雪蓮注射液對(duì)重癥急性胰腺炎患者的治療作用

錢晶，王小紅，藍(lán)宇

急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是臨床常見的急腹癥之一，其以輕癥多見，病程呈自限性，其中10%～30%的患者會(huì)進(jìn)展為重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）［1］。SAP病情進(jìn)展快，病情危重，常并發(fā)多臟器功能不全綜合征，病死率高達(dá)20%～30%［2］，給家庭和社會(huì)帶來沉重負(fù)擔(dān)。因此，探索SAP 的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的治療藥物尤為重要。研究表明，AP的嚴(yán)重程度取決于炎癥反應(yīng)及胰蛋白酶激活的狀況，自噬受損則可能會(huì)促進(jìn)胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)胰蛋白酶原的激活以及炎癥反應(yīng)的加?。?-4］。本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雪蓮注射液對(duì)SAP 大鼠有確切的治療作用［5-6］。目前有關(guān)雪蓮注射液治療SAP患者的臨床報(bào)道尚少見。本研究旨在探討雪蓮注射液對(duì)SAP 的臨床治療作用及其作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2018 年6 月—2019 年9 月在南京鼓樓醫(yī)院集團(tuán)儀征醫(yī)院普通外科及消化科住院治療的SAP患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）按照《中國急性胰腺炎診治指南（2013，上海）》標(biāo)準(zhǔn)確診AP［7］。SAP的診斷標(biāo)準(zhǔn)為具備AP的臨床表現(xiàn)和生物化學(xué)改變，須伴有持續(xù)的器官功能衰竭，即持續(xù)48 h 以上且不能自行恢復(fù)的呼吸系統(tǒng)、心血管或腎臟功能衰竭，可累及1個(gè)或多個(gè)臟器。（2）發(fā)病24 h內(nèi)入院。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）慢性疾病臨終狀態(tài)者。（2）合并外傷、免疫缺陷病、嚴(yán)重心血管疾病、終末期肝腎疾病、惡性腫瘤者，以及孕婦、哺乳期婦女。（3）近3個(gè)月內(nèi)使用激素或免疫抑制劑者。（4）存在嚴(yán)重慢性臟器功能障礙，患者正進(jìn)行有可能干擾本研究的其他治療。（5）病因含有醫(yī)源性或正在進(jìn)行有可能干擾本研究的其他治療。（6）臨床研究期間死亡或未能執(zhí)行完整治療方案者。納入符合上述條件的SAP患者50例，其中男27例，女23例；年齡28～72 歲，平均（52.78±13.55）歲。采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為常規(guī)治療組25例和常規(guī)治療+雪蓮注射液治療組（雪蓮注射液組）25 例。另擇同期健康體檢志愿者25 例為正常對(duì)照組。正常對(duì)照組、常規(guī)治療組和雪蓮注射液組年齡分別為（54.20±13.22）、（51.36±14.00）、（51.80±13.39）歲，男女分別是15/10、12/13、14/11例，3組年齡（F=0.320）、性別（χ2=0.753）比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，獲患者或家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 治療方法 常規(guī)治療組患者住院后即給予禁食、水，胃腸減壓、生長抑素（瑞士Merck Serono SA Aubonne Branch 公司產(chǎn)品，3 mg/支）抑制胰液分泌，烏司他?。◤V東天普生化醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品，10萬U/支）抑制胰酶，雷貝拉唑（江蘇奧賽康藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品，20 mg/支）抑制胃酸，導(dǎo)瀉、消脹、止痛、抗感染及營養(yǎng)支持等治療。雪蓮注射液組在常規(guī)治療的基礎(chǔ)上，給予0.5%雪蓮注射液（新疆西域藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，2 mL/支，含總黃酮10 mg/支，國藥準(zhǔn)字號(hào)為Z65020023）4 mL，肌內(nèi)注射，每日1 次，連用10 d。正常對(duì)照組不給予任何治療。

1.3 觀察指標(biāo) （1）自噬及炎性因子。治療前及治療后10 d晨起空腹抽取受檢者外周靜脈血，采集的血液標(biāo)本常溫下靜置2 h，然后高速離心機(jī)4 ℃下以3 000 r/min 離心15 min，取上清液，分裝入EP 管中，放置入-80 ℃冰箱內(nèi)保存。采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）［8］檢測血清Beclin-1、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）水平，試劑盒購自武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司；采用ELISA［9］檢測血清核因子（NF）-κB p65、腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細(xì)胞介素（IL）-1β及IL-10水平，試劑盒購自深圳晶美生物工程有限公司，具體操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。（2）急性生理與慢性健康評(píng)分（APACHE）Ⅱ和胰腺改良CT 嚴(yán)重指數(shù)評(píng)分（MCTSI）。采用APACHEⅡ評(píng)分［10］評(píng)估 AP 病情變化及預(yù)后，胰腺 MCTSI 評(píng)分［11］評(píng)估SAP炎癥反應(yīng)及胰腺壞死程度。（3）記錄常規(guī)治療組、雪蓮注射液組患者的住院時(shí)間及腹痛緩解時(shí)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SAS 8.2 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，3 組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗(yàn)；2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；各組治療前后各指標(biāo)比較采用重復(fù)測量資料的方差分析，組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)各指標(biāo)比較采用Profile 法，同一時(shí)間點(diǎn)各指標(biāo)2 組間比較采用Lsmeanst法；計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組自噬及炎性因子水平比較 治療前，常規(guī)治療組和雪蓮注射液組患者血清Beclin-1、LC3、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β 和IL-10 水平均明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.05），常規(guī)治療組與雪蓮注射液組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與治療前比較，治療后10 d 常規(guī)治療組和雪蓮注射液組血清Beclin-1、LC3、NF-κB p65、TNF-α 和IL-1β 水平明顯降低，IL-10水平明顯升高（P＜0.05）。治療后10 d雪蓮注射液組血清Beclin-1、LC3、NF-κB p65、TNF-α和IL-1β 水平低于常規(guī)治療組，IL-10水平高于常規(guī)治療組（P＜0.05），見表1。

2.2 常規(guī)治療組與雪蓮注射液組APACHEⅡ、胰腺M(fèi)CTSI 評(píng)分比較 治療前，雪蓮注射液組與常規(guī)治療組APACHEⅡ、胰腺M(fèi)CTSI 評(píng)分差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與治療前比較，治療后10 d 常規(guī)治療組和雪蓮注射液組APACHEⅡ、胰腺M(fèi)CTSI 評(píng)分均明顯降低。治療后10 d 雪蓮注射液組APACHEⅡ、胰腺M(fèi)CTSI 評(píng)分均低于常規(guī)治療組（P＜0.05），見表2。

2.3 常規(guī)治療組與雪蓮注射液組住院時(shí)間、腹痛緩解時(shí)間比較 雪蓮注射液組患者住院時(shí)間和腹痛緩解時(shí)間分別為（17.84±2.88）d、（5.36±0.81）d，明顯低于常規(guī)治療組的（22.16±3.26）d、（7.52±1.09）d（t分別為4.960、8.090，P＜0.05）。

3 討論

目前AP的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，研究認(rèn)為炎癥反應(yīng)及胰腺腺泡細(xì)胞異常自噬對(duì)AP 的發(fā)生發(fā)展具有重要作用。受損的胰腺腺泡細(xì)胞可釋放多種炎性因子，從而產(chǎn)生炎性細(xì)胞浸潤及細(xì)胞炎性因子間的級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，導(dǎo)致胰腺腺泡細(xì)胞的壞死［12-13］。自噬與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，自噬受損，炎性小體不能被及時(shí)清除，導(dǎo)致炎性小體過度堆積，誘導(dǎo)IL-1β表達(dá)水平上調(diào)，上調(diào)的IL-1β 進(jìn)一步加重自噬受損并且促進(jìn)了胰蛋白酶原的激活，從而導(dǎo)致AP 的發(fā)生發(fā)展［14］。

Beclin-1 基因也稱BECN1 基因，是酵母自噬相關(guān)基因6 的同系物，也是哺乳動(dòng)物參與自噬的特異性基因。 Beclin-1 與磷酸肌醇 3 激酶（phosphoinositide-3-kinase，PI3K）結(jié)合是自噬中自噬體形成的起始條件。LC3 是公認(rèn)的自噬體標(biāo)志物，可在一定程度上反映自噬體的數(shù)量［15］。作為Rel蛋白家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子，NF-κB是由5個(gè)亞基（p50、p52、p65、c-Rel、Rel B）組成的同源或異源二聚體，而NF-κB p65 是其主要亞基。在正常生理?xiàng)l件下，NF-κB與κB抑制劑（inhibitor of the kappa B，IκB）蛋白家族成員結(jié)合而失活。通過細(xì)胞刺激啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)第二信使系統(tǒng)可以誘導(dǎo)IκB磷酸化或酸化，導(dǎo)致IκB從NF-κB 中降解和分離，進(jìn)一步激活NF-κB，使其從細(xì)胞質(zhì)遷移到細(xì)胞核，并與DNA啟動(dòng)子區(qū)域中相應(yīng)靶基因的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，從而產(chǎn)生一系列與免疫炎癥反應(yīng)相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄程序，同時(shí)誘導(dǎo)包括TNF-α、IL-1β 及IL-6 在內(nèi)的多種促炎細(xì)胞因子的高表達(dá)。NF-κB 激活使p65 磷酸化，使其從細(xì)胞質(zhì)遷移到細(xì)胞核，并在其中進(jìn)一步調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。IL-10可以通過抑制NF-κB 的活性及其與DNA 結(jié)合能力來阻止NF-κB啟動(dòng)相關(guān)促炎因子基因的轉(zhuǎn)錄，而NF-κB通路是參與調(diào)節(jié)人體炎癥反應(yīng)的重要信號(hào)通路［16］。

Tab.1 Comparison of serum levels of Beclin-1,LC3,NF-κB p65,TNF-α,IL-1β and IL-10 between three groups表1 3組血清Beclin-1、LC3、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β和IL-10水平比較 （n=25，）

Tab.1 Comparison of serum levels of Beclin-1,LC3,NF-κB p65,TNF-α,IL-1β and IL-10 between three groups表1 3組血清Beclin-1、LC3、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β和IL-10水平比較 （n=25，）

＊P＜0.05；a與正常對(duì)照組比較，b與常規(guī)治療組比較，P＜0.05；F1為同一組別治療前、后比較；F2為3組治療前比較，t為常規(guī)治療組與雪蓮注射液組治療后比較

組別正常對(duì)照組常規(guī)治療組雪蓮注射液組F2或t LC3（μg/L）Beclin-1（μg/L）治療前0.14±0.02 0.71±0.08a 0.71±0.08a 543.790＊治療后10 d-0.43±0.04 0.33±0.04b 9.750＊F1 F1 F1 1 995.440＊3 547.780＊治療前0.15±0.02 0.92±0.08a 0.91±0.08a 1 114.440＊治療后10 d-0.59±0.04 0.49±0.04b 9.737＊2 722.840＊4 561.560＊NF-κB p65（mg/L）治療前10.86±1.39 41.50±3.67a 41.48±3.77a 495.030＊治療后10 d-29.13±2.93 22.92±3.72b 7.698＊6 753.080＊112 028.000＊組別正常對(duì)照組常規(guī)治療組雪蓮注射液組F2或t IL-1β（mg/L）IL-10（mg/L）TNF-α（mg/L）治療前12.56±1.43 60.89±6.96a 61.49±7.25a 564.320＊治療后10 d F1 F1 F1 47.38±4.41 36.36±4.39b 10.563＊697.390＊1 919.840＊治療前2.51±0.85 6.52±1.49a 6.68±1.54a 52.970＊治療后10 d-5.60±1.55 4.61±1.50b 2.624＊409.190＊4 526.300＊治療前9.88±1.18 13.14±1.92a 13.36±1.98a 371.100＊治療后10 d-21.17±1.91 29.74±1.68b 17.493＊35 921.900＊26 380.000＊

Tab.2 Comparison of APACHEⅡand pancreas MCTSI scores between two groups表2 常規(guī)治療組與雪蓮注射液組APACHEⅡ、胰腺M(fèi)CTSI評(píng)分比較 （n=25，分，）

Tab.2 Comparison of APACHEⅡand pancreas MCTSI scores between two groups表2 常規(guī)治療組與雪蓮注射液組APACHEⅡ、胰腺M(fèi)CTSI評(píng)分比較 （n=25，分，）

＊P＜0.05

組別常規(guī)治療組雪蓮注射液組t APACHE Ⅱ胰腺M(fèi)CTSI治療前15.00±1.44 15.12±1.48 0.290治療后10 d 11.68±1.22 10.40±1.00 4.070＊F F 888.900＊1 478.650＊治療前5.76±1.67 5.92±1.68 0.340治療后10 d 4.40±1.63 3.36±1.50 2.350＊29.390＊195.050＊

研究表明，NF-κB信號(hào)通路參與了SAP的發(fā)生、發(fā)展［17］。Yang 等［18］研究發(fā)現(xiàn)，抑制 NF-κB 信號(hào)通路，導(dǎo)致Beclin-l 及LC3Ⅱ表達(dá)水平下降，自噬空泡形成減少，AP嚴(yán)重程度減輕。自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤通過調(diào)節(jié)NF-κB 信號(hào)通路和蛋白酶-1-IL-1β信號(hào)通路來減弱自噬通量并減輕炎癥反應(yīng)，從而降低炎性因子水平，減少對(duì)器官的損傷［19］。本研究結(jié)果顯示，SAP 患者入院時(shí)血清Beclin-1、LC3、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β、IL-10 均較正常對(duì)照組明顯升高，提示炎癥反應(yīng)NF-κB信號(hào)通路及胰腺腺泡細(xì)胞異常自噬參與SAP 的發(fā)生發(fā)展，與以往文獻(xiàn)報(bào)道一致。

雪蓮注射液是從天山雪蓮中提取的以雪蓮黃酮為主要成分的純中藥單方制劑，具有抗氧化、抗炎和免疫調(diào)節(jié)等作用，且無明顯毒性和不良反應(yīng)［20］。本課題組前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，雪蓮注射液可通過抑制SAP大鼠NF-κB信號(hào)通路的激活，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的合成與釋放，從而減輕胰腺損傷；其可通過激活PI3K/蛋白激酶B 信號(hào)通路，改善腦微循環(huán)，從而對(duì)大鼠SAP并發(fā)腦損傷具有治療作用［5-6］。

本研究結(jié)果顯示，與治療前比較，治療后10 d常規(guī)治療組和雪蓮注射液組血清Beclin-1、LC3水平明顯降低，且雪蓮注射液組血清Beclin-1、LC3 水平低于常規(guī)治療組，提示雪蓮注射液具有抑制SAP 患者胰腺腺泡細(xì)胞異常自噬的作用；另外，與治療前比較，治療后10 d 常規(guī)治療組和雪蓮注射液組血清NF-κB p65、TNF-α 和IL-1β 水平明顯降低，IL-10水平明顯升高；且雪蓮注射液組血清NF-κB p65、TNF-α 和IL-1β水平低于常規(guī)治療組，IL-10水平高于常規(guī)治療組，提示雪蓮注射液具有抑制SAP 患者炎癥反應(yīng)NF-κB信號(hào)通路的作用。此外，治療后雪蓮注射液組APACHEⅡ及胰腺M(fèi)CTSI評(píng)分下降幅度均高于常規(guī)治療組，且住院時(shí)間和腹痛緩解時(shí)間均低于常規(guī)治療組，提示雪蓮注射液對(duì)SAP 患者有較好的輔助治療作用。

綜上所述，雪蓮注射液可能通過抑制胰腺腺泡細(xì)胞異常自噬，阻斷NF-κB 信號(hào)通路，進(jìn)一步抑制炎癥反應(yīng)，從而對(duì)SAP患者發(fā)揮輔助治療作用。