高效液相色譜測(cè)定甲酸鹽中的甲酸

萬(wàn) 宇，譚子璇，嚴(yán)欣茹，吳 兵

（四川吉隆達(dá)生物科技集團(tuán)有限公司，四川 廣漢 618300）

抗生素應(yīng)用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)的歷史可追溯到20世紀(jì)40 年代，抗生素能有效防治動(dòng)物疾病，提高動(dòng)物生產(chǎn)性能，大幅提高養(yǎng)殖效益，使畜禽的大規(guī)模工廠化養(yǎng)殖成為可能。然而，隨著人類(lèi)對(duì)抗生素認(rèn)識(shí)的不斷加深，抗生素所產(chǎn)生的副作用也越來(lái)越受到關(guān)注。近年來(lái)，抗生素的濫用問(wèn)題給人類(lèi)帶來(lái)了巨大的困擾：抗生素使用不當(dāng)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，產(chǎn)生超級(jí)細(xì)菌；抗生素的濫用，會(huì)造成藥物殘留超標(biāo)，導(dǎo)致動(dòng)物免疫力下降，嚴(yán)重影響動(dòng)物源性食品安全；抗生素作為飼料添加劑使用，給人類(lèi)健康和生態(tài)系統(tǒng)帶來(lái)了明顯危害。歐盟早在2006 年就已全面禁止抗生素作為飼料添加劑使用，美國(guó)也于2017 年開(kāi)始禁止在飼料中使用預(yù)防性抗生素。在飼料中禁止添加抗生素已是大勢(shì)所趨，為維護(hù)我國(guó)動(dòng)物源性食品安全和公共衛(wèi)生安全，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布第194 號(hào)公告，禁用促生長(zhǎng)類(lèi)藥物飼料添加劑。飼料禁抗迫在眉睫，酸化劑是目前主流的替抗選擇。酸化劑當(dāng)中，甲酸因具有良好的抑菌效果受到人們的關(guān)注。甲酸又名蟻酸，分子式為HCOOH，相對(duì)分子質(zhì)量46.03。甲酸是一種小分子有機(jī)酸，對(duì)大腸桿菌和沙門(mén)氏菌等微生物有一定的抑制作用，但是由于甲酸有較大的刺激氣味且腐蝕性強(qiáng)，限制了甲酸在飼料中的應(yīng)用，而具有穩(wěn)定性質(zhì)和較強(qiáng)緩沖能力的甲酸鹽更適宜于飼料加工。甲酸鹽的物理性質(zhì)穩(wěn)定，不易吸潮，流動(dòng)性好，pH 接近中性，不會(huì)造成生產(chǎn)設(shè)備的腐蝕，利于飼料加工。在動(dòng)物體內(nèi)，甲酸鹽是動(dòng)物組織和血液的天然成分，合理添加不會(huì)對(duì)動(dòng)物的健康造成危害。甲酸鹽可以在酸性條件下游離出甲酸，能有效降低胃腸道的pH，且具有緩沖功效，有利于胃腸道pH 的穩(wěn)定，抑制有害細(xì)菌的繁殖，促進(jìn)有益微生物的生長(zhǎng)，防止和減少仔豬腹瀉、下痢等現(xiàn)象的發(fā)生，提高飼料的消化吸收率。甲酸鈣在飼料中的應(yīng)用較早，1998年，農(nóng)業(yè)部發(fā)布了14 類(lèi)飼料添加劑，甲酸鈣位列其中。試驗(yàn)表明，在仔豬斷奶后幾周的飼料中添加甲酸鈣可以提高仔豬生長(zhǎng)速率，提高飼料轉(zhuǎn)化率，并減少仔豬的發(fā)病率。同時(shí)，甲酸鈣還有防霉保鮮的功效，在青貯飼料中添加甲酸鈣，可提高乳酸的含量，抑制丁酸的產(chǎn)生，增加青貯飼料的營(yíng)養(yǎng)成分和風(fēng)味。二甲酸鉀是一種有機(jī)酸鹽，分子式為HCOOH·HCOOK，是由甲酸鉀和甲酸分子通過(guò)氫鍵結(jié)合而成的二聚體，相對(duì)分子質(zhì)量為130.14，在酸性條件下穩(wěn)定，在堿性條件下分解為甲酸和甲酸鉀。二甲酸鉀是歐盟批準(zhǔn)的第一種用于替代抗生素促生長(zhǎng)的非抗生素飼料添加劑，我國(guó)于2005 年批準(zhǔn)其作為飼料添加劑。字正浩研究表明，在仔豬基礎(chǔ)日糧中，添加二甲酸鉀可以提高飼料利用率，提高斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能和健康水平；和復(fù)合抗生素相比，在減少腸道內(nèi)容物腸桿菌數(shù)量的同時(shí)，不會(huì)抑制胃腸道內(nèi)容物中乳酸桿菌數(shù)量[1]。林文爽研究表明，二甲酸鉀具有良好的防霉效果，與甲酸防霉性能相當(dāng)，且比甲酸更適合用于飼料添加劑[2]。可在替代抗生素促生長(zhǎng)的同時(shí)，替代常用飼料防霉劑，降低飼料生產(chǎn)成本。銅、鐵等金屬離子催化自由基反應(yīng)的能力很強(qiáng)并能催化電子傳遞反應(yīng)，對(duì)飼料和預(yù)混料中的維生素有破壞作用，造成維生素的損失。甲酸鹽為絡(luò)合物，金屬離子與甲酸通過(guò)配位健結(jié)合，不易電離，比硫酸鹽等無(wú)機(jī)鹽產(chǎn)生更少的金屬離子。趙金偉研究了甲酸鹽（鐵、鋅、銅）及硫酸錳組合效應(yīng)對(duì)維生素穩(wěn)定性的影響，結(jié)果表明，甲酸亞鐵、甲酸鋅及甲酸銅的組合與硫酸亞鐵、硫酸鋅及硫酸銅的組合相比，可減少預(yù)混料中維生素A和煙酰胺的損失[3]。

目前，測(cè)定甲酸的方法常用的有氧化還原滴定法、離子色譜法、高效液相色譜法和氣相色譜法[4-10]。其中，氧化還原滴定法是通過(guò)高錳酸鉀與甲酸定量反應(yīng)，過(guò)量的高錳酸鉀在酸性條件下，將碘化鉀氧化成單質(zhì)碘，析出的碘用硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定，間接法測(cè)定甲酸含量，很多有還原性的雜質(zhì)會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成干擾。氧化還原滴定法常用于鉆井液中甲酸鉀和甲酸鈉的測(cè)定，在甲酸鈣、二甲酸鉀等金屬價(jià)態(tài)穩(wěn)定的甲酸鹽中可以推廣使用，但不適用于變價(jià)金屬鹽（銅、鐵、錳等）中甲酸含量的測(cè)定；氣相色譜需要將甲酸轉(zhuǎn)化成衍生物，操作較繁瑣，硅膠管的解析效率不穩(wěn)定，檢測(cè)結(jié)果相對(duì)偏差較大。離子色譜和高效液相色譜法檢測(cè)甲酸含量是普遍使用的方法，離子色譜通過(guò)純水提取甲酸根離子，并經(jīng)固相萃取柱凈化，以氫氧化鉀溶液淋洗，陰離子交換柱分離，電導(dǎo)檢測(cè)器檢測(cè)；和離子色譜相比，高效液相色譜儀的普及率更高，本文采用高效液相色譜法檢測(cè)甲酸鹽（銅、錳、鋅、亞鐵）中甲酸的含量。甲酸是一種酸性較強(qiáng)的有機(jī)酸，pKa 為3.745，在水中有很大的電離，大部分以離子形式存在，在色譜柱上保留較少，故常采用抑制電離的方法將甲酸轉(zhuǎn)化為分子形式在色譜柱上保留。

目前，甲酸的高效液相色譜測(cè)定多使用磷酸及其鹽作流動(dòng)相，鄭婷等使用流動(dòng)相為0.1 mol·L-1磷酸二氫鈉緩沖溶液:乙腈=98:2，磷酸調(diào)節(jié)pH=2[11]；黃志英等采用的流動(dòng)相為乙腈+0.02%磷酸溶液（5+95，v/v）[12]；雷萍等用0.404 g 庚烷磺酸鈉用純水溶解后，加入0.2 mL磷酸，定容至1 L配制成緩沖液，緩沖液:乙腈=90:10[13]。磷酸及其鹽在有機(jī)酸的檢測(cè)中應(yīng)用比較廣泛，但和很多金屬離子易產(chǎn)生不溶物，會(huì)對(duì)設(shè)備和檢測(cè)結(jié)果造成影響，樣品不能直接進(jìn)樣，需進(jìn)行前處理，操作比較繁瑣，且容易產(chǎn)生損耗、影響檢測(cè)精度。本文采用稀硫酸溶液作為流動(dòng)相，操作簡(jiǎn)捷，同時(shí)避免了由于化學(xué)沉淀所引起的測(cè)定誤差。

1 試驗(yàn)材料

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀（WUFENG LC-UV100 plus）；分析天平（感量為0.0001 g）；超聲波清洗器；微孔濾膜（孔徑0.45 μm）；甲酸（標(biāo)準(zhǔn)品）；乙腈（色譜純）；甲醇（色譜純）；硫酸（分析純）；水（超純水）；甲酸銅（自制）；甲酸鋅（自制）；甲酸錳（自制）；甲酸亞鐵（自制）。

1.2 色譜及檢測(cè)條件

色譜柱：C18柱，長(zhǎng)250 mm，內(nèi)徑4.6 mm，粒度5 μm（極性色譜柱）；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：0.0275%硫酸溶液；流速：1 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：206 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2 方法與結(jié)果

2.1 pH的選擇

考慮到一般色譜柱的耐酸能力，使用流動(dòng)相的pH 范圍2≤pH≤9，根據(jù)甲酸的電離常數(shù)，流動(dòng)相的pH選擇2.5，即硫酸溶液的濃度為0.0275%。由于未添加緩沖物質(zhì)，試樣直接用水定容容易造成pH不穩(wěn)定，導(dǎo)致出現(xiàn)負(fù)峰，見(jiàn)圖1。經(jīng)試驗(yàn)，試樣溶液用流動(dòng)相溶解并定容能夠消除pH 不穩(wěn)定造成的影響，不需添加緩沖物質(zhì)，增加操作步驟。

圖1 甲酸亞鐵樣品色譜（未用流動(dòng)相定容）

2.2 溶劑和波長(zhǎng)的選擇

甲醇的截止波長(zhǎng)為205 nm，乙腈的截止波長(zhǎng)為190 nm，甲酸在206 nm 處有最大吸收。為避免干擾，波長(zhǎng)選用210 nm 進(jìn)行試驗(yàn)。流動(dòng)相中分別添加5%的甲醇和乙腈進(jìn)樣，結(jié)果表明添加甲醇和乙腈均會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成干擾。減小甲醇和乙腈的比例，仍有不同程度的干擾。甲酸的極性較強(qiáng)，保留時(shí)間靠前，不需要加入有機(jī)相進(jìn)行調(diào)整，波長(zhǎng)調(diào)整至206 nm，甲酸有更好的吸收。不同的金屬離子在甲酸出峰前均有不同程度的峰響應(yīng)，加入甲醇和乙腈均使甲酸出峰時(shí)間前移，不利于峰分離，故本文流動(dòng)相中未添加。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作液的制備

稱(chēng)取甲酸標(biāo)準(zhǔn)品適量，配制成20 mg·mL-1的甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取1、2、3、4、5 mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液于100 mL容量瓶中，用流動(dòng)相定容至刻度，混勻。得到濃度分別為200、400、600、800、1 000 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

圖2 甲酸標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜

2.4 試樣溶液的制備

稱(chēng)取試樣約0.1 g（精確至0.000 1 g），用流動(dòng)相溶解并定容于100 mL 容量瓶中，搖勻。取部分溶液過(guò)0.45 μm濾膜，濾液作為試樣溶液。

2.5 線(xiàn)性關(guān)系分析

分別取標(biāo)準(zhǔn)工作液（2.3）和試樣溶液（2.4），按（1.2）列出的條件進(jìn)行液相色譜分析測(cè)定。甲酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見(jiàn)圖2。測(cè)定中應(yīng)調(diào)整試樣溶液的濃度，使甲酸濃度落在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的相應(yīng)范圍內(nèi)。

標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度由低至高進(jìn)行進(jìn)樣，以標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)（Y），標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)（X），作線(xiàn)性回歸方程：

R2=0.9999，Y=1.3444X-11.323

2.6 精密度試驗(yàn)

取同1 份樣品，相同體積20 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次平行測(cè)定（n=6），結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一樣品（甲酸鋅Zn-2020050503），按試樣溶液制備方法平行制備6份測(cè)定。甲酸含量平均值為47.48%，RSD為0.6%。甲酸鋅樣品色譜見(jiàn)圖3。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

準(zhǔn)確吸取已知濃度的樣品加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照試樣溶液方法制備試樣溶液，測(cè)定結(jié)果平均回收率為98.8%，RSD為0.8%。

圖3 甲酸鋅樣品色譜

表2 不同甲酸鹽樣品的測(cè)定

2.9 樣品測(cè)定

分別取不同批次的甲酸鹽樣品，按照試樣溶液方法制備，分別進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2（n=3）。甲酸銅、甲酸錳、甲酸亞鐵樣品色譜分別見(jiàn)圖4～圖6。

結(jié)果表明，按照本文方法對(duì)不同的甲酸鹽樣品進(jìn)行測(cè)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為-0.5%～0.3%，峰型良好，干擾小，準(zhǔn)確度高。

圖4 甲酸銅樣品色譜

圖5 甲酸錳樣品色譜

圖6 甲酸亞鐵樣品色譜

3 討論與分析

本文為簡(jiǎn)化操作步驟，流動(dòng)相未添加緩沖物質(zhì)，樣品處理時(shí)直接用流動(dòng)相溶解并定容。從結(jié)果看，峰型穩(wěn)定，分離度好，無(wú)干擾。但本文僅選取了部分具有代表性的甲酸鹽進(jìn)行試驗(yàn)，不能代表所有甲酸鹽的性質(zhì)，且不同儀器設(shè)備的性能可能存在差異。若仍出現(xiàn)pH 不穩(wěn)定的情況，可考慮加入適量硫酸銨進(jìn)行調(diào)節(jié)，通過(guò)銨鹽的緩沖增強(qiáng)穩(wěn)定性，但高濃度的硫酸-硫酸銨體系可能會(huì)對(duì)色譜柱和泵產(chǎn)生一定的影響。

樣品用流動(dòng)相溶解有利于保持試樣溶液的穩(wěn)定性。甲酸鹽基本呈中性，亞鐵離子、二價(jià)錳離子有較強(qiáng)的還原性，亞鐵離子在pH＞5時(shí)，極易氧化成三價(jià)鐵，三價(jià)鐵溶解度極低，易沉淀析出；二價(jià)錳離子在中性或堿性條件下也易氧化成四價(jià)錳，形成二氧化錳析出。沉淀的產(chǎn)生會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生干擾，流動(dòng)相定容使樣品溶液呈酸性，避免氧化。對(duì)比圖1和圖2可以看出，試驗(yàn)溶液pH的降低同時(shí)增大了金屬離子的電離，金屬離子的峰響應(yīng)明顯降低，降低了對(duì)甲酸檢測(cè)的干擾。

該方法可以推廣到大部分甲酸鹽的檢測(cè)，部分與硫酸根易產(chǎn)生沉淀的金屬離子（如鋇離子、銀離子等）不適用于該方法。

4 結(jié) 論

目前，甲酸鈣和二甲酸鉀已在飼料中大量使用，甲酸銅、鋅、鐵等在飼料中可作為硫酸鹽的替代品，有潛在應(yīng)用價(jià)值，但我國(guó)均無(wú)相應(yīng)的國(guó)家或行業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，其生產(chǎn)都是參照企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。各企業(yè)采用的生產(chǎn)工藝不同，部分企業(yè)副產(chǎn)甲酸鹽，產(chǎn)品中可能會(huì)帶入部分雜質(zhì)，導(dǎo)致產(chǎn)品的質(zhì)量狀況差異較大，不利于甲酸行業(yè)的發(fā)展。與其他有機(jī)酸相比，甲酸價(jià)格便宜，抑菌效果好，是飼料替抗的主流選擇之一，在飼料中有良好的應(yīng)用前景。利用高效液相色譜法檢測(cè)甲酸鹽中的甲酸，方法簡(jiǎn)捷，檢測(cè)結(jié)果可信度高，能夠?qū)崿F(xiàn)甲酸的定性定量檢測(cè)，為甲酸鹽的質(zhì)量評(píng)估提供參考。