冠突散囊菌散茶發(fā)花工藝提高茯茶品質(zhì)

耶玉婷，茍擁軍，李長(zhǎng)風(fēng)，駱?gòu)I婷，胡慶元，陳衛(wèi)鋒，孟永宏

（1.陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安 710062；2.西安市長(zhǎng)安區(qū)氣象局，陜西西安 710199；3.陜西省生物農(nóng)業(yè)研究所，陜西西安 710043）

茶葉以其采制時(shí)間不同可分為春茶、夏茶和秋茶[1]。夏秋季節(jié)氣溫高、日照強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)代謝水平較高，茶葉中酚/氨比值較大，茶葉苦澀味重、口感差，品質(zhì)不及春茶，但是其茶多酚、花青素、咖啡堿含量高，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值大[2]。如能通過加工技術(shù)改善夏秋茶滋味，提高大眾接受度，將有效帶動(dòng)夏秋茶生產(chǎn)、提高茶農(nóng)的經(jīng)濟(jì)收入。目前，降低夏秋茶苦澀味主要方法有以下3種：一是選擇持嫩性好、酚/氨比低的鮮葉原料；二是通過遮陰、施肥等栽培手段改善茶葉品質(zhì)成分[3-5]；三是通過加工工藝的改進(jìn)來促進(jìn)茶葉品質(zhì)成分的轉(zhuǎn)化[6-8]。試驗(yàn)利用微生物發(fā)酵技術(shù)，對(duì)茶葉成分進(jìn)行轉(zhuǎn)化，減少苦澀味，改善其滋味和口感，以期創(chuàng)新一種新型的茯茶制造工藝，開發(fā)有特色的夏秋茶新產(chǎn)品，最終促進(jìn)夏秋茶資源的有效利用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

夏秋茶、茯磚茶，陜西涇陽茶廠提供；茯散茶，實(shí)驗(yàn)室自制。

沒食子酸、兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、表沒食子兒茶素（EGC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）和沒食子兒茶素沒食子酸酯（GCG） 6種標(biāo)準(zhǔn)品，分析純，Sigma公司提供；聚乙烯醇、葡萄糖對(duì)照品、石油醚（沸程30～60℃）、氧化鎂、甲醇，色譜純；18種氨基酸標(biāo)品（茶氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸、脯氨酸），分析純，西安晶博生物科技有限公司提供；咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)品，分析純，陜西帕尼爾生物科技有限公司提供。

1.1.2 儀器與設(shè)備

755B型紫外可見分光光度計(jì)，西安盛大儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；真空冷凍干燥器，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；高效液相色譜儀，美國Waters公司產(chǎn)品；全自動(dòng)氨基酸分析儀，日本HITACHI公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 冠突散囊菌的分離純化

參照胡治遠(yuǎn)等人[9]的方法，采用察氏培養(yǎng)基，從陜西涇陽茶廠茯磚茶中分離冠突散囊菌，于27.5℃下恒溫培養(yǎng)，挑選長(zhǎng)勢(shì)較好的菌落，采取平板劃線分離法，重復(fù)3～4次，得純培養(yǎng)的冠突散囊菌株。-80℃冰箱中甘油管保藏。

1.2.2 “散茶發(fā)花”制作茯散茶工藝

將冷凍管菌種接入察氏培養(yǎng)基，27.5℃恒溫條件下進(jìn)行菌種活化?；罨蟮木N接入PDA培養(yǎng)基，于27.5℃下恒溫培養(yǎng)得到斜面菌種。以夏秋茶和夏秋茶質(zhì)量50%的純凈水為種子培養(yǎng)基，27～29℃恒溫條件下，將菌種接入種子培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)培，得到三角瓶菌種。在相同條件下接種到發(fā)酵曲盤進(jìn)行發(fā)酵，培養(yǎng)周期根據(jù)預(yù)試驗(yàn)確定，然后在80～90℃條件下烘干。

1.2.3 茶葉水提取物的制備及其含量測(cè)定

精確稱取20.0 g磨碎茶樣，加雙蒸水煮沸，水沸騰后煮茶3次，每次600 mL，每次30 min。趁熱過濾，合并3次濾液，減壓濃縮，于真空冷凍干燥機(jī)中干燥成粉末后，取出稱量。得夏秋茶、茯磚茶、茯散茶水提取物分別為25.5%，25.6%，24.5%。

1.2.4 茶葉中多酚類物質(zhì)含量的測(cè)定

（1） 茶葉中茶多酚含量的測(cè)定。采用Folin Ciocalteu比色法[10]，堿性條件下，酚類物質(zhì)中的酚羥基能將Folin Ciocalteu試劑中的鎢鉬酸還原，生成藍(lán)色配合物，顏色的深淺與多酚含量呈正相關(guān)。

式中：A——測(cè)試液吸光度；

V——樣品體積，mL；

W——水提取物含量，%；

SLOPEstd——沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；

d——稀釋因子；m——取樣量，g。

（2）茶葉中兒茶素的測(cè)定。采用超高效液相色譜法[11]，色譜柱為Waters Acquity-BEH C18柱（1.7 μm，50 mm×2.5 mm）；流動(dòng)相為乙腈和0.1%甲酸，采用梯度洗脫，乙腈洗脫質(zhì)量濃度和時(shí)間為：9%（0）-9% （4 min） -12% （6 min） -25% （8 min） -9%（9 min） -9% （9.5 min），流速 0.25 mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)時(shí)間9.5 min，二極管陣列檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm。

式中：C1——兒茶素質(zhì)量濃度，μg/mL；

V1——樣品總體積，mL；

W——水提取物含量，%；

m——試樣質(zhì)量，g。

1.2.5 茶葉中可溶性糖含量的測(cè)定

采用3,5-二硝基水楊酸比色法[12]，0.5 mL葡萄糖溶液中加入0.005 g/mL的3,5-二硝基水楊酸試劑1.5 mL，沸水浴中保持5 min，定容后放置20 min后測(cè)量，檢測(cè)波長(zhǎng)為550 nm。

式中：M1——查曲線所得水解后還原糖，mg；

W——水提取物含量，%；

d——稀釋因子；

M——樣品質(zhì)量，mg。

1.2.6 茶葉中咖啡堿含量的測(cè)定

采用高效液相色譜法[13]，色譜柱為Symmetry C18Column（5 μm，4.6 mm×250 mm），柱溫 30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)275 nm，總流速1 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，流動(dòng)相A：乙酸與去離子水混合溶液（V乙酸∶V去離子水=1∶500）；流動(dòng)相B：乙腈，梯度洗脫程序：0～30 min，90%A～60%A。

式中：C1——咖啡堿質(zhì)量濃度，μg/mL；

V1——樣品總體積，mL；

W——水提取物含量，%；

m——試樣質(zhì)量，g。

1.2.7 茶葉中粗脂肪含量的測(cè)定采用索氏提取法，參照GB/T 14772—2008。

式中：M2——提取前試樣和濾紙的質(zhì)量，g；

M1——提取后試樣和濾紙的質(zhì)量，g；

M——稱取的試樣質(zhì)量，g。

1.2.8 茶葉中氨基酸組分的測(cè)定

參照GB/T 5009.124—2003，采用全自動(dòng)氨基酸分析儀，內(nèi)標(biāo)法定量，測(cè)定氨基酸組分。采用高效液相色譜法[14]，色譜柱為Diamonsil C18（46 mm×250 mm，5 μm）；以乙酸銨溶液和乙酸銨、甲醇、乙腈的混合溶液 （V乙酸銨∶V甲醇∶V乙腈=1∶2∶2）作為流動(dòng)相，流速1 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，柱溫為25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)338 nm，外標(biāo)法定量，測(cè)定茶氨酸含量。

式中：C1——茶氨酸質(zhì)量濃度，μg/mL；

V1——樣品總體積，mL；

W——水提取物含量，%；

m——試樣質(zhì)量，g。

1.2.9 茶葉品質(zhì)感官評(píng)價(jià)

參照GB/T 23776—2009《茶葉感官審評(píng)方法》，對(duì)夏秋茶、茯磚茶、茯散茶的外形、湯色、香氣、滋味和葉底進(jìn)行特征描述和打分，總分按外形30%，湯色10%，滋味25%，香氣25%，葉底10%加權(quán)平均計(jì)算。

茶葉評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 茶葉評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果與分析

2.1 “散茶發(fā)花”制作茯茶

冠突散囊菌和壓制后的茯散茶（冠突散囊菌（a），茯散茶 （b）） 見圖 1。

由圖1可知，冠突散囊菌菌落為較規(guī)則的圓形，顏色為金黃色，菌落中央厚度略高于邊緣，中心有小隆起，結(jié)構(gòu)較致密。

采用方法1.2.2中的散茶發(fā)花工藝，將菌種接入淺盤進(jìn)行發(fā)酵，對(duì)發(fā)酵過程進(jìn)行觀察。

不同發(fā)酵時(shí)間的茯散茶見圖2。

發(fā)酵第1天，茶葉無明顯變化；發(fā)酵第2天，茶葉間有白色菌絲產(chǎn)生；發(fā)酵第3天，茶葉上出現(xiàn)大量黃色孢子，冠突散囊菌生長(zhǎng)旺盛；發(fā)酵第4天，茶葉上均勻覆蓋大量黃色孢子，發(fā)酵比較完全；發(fā)酵第5天，茶葉上金黃色的孢子顏色變暗，此時(shí)冠突散囊菌因發(fā)酵時(shí)間過長(zhǎng)，產(chǎn)生大量褐色代謝產(chǎn)物。考慮到生產(chǎn)成本和發(fā)酵效果，散茶發(fā)花的發(fā)酵時(shí)間應(yīng)控制在3～4 d為最佳。發(fā)酵成熟的茯散茶表面有金黃色孢子著生，發(fā)花均勻，具有明顯發(fā)酵香味和陳香。為了方便飲用，將制成的茯散茶壓制成型（見圖 1（b））。

2.2 多酚類物質(zhì)含量測(cè)定

采用1.2.4方法測(cè)量夏秋茶、茯磚茶、茯散茶中的總多酚含量及兒茶素含量。

夏秋茶、茯磚茶、茯散茶中茶多酚和兒茶素的含量見圖3。

由圖3可知，3種茶的多酚含量分別為11.9%，10.1%，8.0%。發(fā)酵后，茯磚茶多酚含量較夏秋茶下降了15.2%，茯散茶下降了32.6%，茯散茶的多酚含量下降幅度是茯磚茶2倍。此外，加工后的茯磚茶和茯散茶中兒茶素各組分變化較明顯，茯磚茶中EGC，EC，EGCG，GCG，ECG分別降低了29.0%，5.3%，29.7%，45.4%，27.8%，其中GCG減少最多，C增加了12.6%，總體下降了8.8%；在茯散茶中EGC，EC，EGCG，GCG，ECG分別降低了29.6%，26.5%，74.3%，19.2%，61.7%，其中EGCG、ECG的含量下降最明顯，C上升了24.3%，總體下降了19.85%。從兒茶素含量下降幅度來看，茯散茶是茯磚茶的2倍，這是由于“散茶發(fā)花”過程中，冠突散囊菌分泌胞外酶[15]，可加速茶多酚和兒茶素的生物轉(zhuǎn)化，促進(jìn)其氧化產(chǎn)物茶黃素、茶紅素及茶褐素的形成與積累，導(dǎo)致茶葉中多酚類物質(zhì)含量降低。

2.3 發(fā)酵對(duì)夏秋茶中可溶性糖、咖啡堿和粗脂肪含量的影響

茶葉中的糖類物質(zhì)包括單糖、寡糖、多糖及少量其他糖類，對(duì)增進(jìn)茯磚茶滋味的甘厚純和口感具有十分重要的作用。對(duì)發(fā)酵4 d后的茯散茶，采用3,5-二硝基水楊酸比色法測(cè)得3種茶中可溶性糖含量。

夏秋茶、茯磚茶、茯散茶中可溶性糖、咖啡堿和粗脂肪含量見圖4。

由圖4可知，夏秋茶、茯磚茶、茯散茶中可溶性糖含量分別為3.1%，3.0%，2.4%，即茯磚茶中可溶性糖含量在加工過程中下降了5.1%，茯散茶下降了24.1%，茯散茶下降幅度大約是茯磚茶的5倍。這是由于茯散茶在發(fā)花過程中冠突散囊菌大量繁殖，需可溶性糖作為碳源，進(jìn)行代謝轉(zhuǎn)化，滿足自身生長(zhǎng)發(fā)育。

咖啡堿，屬生物堿類物質(zhì)，是茶葉中含量最高的有機(jī)化合物，是茶葉的主要呈味物質(zhì)和生理活性成分[16]。采用1.2.6方法對(duì)3種茶葉的咖啡堿含量進(jìn)行測(cè)定。由圖4可知，夏秋茶、茯磚茶、茯散茶中咖啡堿含量分別為2.2%，2.6%，2.3%，茯磚茶較夏秋茶升高了18.6%，茯散茶中咖啡堿含量有所增加，但變化不大。Wang X G等人[17]研究表明，在茶葉發(fā)酵過程中，霉菌可以增加咖啡堿的含量，而酵母則降低其含量，因此茯磚茶中咖啡堿含量增加可能是由于在茶葉發(fā)酵過程中微生物繁殖產(chǎn)生代謝產(chǎn)物。

采用索氏抽提法對(duì)3種茶葉的粗脂肪含量進(jìn)行測(cè)定。由圖4可知，夏秋茶、茯磚茶、茯散茶中脂肪含量分別為1.4%，1.3%，1.4%，茯磚茶相對(duì)于夏秋茶下降了6.3%，茯散茶相對(duì)于夏秋茶下降了1.7%。由此可以看出，茯磚茶和茯散茶在整個(gè)加工過程中，脂肪含量都變化不大。脂肪下降的原因可能是茶葉發(fā)酵過程中，微生物能分泌的脂肪酶能夠?qū)⒉糠种舅獬芍舅?，從而?dǎo)致脂肪含量下降。

2.4 發(fā)酵對(duì)夏秋茶中氨基酸含量的影響

茶葉中富含多種氨基酸，茶氨酸是其中特殊的一種，為茶樹的次生代謝產(chǎn)物，在一般植物中較為罕見。氨基酸是茶葉滋味與香氣形成的重要前體物質(zhì)，其組成、含量、降解產(chǎn)物和轉(zhuǎn)化產(chǎn)物也直接影響茶葉品質(zhì)，如其含量的增多能改善茯茶的鮮爽味[18]。采用全自動(dòng)氨基酸分析儀，內(nèi)標(biāo)法定量，測(cè)定3種茶葉中的氨基酸組分。

夏秋茶、茯磚茶、茯散茶中氨基酸組分含量見表2。

由表2可知，在茯磚茶和茯散茶加工過程中，各氨基酸組分的變化程度有所不同，但總體趨勢(shì)都是下降的，分別下降了11.3%，42.6%。含量較多的茶氨酸（The）、谷氨酸（Glu）、天門冬氨酸（Asp）在茯磚茶和茯散茶中分別減少了37.4%，92.8%，且茶氨酸減少最多。其原因?yàn)檐虿柙诎l(fā)酵過程中，以冠突散囊菌為主的一系列微生物,需消耗大量氨基酸來作為氮源和碳源，以滿足自身生長(zhǎng)繁殖和生命代謝，從而導(dǎo)致部分氨基酸含量下降。但是，人體必需的氨基酸蛋氨酸（Met）、纈氨酸（Val）、賴氨酸（Lys）、組氨酸（His） 在茯磚茶中依次增加了21.1%，29.5%，7.6%，5.0%，在茯散茶中依次增加了41.5%，37.2%，24.4%，24.0%，這些氨基酸含量增加的原因是冠突散囊菌菌體和其代謝產(chǎn)物中新生成了部分人體必需氨基酸。

2.5 茶葉感官評(píng)價(jià)結(jié)果

表2 夏秋茶、茯磚茶、茯散茶中氨基酸組分含量/mg·kg-1

茶葉感官評(píng)價(jià)是判斷茶葉品質(zhì)優(yōu)劣和品質(zhì)特征的重要手段與方法[19]。根據(jù)GB/T 23776—2009茶葉感官評(píng)價(jià)方法，分別對(duì)夏秋茶、茯磚茶、茯散茶的外形、水色、香氣、滋味和葉底進(jìn)行特征描述并進(jìn)行打分[20]。

夏秋茶、茯磚茶、茯散茶茶湯的感官評(píng)價(jià)雷達(dá)圖見圖5。

由圖5可知，3種茶葉感官得分出現(xiàn)很明顯的差別：夏秋茶得分最低，品嘗時(shí)香氣淡薄，以粗青氣為主，茶湯有明顯苦澀味；茯磚茶得分中等，以陳香為主，青氣基本被轉(zhuǎn)化，發(fā)花較好的茯磚茶帶菌花香，苦味基本轉(zhuǎn)化，略帶粗澀味；茯散茶得分最高，香氣以菌花香為主，出現(xiàn)陳香，滋味陳醇略厚，茶湯回甘明顯。

茯散茶湯色鮮亮、滋味陳醇、回甘明顯的主要原因有：一是茯散茶中更多的糖類物質(zhì)通過脫水、縮合、聚合發(fā)生焦糖化反應(yīng)，產(chǎn)生了更為怡人的湯色和焦糖香；二是茯散茶中水浸出物含量高，尤其是多酚類物質(zhì)及其氧化產(chǎn)物含量豐富，多酚類氧化物茶褐素滋味稍甜，茶紅素呈甜醇味[21]，且對(duì)發(fā)酵茶的紅艷湯色有積極作用[22-23]；三是茯散茶中胞外酶及次生代謝產(chǎn)物會(huì)使兒茶素進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，降低了兒茶素對(duì)口腔的收斂與干澀刺激，有效改善了茶湯的滋味與回甘[24]。

3 結(jié)論

采用冠突散囊菌進(jìn)行淺盤接種和散茶發(fā)花技術(shù)，4 d內(nèi)即可完成茯散茶的加工過程。通過對(duì)夏秋茶、茯磚茶和茯散茶中幾種主要成分含量的分析，發(fā)現(xiàn)散茶發(fā)花技術(shù)相比于傳統(tǒng)加工技術(shù)更能徹底、有效地轉(zhuǎn)化夏秋茶中多酚類物質(zhì)、可溶性糖、脂肪、氨基酸，減少茶湯苦澀味，改善茶葉品質(zhì)。該技術(shù)將對(duì)夏秋茶資源的有效利用，提高茶農(nóng)經(jīng)濟(jì)收益和茶業(yè)發(fā)展具有重要意義。