參威骨痹片質(zhì)量標準及藥效學研究

李江 陳凌云 陳坤 付鵬 彭霜 李嬌 余曉玲

摘要：目的?建立本品質(zhì)量標準并考察其對骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠膝關(guān)節(jié)液TNF-α的影響。方法?采用顯微照相系統(tǒng)對當歸、川芎、桂枝進行顯微鑒別;采用TLC法對桂枝、熟地、秦艽進行薄層鑒別;采Kedde反應(yīng)對強心苷進行限量檢查;采用多波長-HPLC法同時對馬錢苷酸、龍膽苦苷、芍藥苷進行含量測定;采用ELISA法測定骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠關(guān)節(jié)液中的TNF-α。結(jié)果?顯微鑒別特征較易見;TLC法可檢出上述藥味，且陰性無干擾;強心苷含量在安全范圍內(nèi);馬錢苷酸、龍膽苦苷、芍藥苷平均含量分別為174.04、207.73、280.45 μg/g（n=6）;與正常組相比模型組大鼠膝關(guān)節(jié)TNF-α水平顯著升高（P<0.001），與模型組相比參威骨痹片高、低劑量組顯著降低（P<0.01）。結(jié)論?所建標準可用于本品質(zhì)量控制，參威骨痹片對膝關(guān)節(jié)炎模型大鼠關(guān)節(jié)液TNF-α有抑制作用。

關(guān)鍵詞：參威骨痹片;質(zhì)量標準;顯微鑒別;TLC鑒別;強心苷檢查;馬錢苷酸;龍膽苦苷;芍藥苷;關(guān)節(jié)炎;腫瘤壞死因子

中圖分類號：R927.11?文獻標志碼：A?文章編號：1007-2349（2020）06-0074-05

“參威骨痹方”由威靈仙、小紅參、白芍等藥味組成，其中威靈仙為治療骨痹的常用藥物，能祛風除濕，通絡(luò)止痛;小紅參（茜草科茜草屬云南茜草（Rubia yunnanensis Diels）的干燥根莖[1]）為云南特色民族藥具活血通經(jīng)、祛風除濕、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛、調(diào)養(yǎng)氣血的功效[2-3];白芍、當歸、川芎可輔助小紅參養(yǎng)血活血、通絡(luò)除痹，懷牛膝、桑寄生補益肝腎，強筋健骨，桂枝、獨活、秦艽祛風散寒除濕，全方合用共奏滋補肝腎，祛風除濕、活血止痛之功效，在多年臨床使用中對骨性關(guān)節(jié)炎有顯著的療效[4]。課題組前期已經(jīng)完成參威骨痹片制備工藝研究，本文將建立參威骨痹片質(zhì)量標準并對其藥效學進行初步研究，為本品后期質(zhì)量標準提升、治療骨痹的機理研究和臨床推廣奠定基礎(chǔ)。

1?材料

1.1?儀器?Agilent 1100高效液相色譜系統(tǒng)（美國AgiLent公司）;Diamonsil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm，迪馬科技公司）;AB265-SMETTLER TOLEDO分析天平（瑞士梅特勒-托利多集團）;WFH-203B三用紫外分析儀（上海精科實業(yè)有限公司）;SK2200HP超聲波清洗器（上?？茖С晝x器有限公司）;薄層層析硅膠G板（青島海洋化工分廠、青島鼎康硅膠有限公司）。

1.2?試藥?馬錢苷酸（批號：111865-201704），龍膽苦苷（批號：110770-201013），芍藥苷（批號：110736-201842），桂枝對照藥材（批號：121191-201605），熟地黃對照藥材（批號：121196-201406），秦艽對照藥材（批號：121199-201003）均購自中國食品藥品檢定研究院;雙醋瑞因膠囊（昆明積大制藥股份有限公司）;參威骨痹片（云南中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院提供，批號：2018-0603、2018-0604、2018-0605）;TNF-α檢測試劑盒（南京建成生物科技有限公司）;色譜純乙腈;其余試劑均為分析純。

1.3?動物?SPF級大鼠（湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2018-0003）。

2?方法與結(jié)果

2.1?顯微鑒別?本品中當歸、川芎、桂枝以細粉入藥，故需對此3味藥進行顯微鑒別。結(jié)果顯示，本品具紡錘形韌皮薄壁細胞，表面有極細微的斜向交錯紋理，可見菲薄的橫隔（當歸）[5];具草酸鈣晶體呈類圓形團塊或類簇晶狀，直徑10～25 μm，含深黃棕色木栓細胞，表面觀呈多角形，微波狀彎曲（川芎）[6];具類方形或類圓形石細胞，直徑30～64 μm，壁厚，有的一面菲薄，具韌皮纖維大多成束或單個散離，無色或棕色，梭狀，有的邊緣齒狀突出，直徑12～40 μm，壁甚厚，木化，孔溝不明顯（桂枝）[7]。結(jié)果見圖1。

2.2?TLC鑒別?取本品粉末2 g，按下述方法制備。（1）加乙醇20 mL，超聲15 min，濾液蒸干，加無水乙醇1 mL使溶解;（2）加80%乙醇50 mL，超聲30 min，濾液蒸干，加水10 mL使溶解，用水飽和正丁醇萃取4次，每次10 mL，水飽和正丁醇層蒸干，加甲醇2 mL溶解;（3）加甲醇20 mL，超聲20 min，濾液蒸干，加甲醇1 mL使溶解，分別得桂枝、熟地黃、秦艽TLC鑒別供試品溶液，并取適量對照藥材和陰性樣品同法制備對照藥材溶液和陰性對照溶液，分別以下述展開劑展開，石油醚（60℃～90℃）-乙酸乙酯（17：3），二甲苯-乙酸乙酯（1：1），乙酸乙酯-甲醇-水（10：2：1），前二者用二硝基苯肼乙醇試液顯色，最后一種于254nm紫外燈下檢視[8-10]。結(jié)果表明，各藥均可被檢出，且陰性無干擾。結(jié)果見圖2。

2.3?強心苷限量檢查[11] 本品處方含桑寄生，其中的強心苷具有心臟毒性，故需對其進行限量檢查。取本品粉未45 g（本品每4.5 g含桑寄生1 g），加80%乙醇250 mL，加熱回流30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加熱水10 mL使溶解，濾過，濾液加乙醚振搖提取4次，每次20 mL，棄去乙醚層，取水層，加醋酸錯飽和溶液至沉淀完全，濾過，濾液加乙醇20 mL，加硫酸鈉包和溶液脫鉛，濾過，濾液加三氯甲烷振搖提取3次，每次15 mL，合并三氯甲烷液，蒸干，殘渣加三氯甲烷l mL溶解。取溶解液點于濾紙上，干后，滴加堿性3，5-二硝基苯甲酸溶液（取二硝基苯甲酸試液與氫氧化鈉試液1：1混合），未顯紫紅色，表明本品所含強心苷在安全劑量內(nèi)。結(jié)果見圖3。

2.4?多指標含量測定

2.4.1?溶液的配制?取芍藥苷、龍膽苦苷、馬錢苷酸適量加甲醇配制為分別含0.05、0.3、0.2 mg/mL的混合溶液。取本品2 g，精密稱定，加甲醇定容至25 mL，稱重，超聲30 mL，用甲醇補重，濾過，取續(xù)濾液20 mL，蒸干，查殘加甲醇定容至5 mL，作為供試品溶液。取不含白芍的陰性樣品，按上述供試品制備方法制備，作為白芍陰性對照溶液。取不含秦艽的陰性樣品，按上述供試品制備方法制備秦艽陰性對照溶液。

2.4.2?專屬性試驗?以C18柱為色譜柱;乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相（0～2 min時為12：88，2～3 min時由12：88梯度變化到15：85，3～6 min時為15：85，6～7 min時由15：85梯度變化到20：80，7～15 min時為20：80，15～16 min時由20：80梯度變化到60：40，V/V）;流速為1 mL/min，檢測波長為236、276、230 nm;柱溫為30℃;進樣量為10 μL進行檢測。結(jié)果顯示，各指標成分色譜峰分離度良好，且無陰性干擾。結(jié)果見圖3。

2.4.3?線性關(guān)系及范圍?精密稱取芍藥苷8.15mg（含量以97.4%計），加甲醇定容至5 mL作為芍藥苷對照品儲備液。精密稱取馬錢苷酸2.21mg（含量以94.7%計），龍膽苦苷8.11mg（含量以96.9%），并精密移取芍藥苷對照品儲備液2 mL，加甲醇定容至10 mL，作為混合對照品溶液。取上述混合對照品溶液6 mL，加甲醇定容至10 mL，依次反復操作，得馬錢苷酸濃度分別為209.29、125.57、75.34、45.21、27.12、16.27 μg/mL，龍膽苦苷濃度分別為785.86、471.52、282.91、169.75、101.85、61.11 μg/mL，芍藥苷濃度分別為317.52、190.51、114.31、68.59、41.15、24.69 μg/mL，按“2.4.2”項下條件檢查，計算得回歸方程分別為y馬=3.807x-1.815（r=0.999 67）、y龍=2.295x+6.357（r=0.999 25）、y芍=15.011+1.783（r=0.999 81）。

2.4.4?精密度試驗?取“2.4.1”項下混合對照溶液，按“2.4.2”項下條件檢測，連續(xù)進樣6次，計算得馬錢苷酸、龍膽苦苷、芍藥苷峰面積的RSD分別為0.27、0.12、0.17%，表明該儀器精密度良好。

2.4.5?穩(wěn)定性試驗?取“2.4.1”項下混合對照溶液及供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12 h，按“2.4.2”項下進行試驗，計算得馬錢苷酸、龍膽苦苷、芍藥苷對照品溶液的峰面積RSD分別為0.34、0.37、0.63%，供試品溶液的峰面積RSD值分別為0.27、1.04、0.63%，表明混合對照品及供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.6?重復性試驗?取同一批（2018-0603）次樣品6份，按“2.4.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.4.2”項下色譜條件進行試驗，計算得馬錢苷酸、龍膽苦苷、芍藥苷平均含量分別為165.37、278.44、203.81 μg/g，RSD分別為1.76、1.42、1.97%，表明該方法重復性良好。

2.4.7?準確度試驗?自同一批次（2018-0603）樣品中取6份粉末，每份1 g，精密稱定，每份加入混合對照品溶液（馬錢苷酸、龍膽苦苷、芍藥苷濃度分別為125.57、471.52、190.51 μg/mL）1 mL，按“2.4.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.4.2”項下色譜條件進行試驗，計算得馬錢苷酸、龍膽苦苷、芍藥苷平均回收率分別為99.41、103.17、98.99%，RSD分別為2.64、2.46、2.94%，結(jié)果見表1，表明該方法準確度良好。

2.4.8?樣品含量測定?取本品三批，每批兩份樣，按“2.4.1”和“2.4.2”項下條件檢測，結(jié)果顯示，馬錢苷酸、龍膽苦苷、芍藥苷平均含量分別為174.04、207.73、280.45 μg/g，RSD值分別為4.02、2.50、3.37%。結(jié)果見表2。

2.5?對骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠膝關(guān)節(jié)液TNF-α的影響

2.5.1?分組、造模及給藥?將60只大鼠分為正常組、模型組、陽性藥物（雙醋瑞因）組、參威骨痹片低劑量組、參威骨痹片高劑量組，每組12只。除正常組外，其余各組大鼠常規(guī)消毒后用2%戊巴比妥鈉注射液（0.3 mL/100 g）對大鼠進行腹腔麻醉，將大鼠仰臥捆綁于手術(shù)臺上，選擇右膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)剃毛，消毒，鋪菌，作1個0.5～1 cm的縱行切口，充分暴露右膝關(guān)節(jié)，切除右膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)副韌帶、前交叉韌帶，完整切除內(nèi)側(cè)半月板，遂層縫合傷口，用無菌敷料及繃帶包扎固定，術(shù)后連續(xù)5 d予以77萬U/kg·d-1青霉素肌注抗炎處理，模型組和對照組混合喂養(yǎng)，自由活動，連續(xù)4周，4周后按體重灌胃給藥（參威骨痹片低劑量組0.83 g/kg，參威骨痹片高劑量組1.66 g/kg，陽性藥物組10.50 mg/kg），每日1次，連續(xù)給藥4周[12-14]。

2.5.2?指標測定及數(shù)據(jù)分析?給藥結(jié)束后，正常飼養(yǎng)1周，處死，用以注射器抽取生理鹽水后，反復沖洗關(guān)節(jié)腔，收集關(guān)節(jié)液約2 mL，并放置于80℃的冰箱內(nèi)保存。采用ELISA法[15]測定大鼠關(guān)節(jié)液中TNF-α，以單因素方差分析進行組間比較。結(jié)果顯示，與正常組相比模型組大鼠膝關(guān)節(jié)液TNF-a水平顯著升高（P<0.001）;與模型組相比參威骨痹片高、低劑量組均顯著降低（P<0.01），說明參骨痹片對骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠膝關(guān)節(jié)液TNF-a有抑制作用，提示其對骨關(guān)節(jié)炎有治療效果。

3?討論

本文通過顯微鑒別、TLC鑒別、限量檢查、多指標成分測定的方式建立了較為完整的參威骨痹片質(zhì)量標準。其中含量測定指標成分芍藥苷可抑制軟骨細胞調(diào)亡及軟骨基質(zhì)破壞，從而發(fā)揮關(guān)節(jié)保護作用[16]，龍膽苦苷和馬錢苷酸可通過降低全血粘度及血清中IL-1β、PGE2、NO、COX-2含量起到對大鼠骨關(guān)節(jié)炎的治療作用[17]，以此3者為含量測定指標可更加全面、合理地對本品質(zhì)量進行控制。在強心苷限量檢測中，參考了15版《中國藥典》中10 g桑寄生藥材制備為1 mL供試品溶液后進行Kedde反應(yīng)的過程，將45 g本品（含10 g桑寄生藥材）制備為1 mL供試品溶液后進行檢查，使檢查時的上限與藥典中統(tǒng)一。本文在TLC鑒別中僅對桂枝、熟地黃、秦艽進行了鑒別，并未達到1/3處方藥味的業(yè)內(nèi)要求，但在前期工作已對本品中的當歸、威靈仙、川芎、白芍、獨活進行了TLC鑒別研究[18]，故本品目前已建立了足夠藥味的TLC鑒別方法。

腫瘤壞死因子（TNF-a）在骨關(guān)節(jié)炎癥病理過程中具有重要的意義，是能反應(yīng)出軟骨基質(zhì)溶解和軟骨破環(huán)的指標，其在骨關(guān)節(jié)炎軟骨下骨中可通過激活破骨細胞促進骨吸收的同時，通過成骨細胞介導，抑制成骨細胞合成口型膠原，抑制骨形成和鈣化，還可誘發(fā)骨母細胞產(chǎn)生一種破骨細胞活化因子，促進破骨細胞的骨吸收，進一步加劇對軟骨下骨的破壞[19]，因此本研究以關(guān)節(jié)液中TINF-a的水平來反應(yīng)骨關(guān)節(jié)炎的炎癥程度具有合理性。

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（收稿日期：2020-05-12）