免疫細胞化學p16/Ki-67雙染檢測對宮頸細胞學陰性且HR-HPV陽性病例的分流作用及組織學LSIL的轉歸預測價值

邱曉陽，王少洪，鄭 璟，吳 璇，王媛媛，劉 君，葉才果

1.汕頭市中心醫(yī)院病理科，廣東 汕頭 515031；2.汕頭市中心醫(yī)院檢驗科，廣東 汕頭 515031；3.中山大學腫瘤防治中心病理科，廣東 廣州 510060；4.廣東醫(yī)科大學廣東省醫(yī)學分子診斷重點實驗室，廣東 東莞 523808

宮頸癌是危害女性健康的第四大惡性腫瘤，全球每年宮頸癌的新發(fā)病例數(shù)大約為53萬例，中國的死亡病例數(shù)約為2.6萬例［1-2］。宮頸癌是目前唯一病因明確為人乳頭狀瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染，可通過開展合適的篩查，及早發(fā)現(xiàn)并有效降低發(fā)生率的癌癥［3］。對于30歲以上的已婚女性目前常用的聯(lián)合篩查策略是細胞學+高危型HPV（high-risk HPV，HR-HPV）檢測［4］。細胞學陰性、HR-HPV陽性是常見的聯(lián)合篩查異常結果，對于這種結果目前婦產(chǎn)科的處理流程是轉診陰道鏡。Sun等［5］和Liu等［6］研究發(fā)現(xiàn)，平均隨訪2年，2.4%細胞學陰性、HR-HPV陽性患者為宮頸上皮內(nèi)瘤變2級（cervical intraepithelial neoplasia 2，CIN2）。Yang等［7］研究報道宮頸細胞學陰性且HR-HPV陽性3年CIN3+累積風險約為6.8%。顯而易見，過高的陰道鏡轉診率造成了大量的醫(yī)療資源浪費。目前對于組織學為低度鱗狀上皮內(nèi)病變（low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）的臨床處理共識是無需臨床手術或藥物治療，僅需追蹤隨訪［8］。Segura等［9］針對一項大樣本量的初次陰道鏡組織學LSIL患者隨訪1年，有65%的患者自然消退，20%的患者病變持續(xù)，但仍然有15%的患者病變進展。因此，尋找一種客觀的分子指標來指導細胞學陰性、HR-HPV陽性患者進行分流管理，明確組織學LSIL患者宮頸病變風險，是臨床迫切需要解決的問題。本研究擬為尋找一種對宮頸細胞學陰性且HR-HPV陽性患者具有分流作用及組織學LSIL患者轉歸具有預測價值的生物學指標提供實驗依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 標本來源

收集2017年4月—2018年7月于汕頭市中心醫(yī)院和中山大學腫瘤防治中心經(jīng)宮頸篩查細胞學陰性且HR-HPV陽性的708例已婚女性患者為研究對象，患者均進行了初次陰道鏡檢查并在宮頸脫落細胞標本中完成了p16/Ki-67雙染檢測，患者年齡30.6～78.5歲，平均年齡（41.3±9.6）歲。對初次陰道鏡病理學檢查結果為LSIL的患者隨訪1年，每6個月使用細胞學+HR-HPV篩查1次，除細胞學和HR-HPV陰性檢測結果外，其他再行陰道鏡活檢術，取活體組織進行病理學檢查的病例59例。研究對象的納入標準：①非妊娠期；② 非生理期；③無宮頸疾病治療史；④ 無免疫系統(tǒng)疾??；⑤ 簽署知情同意書。

1.2 試劑與儀器

免疫細胞化學法p16/Ki-67雙染檢測試劑盒（包含雙染試劑盒專用抗原修復液、內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑、即用型組合一抗、即用型酶標第二抗體、顯色劑、蘇木精染色液。備案號：閩榕械備20180037號）購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。HB-300C HPV化學發(fā)光免疫分析儀購自嘉興科瑞迪醫(yī)療器械有限公司。HPV核酸檢測試劑盒購自杭州德同生物技術有限公司。ThinPrep2000細胞學制片儀購自北京豪洛捷醫(yī)療科技有限公司。

1.3 宮頸細胞學標本制備

在ThinPrep2000細胞學制片儀中，按儀器說明書操作規(guī)程制作細胞學薄片，將細胞學薄片固定于95%乙醇中30 min、巴氏染色，由2名資深病理科醫(yī)師進行診斷，診斷術語參考最新的細胞學TBS分類系統(tǒng)［10］。文中細胞學陰性指細胞學結果＜非典型鱗狀上皮細胞（atypical squamous cells of undetermined significance，ASCUS）。

1.4 宮頸組織學標本制作

宮頸組織放入4%甲醛溶液中固定，經(jīng)過脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、裱片、蘇木精-伊紅染色等步驟完成石蠟切片制作。由2名資深病理科醫(yī)師進行確診，依據(jù)為《世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）女性生殖器官腫瘤學分類（第4版）解讀》［11］。文中LSIL指CIN1。

1.5 p16/Ki-67雙染檢測流程及判讀標準

1.5.1 p16/Ki-67雙染檢測流程

細胞固定（宮頸細胞薄片置于95%乙醇中，浸泡30 min）、抗原修復（抗原修復液隔水加熱至95 ℃，修復20 min，自然冷卻，磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）沖洗3 min×2次）、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶（加100 μL H2O2，室溫下溫育10 min，PBS沖洗3 min×3次）、加即用型組合一抗（加100 μL一抗，室溫下溫育60 min，PBS沖洗3 min×3次）、加即用型酶標第二抗體（加100 μL二抗，室溫下溫育15 min，PBS沖洗3 min×3次）、加顯色液A（加100 μL顯色劑A，顯色10～15 min，PBS沖洗3 min×3次）、加顯色液B（加100 μL顯色劑B，顯色5 min，流水沖洗終止顯色）、復染（加100 μL蘇木精染色液20 s，流水沖洗，PBS沖洗返藍，流水沖洗）、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。

1.5.2 p16/Ki-67判讀標準

陽性結果指細胞薄片中同一個細胞內(nèi)細胞質(zhì)呈紅色著色（p16染色陽性）且細胞核呈棕黃色著色（Ki-67染色陽性），陰性結果指細胞薄片中僅為細胞核有蘇木精襯染的淺藍色，或細胞質(zhì)呈紅色著色（p16染色陽性），亦或細胞核呈棕黃色著色（Ki-67染色陽性）［12-13］。

1.6 HPV檢測及判讀標準

HPV DNA檢測采用的是雜交捕獲-化學發(fā)光法，檢測原理為：樣本中的HPV病毒雙鏈DNA變性解開成單鏈，單鏈DNA與特異性RNA探針結合為DNA-RNA雜合體，DNA-RNA雜合體與捕獲微孔板上的特異性抗體結合固定在捕獲微孔板上，再與偶聯(lián)有堿性磷酸酶的抗DNA-RNA雜合體的特異性抗體結合，酶促化學發(fā)光，檢測樣本中的HPV DNA含量。參照試劑說明書，檢測過程為變性、雜交、捕獲、檢測、洗板、化學發(fā)光等步驟。該試劑盒用于體外定性檢測子宮頸脫落細胞樣本中的2種（HPV16、18型）和12種（HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68型）HPV的核酸。所有的檢測均以樣本測量值/參考值的比值表示，比值≥1.0，結果為“陽性”；比值＜1.0，結果為“陰性”。

1.7 HPV感染亞型的分組

根據(jù)HPV感染亞型的不同，分為3組。第1組，HPV其他12亞型組（限于HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68亞型中有一個亞型以上為陽性結果即納入本組中），患者年齡30.9～72.3歲，平均年齡（42.6±8.7）歲。第2組，HPV16/18亞型組（限于HPV16或18亞型中有一個亞型以上為陽性結果即納入本組中），患者年齡30.6～76.9歲，平均年齡（40.5±10.1）歲。第3組，同時陽性組（HPV16/18亞型組+HPV其他12亞型組同時陽性才納入本組中）?；颊吣挲g32.3～78.5歲，平均年齡（41.8±9.3）歲。3組間年齡差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

1.8 宮頸組織學LSIL病變的轉歸分類

初次陰道鏡組織學檢查結果為LSIL的轉歸包括3種情況。第1種情況，再次組織學檢查結果低于LSIL的患者為消退。第2種情況，再次組織學檢查結果維持LSIL的患者為持續(xù)。第3種情況，再次組織學檢查結果高于LSIL，包括CIN2、CIN3和宮頸癌的患者為進展。

1.9 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)處理。計數(shù)資料：率的比較、靈敏度和特異度的比較采用χ2檢驗。計量資料的比較采用方差分析。靈敏度是指由組織學診斷為陽性的病例中，經(jīng)p16/Ki-67雙染檢測為陽性例數(shù)的比例。特異度是指由組織學診斷為陰性的病例中，經(jīng)p16/Ki-67雙染檢測為陰性例數(shù)的比例。符合率是指p16/Ki-67雙染檢測中真陽性和真陰性之和占總受檢人數(shù)的比例。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 p16/Ki-67雙染的圖像

生物顯微鏡下的細胞學薄片中，宮頸鱗狀上皮細胞p16/Ki-67雙染的圖像分為兩類。一類為p16/Ki-67雙染陰性，包括：①p16/Ki-67染色均為陰性（僅為細胞核有蘇木精襯染的淺藍色）；② p16單染色陽性（細胞質(zhì)呈紅色著色）；③Ki-67單染色陽性（細胞核呈棕黃色著色）。另一類為p16/Ki-67雙染陽性（同一個細胞內(nèi)細胞質(zhì)呈紅色著色且細胞核呈棕黃色著色，圖1）。

圖1 p16/Ki-67雙染的圖像Fig.1 p16/Ki-67 double dye image

2.2 p16/Ki-67雙染陽性與初次陰道鏡組織病理學檢查結果的關系

708例就診患者中有165例患者p16/Ki-67雙染陽性，雙染陽性率為23.31%（165/708）。543例患者p16/Ki-67雙染陰性，雙染陰性率為76.69%（543/708）。在初次進行陰道鏡組織病理學檢查的223例患者中，p16/Ki-67雙染陽性患者有12例患者為CIN2，41例患者為CIN3，2例患者為宮頸癌。p16/Ki-67雙染陰性患者有4例患者為CIN2，2例患者為CIN3。p16/Ki-67雙染陽性患者中CIN2+的發(fā)生率［33.33%（55/165）］與p16/Ki-67雙染陰性患者中CIN2+的發(fā)生率［1.10%（6/543）］相比差異有統(tǒng)計學意義（χ2=166.94，P＜0.001）。p16/Ki-67雙染陽性患者中CIN3+的發(fā)生率［26.06%（43/165）］與p16/Ki-67雙染陰性患者中CIN3+的發(fā)生率［0.37%（2/543）］相比差異有統(tǒng)計學意義（χ2=140.35，P＜0.001）。

2.3 p16/Ki-67雙染檢測診斷HR-HPV陽性而液基薄層細胞學檢查（thinprep cytology test，TCT）陰性患者的CIN2/CIN3效能

針對本研究中HR-HPV陽性而TCT陰性的患者，以初次組織病理學檢查結果為金標準，p16/Ki-67雙染診斷該群體患者的CIN2/CIN3整體效能較高。p16/Ki-67雙染對該群體患者的CIN2+和CIN3+病變診斷的靈敏度、特異度和符合率之間差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05，表1）。

表1 p16/Ki-67雙染檢測診斷HR-HPV陽性而TCT陰性患者的CIN2/CIN3效能Tab.1 Efficacy of p16/Ki-67 double staining in the diagnosis of CIN2/CIN3 in HR-HPV positive but TCT negative patients (n)

2.4 p16/Ki-67雙染陽性率在不同HPV亞型感染組之間的差異

708例就診患者中，HPV其他12亞型組、HPV16/18亞型組、同時陽性組所占的比例分別為71.89%（509/708）、20.76%（147/708）、7.34%（52/708）。3組對應的p16/Ki-67雙染陽性率分別為18.66%（95/509）、29.25%（43/147）、51.92%（27/52）。上述3組的陽性率經(jīng)χ2趨勢檢驗分析，有遞增趨勢（趨勢χ2=29.119，P＜0.001）。且3組間p16/Ki-67雙染陽性率總體差異有統(tǒng)計學意義（χ2=32.869，P＜0.001）。進一步進行兩兩比較，同時陽性組的p16/Ki-67雙染陽性率分別與HPV其他12亞型組（χ2=30.668，P＜0.001）、HPV16/18亞型組（χ2=8.658，P=0.003）相比差異均有統(tǒng)計學意義。HPV16/18亞型組的p16/Ki-67雙染陽性率與HPV其他12亞型組相比差異有統(tǒng)計學意義（χ2=7.697，P=0.006）。

2.5 不同p16/Ki-67雙染表達對組織學LSIL患者轉歸的預測價值

對初次陰道鏡活檢術組織病理學檢查結果為LSIL的患者進行隨訪1年，每6個月使用細胞學+HR-HPV進行篩查1次，除細胞學和HPV陰性檢測結果外，其他均再次行陰道鏡活檢術，必要時再次取活檢病理學檢查的病例59例。8例LSIL病變進展的患者中，有6例p16/Ki-67雙染陽性，2例p16/Ki-67雙染陰性，p16/Ki-67雙染陽性診斷LSIL病變進展率是p16/Ki-67雙染陰性的3倍。22例LSIL病變持續(xù)的患者中，有12例p16/Ki-67雙染陽性，10例p16/Ki-67雙染陰性，p16/Ki-67雙染陽性診斷LSIL病變持續(xù)率是p16/Ki-67雙染陰性的1.2倍。29例LSIL病變消退的患者中，有3例p16/Ki-67雙染陽性，26例p16/Ki-67雙染陰性。

3 討 論

中國35～64歲的適齡女性需要接受宮頸癌篩查人數(shù)約3億［14］。2009—2017年累計篩查人數(shù)約為7 000萬，占實際需要篩查人數(shù)的23.33%［15］。面對數(shù)量龐大的篩查人群，準確、簡便、高效的篩查手段顯得尤為重要。當前，細胞學聯(lián)合HRHPV檢測是篩查宮頸癌的共識。但是，細胞學篩查面臨的問題在于主觀性強，依賴病理科醫(yī)師的經(jīng)驗，靈敏度較低，容易出現(xiàn)漏診。HPV檢測無法區(qū)分一過性感染和轉化型HPV感染。細胞學陰性、HR-HPV陽性的篩查結果是臨床常見的異常類型。從邏輯上說，只有HPV感染持續(xù)才會有細胞學陽性，HPV感染首先發(fā)生細胞學的變化，但是過高的HPV一過性陽性反而增加了患者的心理壓力，且細胞學取材具有局限性，還與操作者和閱片者水平差異相關，漏診的情況時有發(fā)生。目前臨床上對于細胞學陰性、HR-HPV陽性患者的處理，大量陰道鏡轉診容易造成過度醫(yī)療，而對于組織學LSIL尚缺乏早期風險預測指標。因此，尋找一種客觀的能用于對細胞學陰性、HR-HPV陽性患者的分流管理，明確組織學LSIL宮頸病變風險的生物學指標具有重要的臨床價值。

p16蛋白是細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑［16］。p16過表達提示宮頸細胞處于細胞周期的阻滯期。Ki-67標記指數(shù)反映細胞周期進展及增殖活躍［17］。Ki-67染色陽性提示宮頸細胞處于細胞周期的增殖期。p16和Ki-67同時陽性，則提示細胞周期調(diào)控失調(diào)。正常生理狀態(tài)下，p16和Ki-67的表達相互制約，達到一種動態(tài)平衡的狀態(tài)，且不會同時出現(xiàn)于同一個細胞中。

通過本文p16/Ki-67雙染表達與初次陰道鏡組織病理學檢查結果的實驗數(shù)據(jù)，進一步驗證了p16/Ki-67雙染檢測可作為細胞周期失調(diào)的標志物，有助于識別病變細胞。與Van Zummeren等［18］認為的p16與Ki-67雙染可獨立于形態(tài)學找出“癌變”細胞的研究觀點相一致。

盡管根據(jù)《WHO女性生殖器官腫瘤學分類（第4版）解讀》［11］，CIN被分為LSIL和高度上皮內(nèi)瘤變（high-grade intraepithelial neoplasia，HSIL）。由于《中國子宮頸癌篩查及異常管理相關問題專家共識（二）》［8］指出CIN2中的p16/Ki-67雙染陰性的患者仍然歸屬于LSIL。為了更精準地與婦科診治工作相結合，本文仍然進一步把HSIL細分為CIN2和CIN3，分別進一步觀察了p16/Ki-67雙染檢測對HR-HPV陽性而TCT陰性患者的CIN2/CIN3診斷效能。本研究結果顯示，當p16/Ki-67檢測陽性時，可強烈提示高級別病變，為區(qū)分潛在高級別病變提供了客觀的檢測指標，與許淑霞等［19］的研究結論相同。

文中p16/Ki-67雙染陽性率在不同亞型HPV感染組之間的差異，可反映p16/Ki-67雙染陽性率與不同亞型HPV感染組的相關性。尤其是對于同時陽性組和HPV16/18亞型組的患者應高度重視，謹慎處理，密切隨訪，與Rodríguez-Trujillo等［20］和王海瑞等［21］研究認為的p16/Ki-67雙染陽性在HPV16/18婦女進展為HSIL/CIN2+和HRHPV持續(xù)存在的風險很高的研究結論基本一致。

盡管約65%的LSIL會自然消退，臨床上可僅觀察隨訪［22］。但是對于15%的宮頸病變可能進展的患者的預測價值仍然值得重視。本研究從不同的p16/Ki-67雙染結果探討了組織學LSIL患者的轉歸，發(fā)現(xiàn)p16/Ki-67雙染陰性患者的轉歸結局優(yōu)于p16/Ki-67雙染陽性的患者。因此，對于p16/Ki-67雙染陽性的患者，臨床上應重點關注，注意運用多學科進行排查，密切追蹤復查，及時預測和發(fā)現(xiàn)HSIL等病變，做到早診斷、早治療。本研究結論與王宇華等［23］報道的p16/Ki-67有利于預警宮頸病變轉歸的觀點一致。

p16/Ki-67雙染檢測作為新興的宮頸癌篩查技術，取材方式無創(chuàng)，患者依從性好；判讀客觀明確，可減輕診斷醫(yī)師的閱片負擔；實驗過程無需特殊的儀器，可降低運行的成本，適合在各個層級的醫(yī)院開展，尤其適用于欠發(fā)達地區(qū)的宮頸癌篩查。本研究結果顯示，p16/Ki-67雙染檢測對于甄別HR-HPV陽性而TCT陰性患者的CIN2/CIN3具有較高的靈敏度和特異度，能夠彌補細胞學檢查靈敏度的不足，減少漏診，可明確宮頸病變風險，為臨床上宮頸細胞學陰性且HR-HPV陽性的檢測結果提供分流管理指導，對于組織學結果為LSIL的患者轉歸也具有較好的預測價值，具有在臨床上推廣使用的潛能。