軟水蓼不同目數(shù)超微粉體溶出物的化學(xué)成分分析

劉英波,魯 丹,潘年松,*,馮 華,周德權(quán)

(1.遵義醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校,貴州遵義 563005;2.遵義市食品藥品檢驗所,貴州遵義 563002;3.遵義綠普森農(nóng)業(yè)有限公司,貴州遵義 563000)

軟水蓼(PolygonumhydropiperL.var.flaccidu(Meisn.)Steward.)為蓼科( Polygonaceae)蓼屬(PolygonumL.)植物具行滯化濕、散瘀止血、袪風(fēng)止癢、解毒功能,臨床主要用于痢疾、泄瀉、便血、痛經(jīng)、濕疹、風(fēng)疹等[1]疾病;現(xiàn)代藥理研究表明具抗菌[2]及抗炎[3]等作用。同時軟水蓼(PolygonumhydropiperL.var.flaccidu(Meisn.)Steward.)和水蓼(polygonumhydropiperL.)均被收載于《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標準》,兩者的地上部分作為辣蓼藥材或飲片使用[1];軟水蓼同屬植物水蓼對甜酒曲中霉菌和酵母的生長具促進作用[4-5]和提高酒藥糖化力、發(fā)酵力[6]。目前關(guān)于蓼科蓼屬植物化學(xué)成分的報道主要為黃酮類、蒽醌類、苯丙素類和萜類等類型的化合物,約140個化合物,藥理研究表明主要具有抗癌、抗腫瘤、抗氧化、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、殺蟲等[7-8]作用,但仍然缺乏對軟水蓼活性成分的藥理作用及對制曲作用成分和機制進行深度挖掘。

超微粉碎技術(shù)是以植物藥材細胞破壁為粉碎目的,使細胞破壁率達到95%以上,細胞內(nèi)的有效成分直接暴露出來,增加活性成分的提取率和速度,提高生物利用度而增強療效。超微粉碎技術(shù)在中藥領(lǐng)域的研究與應(yīng)用主要為藥材、復(fù)方制劑、開發(fā)新型中藥飲片、提取物加工等[9-10]方面,如對藥材不同粒徑的粉體進行粉體學(xué)性質(zhì)、有效成分溶出度、化學(xué)成分、量效學(xué)、藥代動力學(xué)、藥理及藥效學(xué)的影響及相關(guān)評價研究。中藥材或飲片經(jīng)超微粉碎后,細胞內(nèi)的有效成分不需要通過細胞壁的屏障而直接溶解于溶劑中形成溶液,同時增大了比表面積,使粉體具有更好的溶解性、分散性、化學(xué)反應(yīng)活性和生物利用度等特性,但也存在超微粉體的安全性、穩(wěn)定性、粒徑控制和臨床研究相對較少等問題,對其推廣應(yīng)用受到一定限制。本研究將軟水蓼地上部分不同目數(shù)超微粉體溶出物進行化學(xué)成分及峰面積值差異性研究,為明確軟水蓼藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其機制的闡明奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本實驗所用藥材 均由遵義綠普森農(nóng)業(yè)有限公司湄潭縣中藥材基地提供,經(jīng)遵義市食品藥品檢驗所鄧順超副主任中藥師鑒定為軟水蓼(PolygonumhydropiperL.var.flaccidu(Meisn.)Steward.)的地上部分，標本保存于遵義醫(yī)藥高等專科學(xué)校中藥標本館;甲醇、乙腈和甲酸(質(zhì)譜純) 德國Merck公司 溶解不同目數(shù)粉體化學(xué)成分或色譜溶劑系統(tǒng);水 廣州屈臣氏食品飲料有限公司。

1290 UPLC、8500FE-SEM場發(fā)射掃描電鏡 安捷倫科技有限公司;色譜柱Waters Acquity UPLC?HSS T3,2.1 mm×100 mm,1.8 μm 沃特世科技(上海)有限公司;Triple TOF4600 LC/MS質(zhì)譜儀 Sciex公司;TCL離心機 廣州航信科學(xué)儀器有限公司;AB204-S型梅特勒電子天平 珠海天創(chuàng)儀器有限公司;HHS-6粉碎機 金壇市普瑞斯機械有限公司;KQ-300DE超聲儀 天津市泰斯特儀器有限公司;BT-2001型激光粒度儀 丹東百特儀器有限公司;SYFM-8Ⅱ振動式藥物超微粉碎機 濟南倍力粉技術(shù)工程有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同目數(shù)粉體制備及粒徑測定 將軟水蓼采用普通粉碎機粉碎成粗粉，過篩后再采用超微粉碎機在-12～16 ℃,振幅6 mm條件下粉碎,50、120、200目粉體粉碎15 min;300和500目粉體粉碎45 min后得到不同目數(shù)粉體,經(jīng)激光粒度儀采用干法測定粉體的體積、面積、比面積平均粒徑大小,測定條件為樣品折射率1.596+0.100i,光學(xué)模式Mie,介質(zhì)折射率1.000,分析模式63.1。

1.2.2 不同目數(shù)粉體的形態(tài)特征 將軟水蓼制備好的50、120、200、300和500目粉體適量,分別鋪于掃描電子顯微鏡(SEM)樣品臺上,噴金鍍膜后置SEM下放大進行形態(tài)特征觀察。

1.2.3 軟水蓼不同超微粉體化學(xué)成分檢測

1.2.3.1 供試溶液制備 取軟水蓼供試品相應(yīng)目數(shù)粉末約0.5 g于50 mL離心管中,加入50 mL的80%甲醇溶液,超聲提取30 min取出,放冷,12000 r/min離心5 min,取上清液過0.22 μm濾膜即得待測樣品。

1.2.3.2 色譜條件 色譜柱柱溫25 ℃;進樣量1 μL;檢測波長254 nm;流動相比例和流速:A相0.1%甲酸水溶液,B相乙腈,流速0.3 L/min。見表1。

表1 流動相梯度Table 1 Mobile phase gradient

1.2.3.3 質(zhì)譜條件 檢測模式為負離子模式,具體質(zhì)譜參數(shù),見表2和表3。

表2 質(zhì)譜MS參數(shù)Table 2 MS parameter list

表3 質(zhì)譜MS/MS參數(shù)Table 3 MS/MS parameters of mass spectrometry

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Waters PeakView? software version:1.2.0.3(64-bit)軟件智能控制系統(tǒng),采集UPLC-Q-TOF-MSE數(shù)據(jù);借助UNIFI科學(xué)信息系統(tǒng),文獻數(shù)據(jù)、TCM Chiese[UNIFI1.7]、ChemSpide在線數(shù)據(jù)庫和Progenesis QI LC/MS數(shù)據(jù)分析軟件,對化學(xué)組分進行識別鑒定和分析?；衔锍煞骤b定相似度得分:

系統(tǒng)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫已知成分的分子式、結(jié)構(gòu)、質(zhì)譜裂解碎片信息與待鑒定成分的分子式、結(jié)構(gòu)與二級質(zhì)譜裂解碎片信息的比較,相似程度越高,評價得分越高。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同目數(shù)粉體粒徑測定及其分布

軟水蓼不同目數(shù)粉體的體積平均粒徑隨粉體所過的目數(shù)增加而降低;面積平均粒徑300目時最低;而比表面積值則隨樣品所過目數(shù)增加呈上升趨勢;不同目數(shù)的長度平均徑值在300目時最短;過200目粉體的粒徑遮光率最小;擬合殘差值在120目時較低,至500目粉體時達最低值(見表4)。粒徑大小的分布在50目時呈現(xiàn)連續(xù)兩部分分布狀態(tài),一部累積值為32%,而另一部分則達到80%,從D10的粒徑5.429 μm至D90粒徑215.5 μm,說明粒徑大小差異大,分布不均勻;120目時粉體粒徑的累積值為約32%,從D10的粒徑3.761 μm至D90粒徑80.78 μm,粒徑分布范圍較50目的粉體小;200目的粉體累積值為約82%,300目和500目的粉體累積值均為95%,三者粒徑大小分布基本相同,見圖1。

表4 軟水蓼藥材不同目數(shù)粉體粒徑大小Table 4 The particle size of different number powder of Polygonum hydropiper L.

圖1 軟水蓼不同目數(shù)粉體粒徑分布圖Fig.1 Particle size distribution of Polygonum hydropiper L. powder with different contents注:A:50目;B:120目;C:200目;D:300目;E:500目。

2.2 不同目數(shù)粉體的形態(tài)特征

軟水蓼50目和120目粉體顆粒大小形狀不規(guī)則,表面粗糙,可以看到原藥材的粉末特征;軟水蓼藥材經(jīng)粉碎后過200目以上的超微粉體大小逐漸有均勻的趨勢,顆粒表面越來越光滑,原藥材特征越來越不明顯,見圖2。

圖2 軟水蓼不同目數(shù)粉體的掃描電鏡圖Fig.2 Scanning electron microscopy of Polygonum hydropiper L. powder with different mesh numbers注:A:50目(1527×1);B:120目(1534×1);C:200目(1531×1);D:300目(1514×1);E:500目(1531×1)。

2.3 不同目數(shù)粉體溶出化學(xué)成分的質(zhì)譜數(shù)據(jù)及鑒定

共鑒定出17個化合物,其中蔗糖、沒食子酸、楊梅苷、槲皮苷4個化合物由數(shù)據(jù)庫比對鑒定;金絲桃苷、異槲皮苷、沒食子?；纹に?-O-葡萄糖苷、2″-O-沒食子酰基槲皮苷、3,3′-Di-O-甲基鞣花酸、氫化胡椒甙、Vanicoside B、Vanicoside A、Vanicoside E、Vanicoside C、槲皮素11個化合物由參考文獻鑒定;2個化合物2″-O-沒食子?；鶙蠲奋?、2″-O-沒食子?；鸾z桃苷通過推斷鑒定?；衔飾蠲奋?、金絲桃苷、異槲皮苷為同分異構(gòu)體,化合物楊梅苷中為鼠李糖基取代,而化合物金絲桃苷和異槲皮苷中為葡萄糖基取代,因此在質(zhì)譜二級碎片,化合物楊梅苷有典型的碎片離子m/z 317(-146 Da),而化合物金絲桃苷和異槲皮苷中有碎片離子m/z 301(-162 Da),進一步結(jié)合數(shù)據(jù)庫以及文獻[11]中3個成分出峰先后順序,確定3個成分。化合物2″-O-沒食子?；鸾z桃苷、2″-O-沒食子?；鶙蠲奋蘸蜎]食子?；纹に?-O-葡萄糖苷為同分異構(gòu)體,與化合物楊梅苷、金絲桃苷和異槲皮苷這組異構(gòu)體相比,準分子離子峰質(zhì)量增加152 Da,且有相同的碎片離子,因此推測可能是在化合物金絲桃苷、異槲皮苷和楊梅苷的基礎(chǔ)上引入1分子沒食子?；?進一步研究碎片信息,化合物2″-O-沒食子酰基金絲桃苷、沒食子酰基槲皮素3-O-葡萄糖苷中有碎片離子m/z 301,因此推斷化合物2″-O-沒食子?；鸾z桃苷、沒食子?；纹に?-O-葡萄糖苷是在化合物金絲桃苷或異槲皮苷的結(jié)構(gòu)式引入的沒食子?；?根據(jù)參考文獻[12]化合物沒食子?；纹に?-O-葡萄糖苷在水蓼中有報道,化合物2″-O-沒食子?；鸾z桃苷和2″-O-沒食子?；鶙蠲奋諞]有報道由推斷得到;由于沒有采集對照品數(shù)據(jù)且無參考文獻報道化合物2″-O-沒食子?；鸾z桃苷、沒食子?；纹に?-O-葡萄糖苷和2″-O-沒食子?；鶙蠲奋赵谏V中出峰先后順序,因此化合物2″-O-沒食子?；鸾z桃苷、沒食子酰基槲皮素3-O-葡萄糖苷和2″-O-沒食子?；鶙蠲奋諡闀簳r鑒定，以上結(jié)果見圖3～圖4和表5。

表5 軟水蓼不同目數(shù)粉體溶出化學(xué)成分經(jīng)UPLC-Q-TOF-MS分析的質(zhì)譜數(shù)據(jù)及鑒定Table 5 Isolation and identification of Polygonum hydropiper L. compounds

圖3 軟水蓼DAD譜圖(UV 254 nm)Fig.3 DAD spectra of Polygonum hydropiper L.(UV 254 nm)

圖4 軟水蓼質(zhì)譜負離子模式鑒定色譜峰圖Fig.4 Diagram of chromatographic peak number for negative ion pattern identification of Polygonum hydropiper L. mass spectrometry

2.4 黃酮類化合物峰面積值趨勢

軟水蓼不同目數(shù)超微粉體溶出的黃酮類化合物總體的峰面積值(表6),從過50目篩的粉體逐漸升高,在120目出現(xiàn)較高的峰面積值,隨后從200～300目逐漸降低,再到500目時呈逐漸升高趨勢,其原因可能與不同的黃酮類化合物成分的分子結(jié)構(gòu)和基團性質(zhì)、在植物細胞內(nèi)的存在形式等有關(guān)。其中2″-O-沒食子?；鶙蠲奋盏姆迕娣e值從50目上升至120目時最高,隨后降低,相對峰面積值為1.14%;楊梅苷的峰面積值從50～200目逐漸上升,然后在300 目時有所降低,在500 目時再次升至最高,相對峰面積值為18.26%;金絲桃苷的峰面積值從50目逐漸上升至200目時最高，然后在200～300目之間有所降低，500目時逐漸上升，相對峰面積值為13.24%；異槲皮苷和槲皮素-3-O-(6′-O-沒食子酰)-beta-D-吡喃半乳糖苷的峰面積值從50目逐漸上升至120目時呈現(xiàn)最高的峰面積值,然后在200目時有所降低之后,再逐漸升高,相對峰面積值分別為3.85%和0.89%;槲皮苷和2″-O-沒食子酰基金絲桃苷的峰面積值從50目逐漸上升至120目呈現(xiàn)較大峰值,然后在300目時峰面積值較低,在500目時峰面積值再次上升至最高,相對峰面積值分別47.11%和2.7%;3″-O-沒食子?；纹ぼ盏姆迕娣e值在過120目篩時最高,在300目時降至最低,再逐漸升高,相對峰面積值為9.0%;槲皮素的峰面積值從50目至500目呈逐漸上升趨勢,相對峰面積值為3.81%。見表6。

2.5 苯丙素類化合物峰面積值趨勢

軟水蓼不同目數(shù)粉體溶解出的苯丙素類化合物峰面積值從50目下降至300目最低值,隨后呈上升趨勢(表6)。其中氫化胡椒苷的峰面積值50目時最高,在120目時下降至最低,隨后逐漸上升,相對峰面積值為10.5%;Vanicoside C在200目和300目中沒有檢測出峰面積,相對峰面積值為2.1%;Vanicoside B和Vanicoside A的峰面積值在50目時最高,在300目時降至最低,然后逐漸升高,相對峰面積值分別為47.79%和18.66%;Vanicoside E的峰面積值在50目時最高，在200目時降至最低,隨后逐漸升高,相對峰面積值為20.95%。

表6 軟水蓼不同目數(shù)粉體中黃酮類和苯丙素類化合物峰面積匯總表Table 6 Summary of peak area of flavonoids and phenylpropanoids in different orders of Polygonum hydropiper L. powder

3 討論與結(jié)論

采用超微粉碎技術(shù)將軟水蓼原生藥材或飲片粒徑從150～200目提高到300目以上,該細度條件下的細胞破壁率大于95%,體積平均粒徑中除50目粉體外大于90.22 μm外,其他的面積平均粒徑、比表面積均在1～75 μm范圍內(nèi);同時達到破壁飲片中間體粒徑要求是 D90<45 μm的要求,可成為當(dāng)前新型飲片之一,并具有均勻性高、藥材利用率高、服用方式多樣、全成分保留、單方與靈活組方兼顧等優(yōu)勢,保持了中醫(yī)藥辨證施治、臨證加減的用藥特性,破壁飲片及其技術(shù)既是傳統(tǒng)中藥粉末應(yīng)用的創(chuàng)新與發(fā)展,又遵循中醫(yī)藥理論自身規(guī)律和特色[24-25]。

本研究采用UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)分別對軟水蓼藥材經(jīng)粉碎過50、120、200、300和500目篩的粉體進行化學(xué)成分定性分析,鑒定出黃酮類、苯丙素類、有機酸、多糖及鞣質(zhì)17個化合物首次從該植物中分離檢測到;其中苯丙素類化合物Vanicoside C在200、300目粉體中沒有檢出,可能與粉末在溶出過程中存在溶出與吸附平衡,微粉溶出雖然稍多,但藥材超微粉碎粒度過小易于團聚,成分溶解后不易分散、溶出度反而降低,藥物粉體對極性成分的吸附力增大,從而使其不易溶出有關(guān)[9,26]。軟水蓼不同目數(shù)超微粉體中溶出的黃酮類化合物峰面積值較高,而苯丙素類化合物的峰面積值較低,其原因可能與兩大類型化合物的理化性質(zhì)差異及在溶劑中的溶解度等有關(guān);如再進一步增加粉碎度,可能藥用成分的含量會有所提高,但其成本會相應(yīng)增加,如設(shè)備投入增加,而且細胞壁里的很多雜質(zhì)、無效成分、甚至毒性成分等也會破碎而出,增加不確定的影響因素和增加對藥用成分的吸附性,反而降低藥用成分的含量。

本研究采用UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)對軟水蓼藥材超微粉體進行化學(xué)成分定性分析，能夠直觀準確地反映軟水蓼不同目數(shù)粉體化學(xué)成分的變化情況，從整體上彌補了HPLC和UPLC分析的不足,為軟水蓼藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的闡明和系統(tǒng)評價(安全性評價、有效性評價、生物利用度、藥理、藥效及藥代等)、穩(wěn)定性和質(zhì)量標準等[28]深入研究奠定基礎(chǔ)。