木瓜SOD的提取及其活性測定方法的優(yōu)化

郭善軍 陳章寶

摘 ?要：目的 ?建立能準(zhǔn)確測定木瓜超氧化物岐化酶（SOD）活性的測定方法。方法 ?采用單因素試驗(yàn)分析法，通過探究鄰苯三酚自氧化反應(yīng)體系的最大吸收波長、測定時間段、緩沖液pH值、鄰苯三酚濃度和反應(yīng)溫度對自氧化速率的影響，建立了測定木瓜SOD活性的鄰苯三酚自氧化法最佳應(yīng)用體系;通過建立的木瓜SOD活性檢測方法優(yōu)化木瓜SOD提取條件。結(jié)果 ?鄰苯三酚自氧化法最佳測定條件為：檢測波長319nm，測定時間范圍3.5min，緩沖液pH8.20，反應(yīng)溫度25℃，鄰苯三酚濃度4.5mmol/L。木瓜SOD最佳提取工藝為：pH6.8的磷酸鹽緩沖液、超聲功率600W、超聲時間20min浸提木瓜SOD，丙酮分級沉淀法純化木瓜中的SOD，最終所得SOD用鄰苯三酚自氧化法測定活性為529.72U/mg。結(jié)論 ?建立了能準(zhǔn)確測定木瓜SOD活性的檢測方法，并篩選得到木瓜最佳SOD提取條件。

關(guān)鍵詞：超氧化物岐化酶 ?鄰苯三酚自氧化法 ?提取方法優(yōu)化

中圖分類號：TS20 ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1672-3791（2020）06（c）-0066-03

超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，簡稱SOD）是一種廣泛存在于自然界各種生物體內(nèi)的酸性蛋白，自從1969年，超氧化物岐化酶首次被Fridovich和McCord[1]從牛紅細(xì)胞中分離出來，發(fā)現(xiàn)其是一種重要的自由基清除劑，對治療因超氧游離基引起的各種疾病都有一定的療效，臨床可作為抗老化、抗炎癥、自身免疫疾病的治療藥品。

1 ?材料和方法

1.1 材料

鮮木瓜購買于重慶市綦江縣三角鎮(zhèn)木瓜海棠園。

1.2 方法

1.2.1 鄰苯三酚自氧化法的建立

具體情況見表1。

1.2.2 影響SOD活性測定的因素

將質(zhì)量濃度為258μg/mL SOD標(biāo)準(zhǔn)液，分別于37℃、60℃、100℃條件下，加熱處理0min、3min、5min、20min、60min，邊加熱邊用玻璃棒輕輕攪拌，加熱完成后，迅速放入冰水混合物中冷卻30min，然后分別取不同溫度下各時間段的SOD溶液，加入到SOD檢測體系中進(jìn)行測定。

1.2.3 SOD提取及其工藝優(yōu)化

（1）稱取20g的新鮮木瓜，用榨汁機(jī)使其組織破碎，加入0.2mol/L磷酸鹽緩沖液40mL，攪拌浸提過夜，用紗布濾去粗大的纖維物質(zhì)，5000rpm，4℃，離心10min，去除多糖和其他不溶雜質(zhì)。

（2）粗提液于0℃低溫循環(huán)水溶超聲處理，輔助木瓜SOD提取，5000rpm，4℃，離心10min得到提取液。

（3）提取液中加入10mL氯仿-乙醇（V氯仿∶V乙醇=3∶5）混合液作為萃取劑，攪拌過夜，5000rpm，4℃，離心10min，取上清，得粗酶液。

（4）將所得粗酶液于60℃恒溫水浴熱擊20min除雜蛋白，立即流水浴冷卻至室溫，5000rpm，4℃，離心20min，除去沉淀雜蛋白。

（5）采用硫酸銨鹽析法，向（4）中所得上清液中加入（NH4）2SO4至45%飽和濃度，攪拌過夜后，5000rpm，4℃，離心20min;取上清加入（NH4）2SO4至90%飽和度，攪拌過夜后，5000rpm，4℃，離心20min得到沉淀，0.2mol/L磷酸鹽緩沖液溶解，透析24h，取樣加入到SOD檢測體系中進(jìn)行測定。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 鄰苯三酚自氧化法的建立

2.1.1 鄰苯三酚自氧化最大吸收波長的選取

由圖1可以看出，4min內(nèi)鄰苯三酚自氧化產(chǎn)物的最大吸收峰為319nm，而在325nm、420nm處基本無吸收峰出現(xiàn)。與文獻(xiàn)報(bào)道的最大吸收峰420nm和325nm有一定差異。因峰的靈敏度和準(zhǔn)確度，該試驗(yàn)選擇波長319nm進(jìn)行測定。

2.1.2 鄰苯三酚自氧化測定時間范圍的選取

如圖2所示，為了準(zhǔn)確測定鄰苯三酚自氧化速率，該試驗(yàn)選取30～210s即3min時間段內(nèi)直線斜率來表示鄰苯三酚的自氧化速率△A0。

2.1.3 pH對鄰苯三酚自氧化速率的影響

如圖3所示，鄰苯三酚自氧化速率在堿性條件下隨pH的升高而增大，并且斜率逐漸增大，這可能與pH增大時鄰苯三酚的酚羥基中H+更易解離，形成的帶電基團(tuán)能量較高、不穩(wěn)定，而易被氧化有關(guān)。因此，綜合考慮諸因素的影響，該試驗(yàn)選擇pH8.2作為緩沖溶液適宜的pH值。

2.1.4 鄰苯三酚濃度對自氧化速率的影響

如圖4所示，鄰苯三酚自氧化速率隨其濃度的升高而增大，兩者呈線性關(guān)系，且鄰苯三酚自氧化進(jìn)程的吸光度值與時間的線性關(guān)系，隨其濃度的升高而降低。因此，該試驗(yàn)選用鄰苯三酚的濃度為4.5mmol/L。

2.2 影響SOD活性測定的因素分析

2.2.1 SOD活性測定范圍的選擇

鄰苯三酚自氧化抑制率在15%～60%之間時，SOD濃度與自氧化抑制率間基本呈正比關(guān)系。因此，測定樣品SOD活性時，調(diào)節(jié)樣品濃度，選取百分抑制率在50%左右的樣品濃度，此時測定的準(zhǔn)確度和靈敏度最佳。

2.2.2 SOD熱穩(wěn)定性試驗(yàn)

由圖5可知，標(biāo)準(zhǔn)SOD在37℃和60℃下加熱1h，SOD活性略有降低，但總體變化不大，說明SOD活性在37℃～60℃范圍內(nèi)比較穩(wěn)定。而SOD標(biāo)準(zhǔn)品在100℃下加熱失活后，依然能夠檢測出SOD活力，且活力在1h時反向增大，說明失活的SOD蛋白對檢測體系仍會造成干擾。因此，該試驗(yàn)選擇在60℃水浴20min，加熱去除雜蛋白。

2.2.3 維生素C對SOD檢測體系的影響

從表2結(jié)果說明，維生素C是對SOD檢測體系構(gòu)成干擾的小分子物質(zhì)，木瓜中含有較多的維生素C可影響SOD活性的檢測。因此，該試驗(yàn)后續(xù)將通過透析24h，排除VC對SOD檢測體系造成的影響。

2.3 木瓜SOD提取工藝優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的篩選

從表3可以看出，pH6.8磷酸鹽緩沖液的提取液酶活性最高。因此，pH6.8的磷酸鹽緩沖液提取木瓜SOD提取效果最好。

2.3.2 超聲萃取功率的篩選

由超聲功率篩選結(jié)果可知（見表4），隨著超聲功率的提高，木瓜SOD提取率明顯增加。但超聲功率過高，SOD活性反而有所下降。這可能是由于超聲功率過高引起了酶蛋白的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。綜合考慮，該試驗(yàn)選擇600W超聲功率為SOD提取的最佳功率。

2.3.3 木瓜中SOD的提取

木瓜通過提取純化后，采用鄰苯三酚自氧化法測定木瓜中SOD活性分別為529.72U/mgprot，說明篩選得到的木瓜SOD提取條件穩(wěn)定、可行。

3 ?結(jié)語

該試驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)分析法探究鄰苯三酚自氧化反應(yīng)體系的檢測條件，建立了鄰苯三酚自氧化法最佳應(yīng)用體系。試驗(yàn)證明，該體系測定結(jié)果穩(wěn)定且準(zhǔn)確。利用建立的鄰苯三酚自氧化法篩選木瓜SOD最佳提取條件的篩選，得到木瓜SOD提取的最佳條件，為將來開發(fā)利用木瓜內(nèi)SOD提供了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] McCord J，Waugh TA，Ritchie J M. Overexpression of manganese or copperzinc superzinc superoxide dismutase inhibits breast cancer growth[J].Free Radic Biol Med，2006，419（2）：226-237.

[2] 金紹黑.植物超氧化物歧化酶的提取、修飾制備工藝及其應(yīng)用研究[J].成都航空職燃學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，21（1）：44.

[3] 許雅娟，趙艷景，胡虹.鄰苯三酚自氧化法測定超氧化物歧化酶活性的研究[J].西南民族大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2006，32（6）：1208-1212.