秸稈與豬糞混合高固厭氧消化產(chǎn)氣性能及關(guān)鍵微生物分析

傅國(guó)志，郭文陽，馬宗虎，劉蔚，李博凱，孫子滟，王禎欣，李葉青

（1 中國(guó)華電科工集團(tuán)有限公司，北京100160；2 河南省科學(xué)院生物研究所有限責(zé)任公司，河南鄭州450008；3 中國(guó)石油大學(xué)（北京）新能源與材料學(xué)院，生物燃?xì)飧咧道帽本┦兄攸c(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京102249）

我國(guó)作為農(nóng)業(yè)大國(guó)，每年都有大量的農(nóng)作物秸稈產(chǎn)出，秸稈是農(nóng)業(yè)生物質(zhì)資源的重要組成部分[1]，但秸稈的處理一直是關(guān)系到國(guó)計(jì)民生的問題。因?yàn)榻斩捴饕煞质悄举|(zhì)素、纖維素之類的物質(zhì)，這類物質(zhì)在農(nóng)田或其他自然環(huán)境中難以被降解，保留時(shí)間較長(zhǎng)，占用土地空間并且影響農(nóng)作物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。隨著我國(guó)農(nóng)業(yè)耕種技術(shù)的發(fā)展和作物產(chǎn)量的提升，2013 年我國(guó)農(nóng)作物秸稈可收集量達(dá)到8.3 億噸，2015 年達(dá)到9.0 億噸[2]。近年來，國(guó)家對(duì)環(huán)保問題和生物質(zhì)能源的重視程度提高，秸稈已經(jīng)成為制備生物沼氣的重要原料。但是隨著秸稈沼氣產(chǎn)業(yè)的不斷深入，很多問題便開始突顯出來。比如單一秸稈厭氧消化產(chǎn)氣率低、進(jìn)出料困難、運(yùn)行的穩(wěn)定性較差，這些問題導(dǎo)致投資多，效益低，嚴(yán)重制約秸稈沼氣產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[3-4]。

與此同時(shí)，伴隨著人們生活水平的提高，對(duì)肉制品的需求日漸增加。畜禽養(yǎng)殖行業(yè)發(fā)展迅速，特別是規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)的比例持續(xù)升高，其產(chǎn)生的大量畜禽糞便也亟待有效地解決。利用厭氧消化技術(shù)，畜禽糞便可直接作為原料進(jìn)行消化產(chǎn)沼氣，消化效果優(yōu)于秸稈的厭氧消化。單一原料的厭氧消化已經(jīng)形成了成熟的技術(shù)，并且用在了現(xiàn)實(shí)的生活中[5]。但畜禽糞便中氮、磷含量較高，在消化后期氨氮含量肯定會(huì)大幅度上升，進(jìn)而會(huì)對(duì)厭氧消化產(chǎn)甲烷過程產(chǎn)生抑制作用[6]。因此需要添加一種或多種其他有機(jī)物料與糞便混合，通過調(diào)節(jié)物料的配比，使原料的C/N處于合適的范圍內(nèi)，減少實(shí)驗(yàn)過程中大量的氨態(tài)氮釋放和揮發(fā)性脂肪酸（volatile fatty acids,VFA）積累，提高厭氧消化的效率[7-8]。

目前有很多關(guān)于畜禽糞便與秸稈混合發(fā)酵的實(shí)驗(yàn)研究，證明了混合厭氧發(fā)酵可以提高沼氣的產(chǎn)氣率[9-12]。但是靜置的厭氧干發(fā)酵過程，實(shí)驗(yàn)的啟動(dòng)期長(zhǎng)，運(yùn)行緩慢，產(chǎn)甲烷效率很低。因此，行業(yè)內(nèi)的研究人員開始嘗試改變干發(fā)酵運(yùn)行狀態(tài)，以提高產(chǎn)甲烷效率。研究表明，通過機(jī)械攪拌有助于豬糞和稻草的混合發(fā)酵原料與厭氧微生物之間有效接觸，提高傳質(zhì)效果，從而改善厭氧干發(fā)酵的效率[13]。反應(yīng)過程中，增加滲濾液回流，能使得雞糞和秸稈混合發(fā)酵產(chǎn)甲烷量提高1倍以上[14]，并且回流噴淋的過程能調(diào)整發(fā)酵原料的含水率，增加原料中微生物的數(shù)量，加快原料分解和VFA 的產(chǎn)生[15]。相比于不回流的實(shí)驗(yàn)組，滲濾液回流能使發(fā)酵原料的總固體產(chǎn)氣量提高29.17%[16]。綜上所述，增設(shè)滲濾液回流裝置可以提高干式厭氧發(fā)酵的產(chǎn)氣效率。但前人研究的滲濾液噴淋回流多是集中在固定比例的混合原料進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并且是全程持續(xù)性噴淋，對(duì)于大型的沼氣發(fā)酵工程，消耗能量成本太高，并且原料的最佳配比不夠明確。因此，本實(shí)驗(yàn)選用間歇性滲濾液噴淋裝置，3種不同比例的混合原料（秸稈、豬糞）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，旨在更加節(jié)能高效的前提下，探索得到使厭氧干發(fā)酵更加高效的混合原料配比，為沼氣產(chǎn)業(yè)化的推廣應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

由于秸稈的總固體含量（total solid, TS）在90%以上，豬糞的TS 也在30%以上，兩者的固含率都比較高，比較適合高固厭氧消化。因此本實(shí)驗(yàn)選擇高固厭氧消化反應(yīng)器（high-solid anaerobic digestion,HS-AD）。HS-AD是處理木質(zhì)纖維素類原料和其他高固含率有機(jī)原料的有效方式[17-18]。研究發(fā)現(xiàn)，針對(duì)HS-AD 反應(yīng)器原料流動(dòng)性差、反應(yīng)速率慢的問題，增加滲濾液回流裝置可以有效地提高產(chǎn)氣性能和穩(wěn)定性[19]。相比于液相厭氧消化（liquid anaerobic digestion, L-AD），HS-AD 反應(yīng)器的負(fù)荷大，節(jié)約用水量，產(chǎn)生的沼液量少，并且產(chǎn)甲烷性能依然較好[20]。

采用增設(shè)滲濾液回流的HS-AD裝置，秸稈與豬糞混合進(jìn)料的方法，設(shè)定3種（秸稈∶豬糞）混合比例，分別為R1（1∶1）、R2（2∶1）、R3（1∶2），進(jìn)行干式厭氧消化實(shí)驗(yàn)。有研究表明，對(duì)于回流式HS-AD，設(shè)定前兩周噴淋量是接種液的2 倍左右，第3周是1倍，最后不噴淋的條件，最終產(chǎn)氣效果較好[21]。因此，考慮到節(jié)能增效的初衷，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室實(shí)際的回流式高固厭氧消化反應(yīng)裝置，設(shè)定噴淋時(shí)間，即前兩周4min/6h，第3周2min/6h，之后不噴淋。通過對(duì)比實(shí)驗(yàn)過程中液相性質(zhì)的變化、微生物（細(xì)菌和古菌）群落的改變以及產(chǎn)甲烷的差異，分析原料配比對(duì)厭氧消化的影響，最終得到高固厭氧消化效果較好的混合原料配比。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)裝置

實(shí)驗(yàn)采用3個(gè)有機(jī)玻璃制成的車庫式反應(yīng)器作為反應(yīng)器，有機(jī)玻璃厚10mm，反應(yīng)器內(nèi)徑長(zhǎng)400mm，寬300mm，高400mm，設(shè)計(jì)體積為48L，接種液罐為圓桶形，直徑250mm，高200mm，設(shè)計(jì)體積10L。反應(yīng)器和接種液罐由水浴保溫，水浴層厚度為20mm，將水溫控制在(37±0.5)℃，用熱電偶檢測(cè)各反應(yīng)器和接種液罐的溫度。接種液由循環(huán)泵吸入反應(yīng)器噴淋回流，噴淋口對(duì)稱分布于反應(yīng)器頂部?jī)商?，采用定時(shí)系統(tǒng)進(jìn)行接種液噴淋，可根據(jù)需求調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)子流量計(jì)控制噴淋量。厭氧反應(yīng)器底部為一層高50mm 的方形不銹鋼容器，再鋪一層厚10mm、長(zhǎng)寬為20～30mm 的小木塊，以分離接種液和消化底物。如圖1所示。

圖1 車庫式厭氧消化系統(tǒng)

1.2 原料和接種物

秸稈來自于河北石家莊，包括水稻秸稈和蘆葦秸稈。豬糞來自河北石家莊某大型養(yǎng)殖場(chǎng)。實(shí)驗(yàn)所用的接種物是取自阿蘇衛(wèi)垃圾場(chǎng)（北京市昌平區(qū)）的垃圾滲濾液（又稱沼液）。在5L玻璃瓶中倒入4L沼液，加入2g 葡萄糖（即0.5g/L），在恒溫培養(yǎng)箱中37℃馴化3周，得到實(shí)驗(yàn)用的接種物。這幾種物質(zhì)的基本特性見表1。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)定消化原料的總質(zhì)量為1600g，將秸稈和豬糞按照質(zhì)量比為1∶1、2∶1、1∶2 的比例稱量，然后混合均勻，對(duì)應(yīng)的反應(yīng)器依次設(shè)為R1、R2、R3。各反應(yīng)器中混合原料的性質(zhì)如表2所示。接種液的量按1∶4（質(zhì)量比）添加，即需要接種液6400mL。實(shí)驗(yàn)啟動(dòng)之前先將混合好的原料放入接種液中浸泡2h，使微生物與原料充分接觸。之后，一并放入車庫式厭氧消化反應(yīng)器中，檢測(cè)氣密性，通5min N2保持厭氧環(huán)境，啟動(dòng)恒溫循環(huán)水，接好集氣袋，開始實(shí)驗(yàn)。其中，循環(huán)泵的噴淋流量為0.8L/min，實(shí)驗(yàn)啟動(dòng)之后的噴淋條件設(shè)定為：消化前兩周，每隔6h 噴淋1 次，每次噴淋4min；第3周，每隔6h噴淋1次，每次噴淋2min；第4周，不噴淋。

表1 秸稈、豬糞和接種物的基本特性

表2 各反應(yīng)器中混合原料的性質(zhì)

1.4 樣品測(cè)試和分析方法

TS 和VS 的測(cè)定是利用烘箱、馬弗爐和天平，采用烘干及灼燒恒定法得到；采用實(shí)驗(yàn)室EA3000的元素分析儀（利曼中國(guó)，意大利）對(duì)秸稈、豬糞和接種物做元素分析；消化后樣品中的單酸含量以及堿度（TIC）用配備有火焰離子化檢測(cè)器和DBFFAP 柱的GC 色譜儀分析（安捷倫科技有限公司，美國(guó)）；產(chǎn)氣量用濕式防腐氣體流量計(jì)（長(zhǎng)春汽車濾清器有限責(zé)任公司，中國(guó)）測(cè)定，氣體的成分用GC9790Ⅱ型熱導(dǎo)氣相色譜儀（浙江福立分析儀器股份有限公司，中國(guó)）測(cè)得，每次取3 個(gè)樣測(cè)定，取平均值。

沼液pH用賽多利斯pH計(jì)測(cè)得；微生物群落的具體方法是先使用DNA 提取試劑盒提取樣品中的總DNA，通過ND-2000 分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）測(cè)定DNA的數(shù)量和質(zhì)量[22]。然后，細(xì)菌以16S rRNA基因的V3～V4可變區(qū)序列為靶標(biāo)，以帶有barcode 序列的338F-806R 為引物[23]，同時(shí)古菌使用Arch344F-Arch915R 為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到PCR 產(chǎn)物。最終，PCR 產(chǎn)物經(jīng)過定量及文庫構(gòu)建后，利用Illumina MiSeq PE300平臺(tái)（Illumina公司，美國(guó)）進(jìn)行高通量測(cè)序。

2 結(jié)果與討論

2.1 甲烷含量

本實(shí)驗(yàn)以秸稈和豬糞作為原料，研究不同配比的秸稈和豬糞對(duì)厭氧消化的影響。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了51天，期間各反應(yīng)器產(chǎn)生的沼氣中甲烷含量變化情況如圖2所示。從實(shí)驗(yàn)啟動(dòng)的第3天開始取樣，根據(jù)產(chǎn)氣情況，每2～3 天檢測(cè)一次甲烷含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)開始之后，各反應(yīng)器產(chǎn)生的沼氣中甲烷含量都在不斷上升，達(dá)到最大值之后逐漸趨于平穩(wěn)。具體表現(xiàn)為：R1 反應(yīng)器產(chǎn)生的沼氣中甲烷含量從初始的14.7%逐漸增加到63.9%（第18 天），之后穩(wěn)定在60.5%左右；R2從14.9%逐漸增加到66.2%（第25 天），之后穩(wěn)定在60.7%左右；R3 從19.5%逐漸增加到64.2%（第25 天），最終穩(wěn)定在61.3%左右。3組反應(yīng)器產(chǎn)生的沼氣中甲烷含量的大小以及變化趨勢(shì)整體很相似，這說明秸稈和豬糞的不同配比對(duì)產(chǎn)生的沼氣中甲烷含量的影響較小。

并且從圖1中可以看出，產(chǎn)生的沼氣中甲烷含量達(dá)到最大值之前，R3 反應(yīng)器中產(chǎn)生的沼氣甲烷含量均高于R1 和R2 反應(yīng)器。由于R3 反應(yīng)器添加的原始物料中豬糞量是秸稈量的2倍，很明顯豬糞中的可溶性有機(jī)物相比于秸稈的可溶性有機(jī)物更容易轉(zhuǎn)化為VFA，產(chǎn)甲烷的進(jìn)程相對(duì)較快，這也導(dǎo)致了在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的前期（前18 天），R3 反應(yīng)器中生成沼氣中的甲烷含量略高于其他兩組反應(yīng)。

2.2 累計(jì)甲烷產(chǎn)量和產(chǎn)甲烷速率

一般的厭氧消化反應(yīng)器，接種比（原料與接種液的VS比）在大于4.0的情況下，實(shí)驗(yàn)的啟動(dòng)期都比較長(zhǎng)，在20～30天，運(yùn)行緩慢[24-25]。如果提高實(shí)驗(yàn)的接種比，整個(gè)厭氧反應(yīng)的啟動(dòng)時(shí)間也會(huì)隨之增加[26]。本實(shí)驗(yàn)R1、R2和R3反應(yīng)器的接種比分別為7.78、8.99和6.58，均大于4.0，屬于高含固厭氧消化體系，但是從圖3 和圖4 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看出，3 組實(shí)驗(yàn)的啟動(dòng)期均大約為5 天，明顯比傳統(tǒng)的厭氧消化系統(tǒng)縮短了啟動(dòng)時(shí)間。說明反應(yīng)器中增設(shè)的噴淋體系在一定程度上確實(shí)有助于加快反應(yīng)的進(jìn)行，提高了高含固厭氧消化的效率。隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，沼氣產(chǎn)量逐漸增加，根據(jù)沼氣中甲烷的含量，換算得到產(chǎn)生的甲烷產(chǎn)量。經(jīng)過51 天的厭氧消化之后，R1 累計(jì)產(chǎn)沼氣82.51L，即單位VS產(chǎn)甲烷量為53.8mL/gVS。R2 累計(jì)產(chǎn)沼氣229.66L，即單位VS 產(chǎn)甲烷量為131.8mL/gVS；同理得到R3單位VS 產(chǎn)甲烷量為122.9mL/gVS（如圖3 所示）。另外，R2 和R3 實(shí)驗(yàn)組的產(chǎn)甲烷情況與宋香育等[27]的研究結(jié)果相一致，說明產(chǎn)氣結(jié)果具有可靠性。R2 和R3 的累計(jì)產(chǎn)甲烷量高于R1 的產(chǎn)甲烷值。同時(shí)，對(duì)比甲烷的產(chǎn)生速率（如圖4 所示），R1的最大產(chǎn)甲烷速率為3.4mL/(gVS·d)，R2和R3的最大產(chǎn)甲烷速率分別為6.8mL/(gVS·d)和8.3mL/(gVS·d)。因此無論是產(chǎn)甲烷量還是產(chǎn)甲烷速率，R2和R3的值都遠(yuǎn)高于R1。分析原因，可能是由于R1反應(yīng)器的物料反應(yīng)過程中微生物群落分布不均導(dǎo)致木質(zhì)素、纖維素類物質(zhì)的降解程度不同；或者是在實(shí)驗(yàn)啟動(dòng)之后有輕微漏氣現(xiàn)象導(dǎo)致的。

圖3 累計(jì)甲烷產(chǎn)量

圖4 甲烷產(chǎn)生速率

2.3 液相性質(zhì)的變化

為了更好地分析實(shí)驗(yàn)前期產(chǎn)氣的差異，這里僅選取了實(shí)驗(yàn)啟動(dòng)后前28 天的液相樣品，檢測(cè)這段時(shí)間液相性質(zhì)的變化以及后續(xù)的微生物群落豐富度和多樣性。

2.3.1 揮發(fā)性脂肪酸（VFA）和pH

實(shí)驗(yàn)啟動(dòng)初期，原料中的易降解物質(zhì)，比如纖維素、蛋白質(zhì)、脂肪等，在微生物的作用下優(yōu)先被分解為小分子酸，同時(shí)過程中伴有部分CO2和少量H2產(chǎn)生[28]。隨著這些大分子有機(jī)物被體系中的微生物逐步降解，液相中的VFA濃度開始上升（如圖5所示）。厭氧消化反應(yīng)經(jīng)歷過水解、酸化過程（主要在10天以前），緊接著主要就是產(chǎn)甲烷階段。在產(chǎn)甲烷的過程中，互營(yíng)微生物之間或者是微生物與外界物質(zhì)之間存在有電子轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象[29-30]。液相中的VFA，比如甲酸、乙酸等，在互營(yíng)菌和產(chǎn)甲烷菌的作用下，甲酸可作為電子轉(zhuǎn)移的載體，乙酸作為電子供體，轉(zhuǎn)化為甲烷。從圖5中可以看出，在第12 天，R1 和R2 液相中VFA 含量較高，分別為7129.5mg/L 和7945.3mg/L；在 第9 天，R3 液相 中VFA 含量為4042mg/L，遠(yuǎn)低于R1 和R2 中VFA 的含量。分析原因是由于R3（1∶2）混合原料中豬糞質(zhì)量為秸稈的2 倍，整體總VS 的含量較少，導(dǎo)致水解后原料中最大VFA 含量并不高。在第10 天左右，3組實(shí)驗(yàn)的VFA含量都達(dá)到最高水平，液相對(duì)應(yīng)的pH處于最低的狀態(tài)，在7.0～7.7之間，如圖6 所示。相比于其他兩組，R2 的pH 是最小值7.0，推測(cè)是因?yàn)镽2 實(shí)驗(yàn)組中秸稈含量較多，能跟酸反應(yīng)的堿性物質(zhì)相對(duì)較少。在第13 天之后，隨著VFA 中的很大一部分單酸被產(chǎn)甲烷菌利用開始轉(zhuǎn)化為甲烷，甲烷的產(chǎn)生速率達(dá)到最大，加上系統(tǒng)內(nèi)部的自我調(diào)節(jié)，相應(yīng)的液相pH 也開始緩慢上升最終至相對(duì)穩(wěn)定的范圍。第28天各組pH維持在8.3，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后（第51天，圖中未顯示）測(cè)得3組沼液pH均在7.5左右。同樣的，由于R3中豬糞含量多，體系偏堿性，pH始終在7.5以上。

由圖5和圖6可知，混合原料中VS含量越大的實(shí)驗(yàn)組（R1、R2），其在厭氧消化過程中的VFA濃度越高，但由于3組反應(yīng)器中產(chǎn)甲烷的過程都是相同的，所以VFA 濃度的整體變化趨勢(shì)是相同的。另外VS 含量較低的實(shí)驗(yàn)組（R3），在厭氧消化過程中pH的變化比較平緩。反應(yīng)體系中的VFA與pH互相驗(yàn)證，能在一定程度上反映產(chǎn)甲烷能力。

圖5 液相中VFA的變化

圖6 液相中pH的變化

2.3.2 碳氮比和堿度

實(shí)驗(yàn)原料的碳氮比對(duì)于厭氧消化體系中的氨氮濃度和VFA 含量的變化起著至關(guān)重要的作用。有多種研究表明，碳氮比處于15～18的范圍內(nèi)時(shí)，整個(gè)厭氧實(shí)驗(yàn)進(jìn)行地比較平穩(wěn)，這與初始原料的性質(zhì)和厭氧消化微生物的生長(zhǎng)環(huán)境密切相關(guān)[31-32]。如果反應(yīng)器中的碳氮比不合適，會(huì)造成反應(yīng)過程中VFA 或者是氨氮濃度的大量增加，影響厭氧微生物，特別是產(chǎn)甲烷菌群的活性，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)以失敗而告終[33]。本研究是中溫下進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，混合原料的碳氮比處于15～16之間，處于反應(yīng)體系穩(wěn)定運(yùn)行的合適范圍，能使厭氧微生物進(jìn)行正常的生長(zhǎng)代謝，很大程度上確保了系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

在厭氧消化的過程中，總堿度（total inorganic carbon,TIC）是衡量反應(yīng)體系緩沖能力強(qiáng)弱的重要指標(biāo)，是檢測(cè)反應(yīng)器能否平穩(wěn)運(yùn)行的重要參數(shù)，并且還可以估計(jì)液相中VFA濃度[34]。反應(yīng)過程中主要依靠堿度中和酸性物質(zhì)，維持pH 的穩(wěn)定性，保持消化微生物的活性。如圖7所示，從實(shí)驗(yàn)開始到第13 天，3 組實(shí)驗(yàn)TIC 的濃度均持續(xù)下降。在這個(gè)階段VFA的濃度在不斷增加，液相中的TIC因中和一部分VFA 被消耗，導(dǎo)致濃度大幅度降低。由于R2在實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)生的VFA含量最高，對(duì)應(yīng)的TIC濃度自然就最低，為3757.9mg/L。之后，隨著產(chǎn)甲烷階段VFA的消耗，TIC的濃度開始逐漸升高。在第28天，相比較R1和R2而言，R3的TIC濃度是最低的，僅比初始值提升了16.2%。與VFA濃度的變化趨勢(shì)相反，VS 含量較低的實(shí)驗(yàn)組（R3），液相中TIC的變化幅度較小，趨勢(shì)相對(duì)平緩，表明實(shí)驗(yàn)體系的緩沖能力相對(duì)較弱。R2 實(shí)驗(yàn)組液相中TIC 的變化幅度很大，造成這種結(jié)果的原因很可能是原始混合物料中VS含量的不同。

圖7 液相中TIC的變化

2.4 微生物群落分析

厭氧消化實(shí)驗(yàn)啟動(dòng)之后，對(duì)3個(gè)反應(yīng)器每周取一次沼液（循環(huán)的接種液），總計(jì)取4次，加上1份實(shí)驗(yàn)開始前的接種液，共13 份樣品進(jìn)行微生物分析。

2.4.1 細(xì)菌

從圖8～10 中可以看出，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，在R1反應(yīng)器中，梭菌科（Clostridiaceae）在實(shí)驗(yàn)啟動(dòng)前期大幅度降低（由23.53%降到最低8.21%），而后緩慢增加；紫單胞菌科（Porphyromonadaceae）在實(shí)驗(yàn)啟動(dòng)之后增加很明顯（由1.46%增加到最大22.4%），R2與R3反應(yīng)器中此菌的變化情況均與此類似。假單胞菌科（Pseudomonadaceae）屬于革蘭氏陰性菌，表面極易生菌毛，能運(yùn)動(dòng)，多數(shù)具有分解蛋白質(zhì)和脂肪的能力，是一種能廣泛地利用有機(jī)化合物作為碳源和產(chǎn)生能量的電子供體。此菌科含量在實(shí)驗(yàn)開始后有部分增加，而后又逐漸降低。對(duì)比R2、R3反應(yīng)器，可以發(fā)現(xiàn)假單胞菌在實(shí)驗(yàn)開始初期增加較大，隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，后期含量較小。推測(cè)原因是R2 中的秸稈含量是豬糞的2 倍，秸稈中的纖維素類物質(zhì)屬于易降解成分，優(yōu)先被微生物降解成小分子物質(zhì)，之后轉(zhuǎn)化為甲烷，剩余木質(zhì)素成分難以被微生物降解利用[35]，小分子物質(zhì)含量愈發(fā)減少，導(dǎo)致相對(duì)應(yīng)的假單胞菌科含量開始下降；推測(cè)R3 中本身豬糞含量相對(duì)較多，也即初始階段易降解成分較多，原料的利用率相對(duì)較高，所以產(chǎn)氣量較大，然后在厭氧消化的后期，原料中易降解的成分剩余較少，可被利用的有機(jī)化合物含量不足，不利于假單胞菌的生長(zhǎng)。另外，從圖7 可知，細(xì)菌Caldicoprobacteraceae的含量變化特別明顯（由0.9%增加到最大8.03%），它是一種嗜熱蛋白質(zhì)水解菌[36]，這可能與反應(yīng)體系一直保持在37℃有很大關(guān)系， 畢竟這樣的中溫環(huán)境有利于Caldicoprobacteraceae菌科的生長(zhǎng)。從圖9和圖10中可以看出，R2和R3反應(yīng)器的檢測(cè)結(jié)果顯示，此菌變化趨勢(shì)與R1反應(yīng)器中基本一致。特別是在R2反應(yīng)器中，此細(xì)菌含量增幅最大（由0.9%增加到最大11.95%）。

圖8 R1細(xì)菌群落的變化

圖9 R2細(xì)菌群落的變化

圖10 R3細(xì)菌群落的變化

2.4.2 古菌

首先，從圖11～13 中很容易發(fā)現(xiàn)，3 個(gè)厭氧消化實(shí)驗(yàn)啟動(dòng)之后， 除了甲烷嗜甲基菌科（Methanomethylophilaceae），古菌群落的含量相比于原始接種物中古菌的含量都有明顯下降。原因可能是多數(shù)微生物在這個(gè)過程中需要時(shí)間去適應(yīng)周邊的生存環(huán)境。隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，R1 反應(yīng)器中甲烷微菌科（Methanomicrobiaceae）的含量明顯降低，最終有小幅度的提升（由14.98%降到最低1.38%，后回升到10.32%）；在R2 與R3 反應(yīng)器中，甲烷微菌科的變化趨勢(shì)與此類似，并且更加顯著。在厭氧消化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的前后階段，不管是R1、R2還是R3反應(yīng)器，甲烷桿菌科（Methanobacteriaceae）的含量變化是最大的。因?yàn)榧淄闂U菌是以甲烷為特異性代謝產(chǎn)物的細(xì)菌，是整個(gè)厭氧消化產(chǎn)甲烷過程順利進(jìn)行的關(guān)鍵細(xì)菌之一。從3個(gè)圖中可以看到，在實(shí)驗(yàn)開展后，第3次取樣的測(cè)試結(jié)果（R1-3、R2-3、R3-3）顯示甲烷桿菌的含量有一定程度的下降，這也與那段時(shí)間產(chǎn)甲烷速率緩慢相對(duì)應(yīng)。另外，R3 中甲烷桿菌科（Methanobacteriaceae）的含量在同階段的3個(gè)反應(yīng)器中是最大的。甲烷八疊球菌科（Methanosarcinaceae）的含量只有在第3、第4次取樣的階段，含量明顯高于原始接種物，3個(gè)反應(yīng)器變化情況類似。并且在前3 周，R2 反應(yīng)器中的甲烷八疊球菌的含量比其他兩組更有優(yōu)勢(shì)。這種菌是已知的可以作為種間直接電子傳遞（DIET）中電子受體的古菌，它的存在能夠加快微生物群落間的電子傳遞效率，增加底物的降解速率[37]。所以推測(cè)原因是在此階段，首先是易降解的成分大量被降解，之后剩余難降解的木質(zhì)素等物質(zhì)再緩慢的分解，依靠甲烷八疊球菌加快剩余成分的降解速率，導(dǎo)致最終原料的累計(jì)產(chǎn)甲烷量有所提高。甲烷嗜甲基菌科（Methanomethylophilaceae）是一種嚴(yán)格好氧的革蘭氏陰性菌桿菌，專性甲基營(yíng)養(yǎng)菌。所以在接種物加入反應(yīng)器中之后，依靠秸稈空隙間的氧氣，甲烷嗜甲基菌科（Methanomethylophilaceae）的含量開始增加，隨著整個(gè)反應(yīng)器中氧氣含量降低，它逐漸減少甚至消失。圖13也說明R3相比于R1和R2，較快地達(dá)到了完全厭氧的條件，這也與R3混合原料中秸稈含量最少有關(guān)。

圖11 R1古菌群落的變化

圖12 R2古菌群落的變化

圖13 R3古菌群落的變化

2.4.3 微生物多樣性分析

根據(jù)微生物群落分析的數(shù)據(jù)結(jié)果，得到的樣品中物種多樣性指數(shù)如表3所示。其中Chao指數(shù)反映的是微生物群落的豐富度，用來估計(jì)物種的總數(shù)。Shannon 指數(shù)反映的是群落的多樣性?？傮w來看，細(xì)菌群落的豐富度和多樣性都遠(yuǎn)高于古菌。相比于接種物，3個(gè)反應(yīng)器中細(xì)菌群落的豐富度和多樣性有不同趨勢(shì)的波動(dòng)。第2周、第3周取樣的結(jié)果顯示，R1 和R3 中微生物的豐富度和多樣性都比較低，R2 中微生物的豐富度和多樣性都高于其他兩組。說明相比于R1和R3，R2依靠細(xì)菌群落的優(yōu)勢(shì)可以快速啟動(dòng)原料的水解過程，這或許也是其產(chǎn)氣效果較好的一個(gè)原因。對(duì)于古菌群落，在取樣的4周時(shí)間里，3組反應(yīng)器中微生物群落的豐富度和多樣性都是先不同程度的下降，之后有增加的趨勢(shì)。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，R2 反應(yīng)器中整體的古菌群落豐富度和多樣性處于較高的水平，并且變化比較平穩(wěn)。這樣的古菌群落變化過程有利于實(shí)驗(yàn)過程產(chǎn)氣和體系平穩(wěn)運(yùn)行。

表3 樣品中微生物的多樣性指數(shù)

3 結(jié)論

使用回流式高固厭氧消化反應(yīng)器進(jìn)行間歇性噴淋實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如下。

（1）秸稈與豬糞的最佳配比為2∶1，此時(shí)甲烷的產(chǎn)量相對(duì)較大，為131.81mL/gVS，在實(shí)驗(yàn)啟動(dòng)的前3 周，甲烷八疊球菌（Methanosarcinaceae）的相對(duì)含量較高，實(shí)驗(yàn)體系中細(xì)菌和古菌群落的豐富度以及多樣性都優(yōu)于其他兩組。

（2）混合原料中豬糞含量較大的實(shí)驗(yàn)組，甲烷桿菌（Methanobacteriaceae）的相對(duì)含量比較高。

（3）對(duì)于高固厭氧消化反應(yīng)，此間歇性滲濾液回流能夠在節(jié)能增效的前提下，縮短厭氧干發(fā)酵的啟動(dòng)期，提高產(chǎn)甲烷效率。