysis (PCA) of soil microbial carbon metabolism function

圖6 土壤和微生物性質(zhì)與微生物碳代謝功能的冗余分析Fig. 6 The redundancy analysis (RDA) of soil, microbial properties and the carbon metabolism function

3 討論

在高寒草甸生態(tài)系統(tǒng)，放牧是主要的干擾因子，牲畜可以通過(guò)排泄糞便直接的影響土壤生態(tài)系統(tǒng)，同時(shí)也可以通過(guò)采食植物間接的影響土壤生態(tài)系統(tǒng)。土壤是草地生態(tài)系統(tǒng)重要組分之一，土壤的發(fā)育和肥力狀況對(duì)植物及家畜的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生重要的影響。土壤生態(tài)系統(tǒng)中生活著豐富的微生物類群，其種類、數(shù)量、分布等生命活動(dòng)規(guī)律都與土壤中的物質(zhì)、能量轉(zhuǎn)化、肥力及植物生長(zhǎng)有著密切的關(guān)系（Bunemann et al.，2004；Schimel et al.，2005）。在我們的研究中，不同的返青休牧期主要差異在于對(duì)照是放牧處理，而休牧20、30、40、50 d分別是對(duì)草地進(jìn)行休牧的時(shí)間處理，因此，我們不僅要考慮放牧對(duì)高寒草地土壤微生物群落的影響，而且要考慮在放牧或者休牧后植物及其根系變化而間接引起的土壤微生物的變化。

家畜等大型食草動(dòng)物通過(guò)改變草地地上和地下凋落物的數(shù)量和品質(zhì)，以及排放尿液和糞便來(lái)間接影響植被和生態(tài)系統(tǒng)特征（Persson et al.，2005；侯扶江等，2006；張成霞等，2010），適度的放牧干擾有利于地表凋落物的分解和輸入，增加土壤養(yǎng)分含量，有利于土壤微生物的繁殖（Xiao et al.，2012；姚國(guó)征等，2017；吝亞杰，2017）。我們的研究結(jié)果顯示在對(duì)照不休牧樣地土壤微生物群落代謝活性較強(qiáng)，表明放牧活動(dòng)能提高高寒草甸土壤微生物群落代謝特征，這與翟文婷等（2017）在環(huán)青海湖地區(qū)高寒草原的結(jié)果一致。曲同寶等在松嫩草地上的研究也表明適牧處理下的土壤細(xì)菌能充分利用碳水化合物、氨基酸、多聚物、酚酸類及胺類等碳源，休牧處理下的土壤細(xì)菌對(duì)碳水化合物、氨基酸及多聚物能夠充分利用，而重牧處理下的土壤細(xì)菌只對(duì)羧酸類碳源利用有相對(duì)優(yōu)勢(shì)（曲同寶等，2012），而長(zhǎng)時(shí)間的休牧（休牧3—9年）使草原土壤微生物代謝功能增強(qiáng)，土壤微生物繁殖快、數(shù)量大，從而促進(jìn)土壤微生物量碳、氮含量的增加（李玉潔等2013b；薛亞芳等，2018）。由此可見(jiàn)，土壤微生物對(duì)碳源的利用與放牧強(qiáng)度和休牧?xí)r間有很大的關(guān)系，考慮到我們的研究地處于輕度退化高寒草甸，因此在進(jìn)行放牧的對(duì)照處理時(shí)，采用輕中度的放牧處理。主要是由于牲畜所產(chǎn)生的糞便能夠直接增加土壤中營(yíng)養(yǎng)元素的含量，加快生態(tài)系統(tǒng)的營(yíng)養(yǎng)循環(huán)速率，也有可能是輕中度放牧增加地上植物生產(chǎn)力，刺激光和固定的碳輸入到地上根系，增加根系分泌物，從而提高了土壤微生物群落碳代謝活性（Zhao et al.，2017）。但相對(duì)于休牧樣地，土壤微生物群落代謝活性并未呈出顯著的差異，Zhao et al.（2017）的研究結(jié)果也表明，盡管放牧條件下土壤微生物群落在土壤碳動(dòng)態(tài)過(guò)程中扮演著重要的角色，但輕中度放牧對(duì)土壤微生物及其真菌細(xì)菌群落無(wú)顯著影響。Qi et al.（2011）等在中國(guó)內(nèi)蒙古半干旱草原放牧研究中結(jié)果表明土壤微生物碳代謝AWCD值在長(zhǎng)期休牧樣地和連續(xù)放牧樣地間也無(wú)顯著差異，但AWCD值和香農(nóng)維納指數(shù)（H′）隨著放牧強(qiáng)度的增加而增加。

從不同返青休牧期對(duì)微生物群落代謝功能多樣性的影響來(lái)看，在培養(yǎng)的第一天休牧20 d的處理下，Simpson（D）、Shannon（H）、McIntosh指數(shù)（U）都較其他處理高。休牧20 d處理是返青期后期，在早期（5月10日—6月10日）進(jìn)行了為期30 d的放牧活動(dòng)，雖然植物在幼苗期受家畜啃食和踐踏的影響，但可能在后期得到充分補(bǔ)償生長(zhǎng)，同時(shí)土壤可能受到家畜糞便微生物類群的影響，使得微生物種類和活性有一定的增加，在后期休牧的時(shí)候，碳代謝功能得到充分發(fā)揮。我們的結(jié)果也顯示休牧20 d處理下微生物利用醇類物質(zhì)顯著高于休牧40 d、休牧50 d和對(duì)照的放牧樣地。但凡被微生物用來(lái)構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)或代謝產(chǎn)物中碳架來(lái)源的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)統(tǒng)稱為碳源。微生物能利用碳源的種類及形式極其廣泛多樣，其中糖類是微生物最廣泛利用的碳源，其次是醇類、有機(jī)酸類和脂類（魯順保等，2012）。微生物對(duì)有機(jī)物質(zhì)的分解兩類：一、有氧分解，即進(jìn)入環(huán)境的含碳有機(jī)物與微生物接觸，在有氧條件下這些有機(jī)物便成為好氧微生物的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)而被氧化分解。二、無(wú)氧分解，即當(dāng)大量有機(jī)物進(jìn)入環(huán)境時(shí)，由于好氧細(xì)菌的活動(dòng)消耗大量氧氣，造成了局部的厭氧環(huán)境，使厭氧微生物取代了好氧微生物，而對(duì)有機(jī)物進(jìn)行厭氧分解。醇類則需要轉(zhuǎn)化為葡萄糖，進(jìn)而被分解為無(wú)機(jī)物質(zhì)（吳向華等，2012）。由此我們推測(cè)，20 d休牧處理前期的放牧活動(dòng)提高了偏好利用醇類物質(zhì)的微生物類群種類和活性，從而導(dǎo)致在20 d休牧處理下表現(xiàn)出較高的功能多樣性。我們反觀對(duì)照的放牧處理，其微生物群落代謝功能多樣性 Simpson（D）、Shannon（H）、McIntosh指數(shù)（U）和均勻度指數(shù)（J）在培養(yǎng)第11天的時(shí)候相對(duì)于其他處理都是較高的。這與隴東典型草原上研究結(jié)果一致，豐富度指數(shù)和香濃指數(shù)在有一定放牧的小區(qū)最高，可能是由于土壤硝化細(xì)菌種群數(shù)量和硝化勢(shì)隨著放牧強(qiáng)度增加了（劉天增，2012）。在不同類型的草地生態(tài)系統(tǒng)中，放牧均能增加土壤的硝化活性（Patra et al.，2005）。土壤微生物群落代謝活性（AWCD）和功能多樣性在放牧處理下是協(xié)同發(fā)展的，放牧使微生物活性和種類都增加了。

盡管 Biolog方法能得到很大的微生物代謝功能信息量，但無(wú)法得到微生物群落結(jié)構(gòu)的信息。因此，我們僅通過(guò)此方法分析不同返青期休牧處理下微生物活動(dòng)與碳代謝功能，而不考慮微生物類群的變化，尤其跟土壤碳氮比等理化性質(zhì)密切相關(guān)的土壤微生物真菌細(xì)菌比的變化。我們用土壤理化性質(zhì)與土壤微生物碳代謝功能信息做冗余度分析（RDA）試圖去尋找微生物群落碳代謝的解釋因子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)土壤有機(jī)碳顯著影響了微生物群落碳代謝特征。相似地，Degen et al.（2000）的研究發(fā)現(xiàn)土壤有機(jī)碳顯著影響碳代謝多樣性。李飛等（2018）在高寒濕地和草甸的研究也表明碳氮比、含水量、有機(jī)碳、全氮、容重、覆蓋度、氮磷比和pH對(duì)土壤微生物碳代謝功能多樣性有顯著的影響。我們的研究中土壤全磷、微生物碳氮比、硝態(tài)氮和微生物量氮也影響微生物群落碳代謝特征，但并未達(dá)到顯著水平。

雖然 Biolog的結(jié)果無(wú)法直接說(shuō)明休牧后土壤質(zhì)量得到一定的恢復(fù)或者改善，但土壤微生物墑（微生物量碳/有機(jī)碳）被解釋為基質(zhì)的有效性和微生物固持土壤碳的量，反映了土壤中活性有機(jī)碳所占比例，是監(jiān)測(cè)土壤有機(jī)質(zhì)的一個(gè)有用參數(shù)（徐一蘭等，2016；易桂田等，2017）。微生物墑高是由于微生物利用有機(jī)質(zhì)的效率高，可作為檢測(cè)土壤被擾動(dòng)的指數(shù)，微生物墑逐步提高意味著土壤擾動(dòng)逐步降低而土壤恢復(fù)逐步提高，微生物細(xì)胞固持更多的有機(jī)碳，碳的周轉(zhuǎn)率逐步提高。我們的研究中休牧50 d的微生物熵最大，因此，土壤微生物熵在不同休牧處理間所呈現(xiàn)的規(guī)律間接證明了休牧降低土壤擾動(dòng)，土壤在慢慢恢復(fù)。

4 結(jié)論

綜上所述，我們對(duì)高寒草甸生態(tài)系統(tǒng)設(shè)置返青期不同休牧期的試驗(yàn)處理，通過(guò)測(cè)定土壤微生物群落碳代謝特征及其土壤理化各因子，結(jié)果表明對(duì)照不休牧樣地土壤微生物群落代謝活性較強(qiáng)，適度的放牧活動(dòng)能提高高寒草甸土壤微生物群落代謝特征。休牧20 d處理下，微生物利用醇類物質(zhì)顯著高于其他處理。土壤有機(jī)碳顯著影響了微生物群落碳代謝特征。休牧50 d的微生物熵最大，證明休牧降低土壤擾動(dòng)，土壤在慢慢恢復(fù)。我們的研究可為高寒牧區(qū)放牧休牧措施提供土壤方面的基礎(chǔ)信息，并且從土壤方面對(duì)休牧措施給出科學(xué)理論基礎(chǔ)。