李永麗 王亞紅 周 洲 曲良建
(1. 河南科技大學林學院 洛陽 471023; 2. 中國林業(yè)科學研究院森林生態(tài)環(huán)境與森林保護研究所, 國家林業(yè)和草原局森林保護重點實驗室 北京 100091)
新疆野蘋果(Malussieversii) 又名塞威氏蘋果,是我國重要的野生果樹資源,為現代栽培蘋果的原始祖先(閆鵬等, 2016)。在長期的進化過程中,新疆野蘋果擁有豐富的遺傳多樣性,具有抗旱、抗寒、抗病蟲和耐瘠薄等特點(馬闖等, 2018),引起眾多研究者的關注。關于新疆野蘋果的研究多集中在種群、生態(tài)及遺傳特性方面(田潤煒等, 2016; 陳學森等, 2006; 吳傳金等, 2008; 馮濤等, 2006),種子萌發(fā)特性(閆秀娜等, 2015)、繁育特性(秦偉等, 2010)、環(huán)境抗逆(徐彥等, 2010; 于瑋瑋等, 2016)和種質資源(秦偉等, 2011) 等,但有關新疆野蘋果內生菌的研究鮮有報道。筆者課題組已對新疆野蘋果內生細菌和內生真菌進行了較為系統(tǒng)的分離研究,已獲得對蘋果病原菌具較好生防潛力的內生細菌7株(李永麗等, 2020) 和內生真菌5株(王亞紅等, 2020)。
鏈霉菌(Streptomyces) 可產生多種對植物病原菌有拮抗作用的次生代謝產物,內生鏈霉菌廣泛分布于植物的根、莖、葉、果實和種子中。從植物體內分離的鏈霉菌具有很高的應用價值,很多鏈霉菌已經被開發(fā)用于植物病害生物防治(Coombsetal., 2003; 梁亞萍等, 2007; 涂璇等, 2008; 陳紅兵等, 2011; 王靖, 2011; 李慶蒙等, 2013; 沈玥, 2014; 張志斌等, 2015; 王相晶, 2015)。目前,新疆野蘋果內生鏈霉菌的研究尚未見報道,有待開發(fā)其資源。筆者課題組從新疆野蘋果枝干中分離得到1株內生鏈霉菌菌株A-m1,初步發(fā)現其具有強烈的抑菌活性,活性超過之前分離的內生細菌(李永麗等, 2020) 和內生真菌(王亞紅等, 2020)。本試驗通過對菌株A-m1菌落培養(yǎng)性狀、形態(tài)特征和理化性質研究,以期明確其分類地位,優(yōu)化其發(fā)酵條件,并探究對蘋果等病害病原物的抑菌活性和抑菌廣譜性,為相關病害的生物防治以及該菌株的進一步應用提供參考。
供試病原菌: 葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)、膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)、蘋果擬莖點霉(Phomopsismali)、小麥紋枯病菌(Rhizoctoniacerealis)、小麥全蝕病菌(Gaeumannomycesgraminis)、番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、君子蘭莖基腐尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、南天竹炭疽菌(Colletotrichumkarstii) 均由河南科技大學林業(yè)生物技術實驗室分離保存。
培養(yǎng)基: NA培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基(方中達,1998)、PDB培養(yǎng)基、高氏一號培養(yǎng)基(中國科學院微生物研究所放線菌分類組,1975)、ISP2培養(yǎng)基、ISP3培養(yǎng)基、ISP4培養(yǎng)基、ISP5培養(yǎng)基、PSA培養(yǎng)基、明膠液化培養(yǎng)基、淀粉水解培養(yǎng)基、纖維素水解培養(yǎng)基、柴斯納瓊脂(Tresner) 培養(yǎng)基、酪氨酸培養(yǎng)基、碳源利用基礎培養(yǎng)基、氮源利用基礎培養(yǎng)基、Bennett培養(yǎng)基、牛奶凝固與胨化培養(yǎng)基(李其利, 2011)。6種基礎發(fā)酵培養(yǎng)基,代號分別為 A、B、C、D、E和F。A: 高氏一號液體培養(yǎng)基(戴蓬博等, 2016); B: 葡萄糖 10 g、蛋白胨 3 g、NaCl 2.5 g、CaCO32 g、蒸餾水1 000 mL、pH 7.2~7.4(閆建芳等, 2016); C: 乳糖10 g、牛肉膏10 g、NaCl 1 g、FeSO4·7H2O 0.002 g、MgSO4·7H2O 0.002 g、蒸餾水1 000 mL、pH7.2~7.4(何紅, 2015); D: 蔗糖 20 g、可溶性淀粉 30 g、蛋白胨 2 g、黃豆粉 8 g、NaCl 2 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、CaCO33 g、K2HPO4·7H2O 0.5 g、蒸餾水1 000 mL、pH7.2~7.4(王辰等, 2015); E: NA液體培養(yǎng)基; F: PDB培養(yǎng)基參照方中達(1998)配方。
1.2.1 鏈霉菌菌株A-m1的分離與鑒定 1) 菌株A-m1的分離與純化 將新疆野蘋果健康枝條韌皮部和木質部分別剪成5 mm × 5 mm 左右的組織塊,75%的酒精消毒30 s,1% 次氯酸鈉消毒3 min,無菌水漂洗3次后,組織塊用稀釋分離法分離內生菌(方中達,1998),涂布高氏一號培養(yǎng)基上,于28 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中,黑暗培養(yǎng)。取最后一次漂洗的無菌水做為對照涂布于培養(yǎng)基表面。觀察內生菌生長情況,適時挑取有放射狀菌絲的菌落劃線于PDA培養(yǎng)基上,純化3次后保存?zhèn)溆谩?/p>
2) 菌株A-m1培養(yǎng)特征觀察 將菌株A-m1分別接種在 ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、PDA、NA、LB、PSA、高氏一號培養(yǎng)基上(中國科學院微生物研究所放線菌分類組,1975; 周德慶,1986),28 ℃ 培養(yǎng) 10 天,觀察統(tǒng)計其培養(yǎng)特征。
3) 菌株A-m1形態(tài)特征觀察 在PDA培養(yǎng)基上劃線接種菌株A-m1,同時在接種位點將滅菌的蓋玻片(18 mm×18 mm)斜插入培養(yǎng)基內,在菌物培養(yǎng)箱中28 ℃ 培養(yǎng)4~7 天取出插片,在光學顯微鏡下觀察其氣生菌絲、孢子鏈和孢子的形態(tài)特征。
4) 菌株A-m1生理生化特征分析 參照文獻(中國科學院微生物研究所放線菌分類組,1975; 周德慶,1986)試驗方法測定一系列生理生化特性,包括碳源利用、纖維素水解、產H2S、產黑色素、淀粉水解、牛奶凝固與胨化、明膠液化、耐鹽性(1%、3%、5%、7%),生長溫度范圍(16、22、28、34、40 ℃)。
“教學”主要反映教師的教學水平、教學創(chuàng)新能力,以及教學成果的社會影響。有關評價要素包括:在各級教學成果評比、教學大賽中獲得的成績,教改課題,教學質量評價(大數據反映的教師所任教班級學科成績的變化、教師教學情況等);各級示范課、展示課等。其中,“教改課題”的認可度為中上等(事后訪談得知,有不少調查對象將該項列入了科研類),其他各評價要素的認可度都為高。
5) 菌株A-m1 16S rDNA序列測定 提取菌株A-m1基因組DNA,對16S rDNA序列進行擴增,引物為16SL(5′-ACGGCTACCTTGTTACGACCT-3′)和16SR(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′),擴增程序為95 ℃ 預變性3 min; 98 ℃ 變性10 s,52 ℃ 退火30 s,72 ℃ 延伸90 s,共35個循環(huán); 72 ℃ 延伸7 min。將擴增出的目的片段測序[生工生物工程(上海)股份有限公司],測序結果在GenBank 數據庫中進行Blast相似性比對,下載同源性高的相關菌株序列,使用 Clustal X2進行多序列比對,用MEGA 4.0軟件采用鄰接法(Neighbor-Joining) 構建系統(tǒng)發(fā)育樹。
1.2.2 菌株A-m1發(fā)酵條件優(yōu)化 1) 發(fā)酵最適基礎培養(yǎng)基篩選 將菌株A-m1接種于NA液體培養(yǎng)基,在28 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)至OD值1.0時做為種子液。然后取1 mL種子液分別接入裝有20 mL基礎發(fā)酵培養(yǎng)基三角瓶(50 mL)中,28 ℃、180 r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)4 天,發(fā)酵液10 000 r·min-1離心10 min; 上清液在超凈工作臺中使用無菌微孔濾膜過濾器(孔徑0.22 μm) 過濾,取5 mL過濾液加入到 75 mL的PDA培養(yǎng)基中,倒制3個平板,以葡萄座腔菌為指示菌做平板對峙試驗,菌絲生長速率法計算抑菌率。抑菌率(%)=[(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-菌餅直徑)]×100。
2) 發(fā)酵液高抑菌活性最佳碳源篩選 改變高氏一號液體培養(yǎng)基中碳源成分,其他物質不變。碳源含量分別為2% 的可溶性淀粉、葡萄糖、麥芽糖、木糖、果糖、阿拉伯糖和不加碳源。不同碳源培養(yǎng)基中分別加入5% 菌株A-m1種子液,發(fā)酵條件及后續(xù)抑菌率試驗方法同上。
3) 發(fā)酵液高抑菌活性最佳氮源篩選 改變高氏一號液體培養(yǎng)基中氮源成分,其他物質不變。氮源含量分別為l% 的硝酸鉀、氯化銨、酵母膏、蛋白胨、黃豆粉和不加氮源,進行單因素試驗。不同氮源培養(yǎng)基中分別加入5% 鏈霉菌A-m1種子液,發(fā)酵條件及后續(xù)抑菌率試驗方法同上。
4) 發(fā)酵條件優(yōu)化 采用單因素變量法,評價各發(fā)酵濾液對葡萄座腔菌的抑菌率,抑菌試驗同1.2.2中1),確定最佳發(fā)酵條件。最適接種量: 設置接種量參數為 2%、4%、6%、8%、10%、15%、20%,在 28 ℃、180 r·min-1發(fā)酵條件下培養(yǎng) 4天。最適培養(yǎng)時間: 在最適接種量基礎上,發(fā)酵時間設置為2、4、6、8、10 天,在28 ℃、180 r·min-1條件下震蕩培養(yǎng)。最適發(fā)酵溫度: 在最適接種量和最適發(fā)酵時間條件下,設置溫度 20、23、26、29、32 ℃ 培養(yǎng)。在最適接種量、發(fā)酵時間及溫度基礎上,設置初始培養(yǎng)基 pH值 3、4、5、6、7、8、9、10、11和12進行發(fā)酵培養(yǎng)。在最適接種量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度和 pH 值基礎上,于500 mL三角瓶中分別裝入 50、100、150、200、250 mL液體培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)。
1.2.3 發(fā)酵濾液抑菌譜的測定 在前述最佳碳源、氮源和發(fā)酵條件基礎上,獲得無菌發(fā)酵濾液,配制平板方法同,測定對葡萄座腔菌、膠孢炭疽菌、蘋果擬莖點霉、小麥紋枯病菌、小麥全蝕病菌、番茄灰霉病菌、小麥赤霉病菌、君子蘭莖基腐尖孢鐮刀菌和南天竹炭疽菌的菌絲生長抑制率。同時設置1 g·L-1的70% 甲基硫菌靈可濕性粉劑(濟南農化有限公司) 和80% 多菌靈可濕性粉劑(一帆生物科技有限公司) 試驗組,與A-m1發(fā)酵濾液抑菌效果對比。
采用SPSS 19.0軟件對試驗數據進行Oneway ANOVA方差分析,顯著性水平0.05。
2.1.1 菌株A-m1培養(yǎng)特征 培養(yǎng)特征統(tǒng)計見表1,典型特征見圖1。菌株A-m1在不同培養(yǎng)基上氣生菌絲初期均為白色,后期生長出孢子堆,菌落顏色多呈現棕色和紫色,基內菌絲多表現出黃色,在多種培養(yǎng)基中可產黃色可溶性色素。
表1 菌株A-m1在不同培養(yǎng)基上的形態(tài)特征Tab.1 Morphological characteristics of strain A-m1 on different media
圖1 菌株A-m1在不同培養(yǎng)基培養(yǎng)10天的形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of strain A-m1 on different media for 10 daysa.ISP2培養(yǎng)基; b.ISP3培養(yǎng)基; c.ISP4培養(yǎng)基; d.ISP5培養(yǎng)基; e.LB培養(yǎng)基; f.NA培養(yǎng)基; g.PDA培養(yǎng)基; h.PSA培養(yǎng)基; i.高氏一號培養(yǎng)基。a.ISP2 medium; b.ISP3 medium; c.ISP4 medium; d.ISP5 medium; e.LB medium; f.NA medium; g.PDA medium; h.PSA medium; i.Gause I medium.
2.1.2 菌株A-m1形態(tài)特征 菌株 A-m1 在 PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng) 6 天后,單菌落圓形,直徑1~1.5 cm,氣生菌絲生長旺盛,產生密集孢子堆,菌落棕色,產黃色可溶性色素。菌絲分枝較多,無橫隔膜,孢子鏈形成初期 2~6 圈螺旋,后期孢子鏈伸展,孢子長圓形,表面光滑,見圖 2。
圖2 鏈霉菌菌株A-m1菌落、氣生菌絲及孢子鏈形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of colony, aerial mycelium and spore chains of Streptomyces A-m1a. 菌落; b. 氣生菌絲; c、d. 孢子鏈。a. Colony; b. Aerial mycelium; c、d. Spore chain.
2.1.3 菌株A-m1生理生化特征統(tǒng)計 菌株 A-m1 生理生化相關檢測指標統(tǒng)計見表 3。生理生化特征是鏈霉菌近分類鑒別的主要依據,A-m1 與其親緣特別相近的 3 個種模式菌株進行了比較,包含婁徹氏鏈霉菌S.rocheiD164(中國科學院微生物研究所放線菌分類組,1975; 信艷娟等, 2012)、哥斯達黎加鏈霉菌(S.costaricanus)(Esnardetal., 1995; Guetal., 2012)、鼠灰鏈霉菌(S.murinus)(Shamsetal., 2010; Cuietal., 2012)。菌株 A-m1 能利用木糖、棉籽糖、L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、果糖、葡萄糖、甘露醇、水楊苷作為碳源; 其中對棉籽糖、甘露醇和水楊苷利用能力較弱,不能利用肌醇和蔗糖。菌株能使牛奶凝固與胨化,30 天后不能使明膠液化,能使纖維素分解和淀粉水解,不產生硫化氫和黑色素。耐鹽性結果顯示,鏈霉菌 A-m1 在 NaCl 含量 1%~7% 的培養(yǎng)基中都能生長,7% 條件下生長情況變差。從菌株生長溫度測定結果顯示,16~40 ℃ 菌株均能生長,22~28 ℃ 條件下生長情況良好,34 ℃ 以上溫度菌株生長情況變差。生理生化指標測定表明菌株A-m1屬于婁徹氏鏈霉菌。
表3 菌株A-m1與近緣種之間生理生化特征對比①Tab.3 Comparison of physiological and biochemical characteristics between strain A-m1 and relative species
2.1.4 16S rDNA基因序列進化分析 菌株 A-m1 的 16S rDNA 擴增產物經測序獲得 1 390 bp 的序列,同源進化分析構建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3,菌株A-m1(16S rDNA收錄號: MK990649.1) 與婁徹氏鏈霉菌(S.rochei)(16S rDNA收錄號: AP018517.1)、鼠灰鏈霉菌(S.murinus)(16S rDNA收錄號: NR 112445) 和哥斯達黎加鏈霉菌(S.costaricanus)(16S rDNA收錄號: NR 041414) 聚在同一分支上,相似性 100%。結合對菌株A-m1的形態(tài)觀察和生理生化指標的測定,菌株 A-m1鑒定屬于婁徹氏鏈霉菌(S.rochei),命名為StreptomycesrocheiA-m1。
圖3 基于16S rDNA基因序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 16S rDNA sequence of strain A-m1 in the phylogenetic tree
2.2.1 最適基礎培養(yǎng)基的確定 統(tǒng)計不同培養(yǎng)基發(fā)酵濾液對葡萄座腔菌的抑菌作用,如圖4。A、B、C、D、E、F培養(yǎng)基發(fā)酵濾液的抑菌率分別為95.05%±1.80%、88.28%±4.75%、3.39%±2.51%、98.18%±0.90%、5.06%±2.74%、2.28%±1.16%。A、B、D 3種培養(yǎng)基獲得的發(fā)酵濾液抑菌率較高,其中A和D培養(yǎng)基的抑菌率最高,處于同一水平,顯著高于另外4種供試培養(yǎng)基。C、E和F 3種培養(yǎng)基發(fā)酵液抑菌活性非常低,它們的發(fā)酵液基本沒有色素,并且氣味小,發(fā)酵液離心發(fā)現其中菌體含量卻較多,說明這3種培養(yǎng)基非常有利于菌株A-m1的增殖,但次生產物代謝合成不旺盛。由于A培養(yǎng)基成本更低,且配制操作更簡易,因此確定高氏一號培養(yǎng)基為菌株A-m1高抑菌活性最適發(fā)酵基本培養(yǎng)基。
圖4 菌株 A-m1不同培養(yǎng)基發(fā)酵濾液對葡萄座腔菌抑菌活性Fig.4 Antibacterial activity of strain A-m1 from different media fermentation broth against B. dothidea
2.2.2 最適碳源和氮源的確定 不同碳源培養(yǎng)基菌株A-m1發(fā)酵濾液所表現的抑菌活性,如圖5A。抑菌率大小排序: 可溶性淀粉 > 阿拉伯糖 > 麥芽糖 > 葡萄糖 > 果糖 > 不加碳源 > 木糖??扇苄缘矸圩鳛槲ㄒ惶荚磿r,菌株A-m1對葡萄座腔菌抑菌率為93.69%±1.52%,抑菌活性顯著高于其他碳源。因此,可溶性淀粉做為菌株A-m1發(fā)酵最適碳源。
不同氮源培養(yǎng)基菌株A-m1發(fā)酵濾液所表現的抑菌活性,如圖5B。抑菌率大小排序: 硝酸鉀 > 酵母膏 > 黃豆粉 > 蛋白胨 > 不加氮源 > 氯化銨。硝酸鉀和酵母膏作為氮源時,發(fā)酵濾液的抑菌活性處于同一水平,抑菌率分別為93.69%±1.52%和93.45%±2.63%,顯著高于與其他氮源成分發(fā)酵率液的抑菌活性。由于硝酸鉀成本更低,確定硝酸鉀做為菌株A-m1發(fā)酵最適氮源。
圖5 不同碳源、氮源條件下菌株A-m1發(fā)酵濾液抑菌活性Fig.5 The inhibition effect of different carbon and nitrogen sources on fermentation broth of strain A-m1
2.2.3 菌株A-m1發(fā)酵條件的優(yōu)化 接種量在2%~20% 范圍內增加,發(fā)酵濾液對葡萄座腔菌的抑菌率的趨勢(圖6A)呈先增加、趨于平穩(wěn)、后下降。抑菌率分別為45.77%±2.55%、92.59%±2.42%、91.27%±2.10%、93.39%±1.21%、92.86%±0.79%、85.71%±3.64%、85.71%±2.75%。 4%、6%、8%、10% 的接種量抑菌率差異不顯著,抑菌率處于最高水平; 從使用種子液量少考慮,4% 為最佳接種量。
4%接種種子液,培養(yǎng)2~20 天發(fā)酵濾液產生的抑菌作用先增加后降低(圖6B),抑菌率分別為69.83%±2.56%、92.96%±1.86%、95.66%±1.05%、91.48%±1.84%、90.00%±1.84%、85.44%±1.46%、87.62%±0.73%。4天和6天的抑菌活性最強,兩者之間處于同一水平,但顯著高于其他培養(yǎng)時間; 從節(jié)省培養(yǎng)時間考慮,4 天為最佳發(fā)酵培養(yǎng)時間。
4%接種量分別在 20~32 ℃ 條件發(fā)酵培養(yǎng) 4 天,統(tǒng)計發(fā)酵濾液抑菌率(圖6C)。各溫度條件下發(fā)酵濾液抑菌活性都很強,其中 23、26、29、32 ℃ 培養(yǎng)溫度對應抑菌率最高,處于同一水平; 從節(jié)約能源考慮,可以從 23~32 ℃ 溫度區(qū)間選擇接近環(huán)境的溫度進行培養(yǎng)。
培養(yǎng)基初始pH3~12范圍,按 4% 接種量、23 ℃、培養(yǎng)4 天發(fā)酵濾液的抑菌率先增加后降低(圖6D)。pH6、pH7、pH8時處于同一顯著水平,抑菌率最高; A-m1發(fā)酵起始最適pH6~8之間均可。
培養(yǎng)基 pH7, 4% 接種量,23 ℃ 培養(yǎng)4 天,容量為500 mL 的三角瓶裝液50~250 mL對應抑菌率先增加后減小(圖6E)。50 mL和100 mL裝液量得到的抑菌率最高,兩者處同一水平; 從單位容器產量高考慮,100 mL/500 mL作為最佳裝液量。
菌株A-m1較合適的發(fā)酵條件綜上應設置為 4% 接種量,裝液量100 mL/500 mL、pH值6~8之間、發(fā)酵溫度 23~32 ℃ 和發(fā)酵培養(yǎng)4天。
PDA培養(yǎng)基中加入5 mL最適培養(yǎng)條件下獲得的菌株A-m1發(fā)酵濾液,對3種蘋果枝干病原菌和6種其他植物病原菌均表現出抑菌作用(圖7),說明菌株A-m1具抑菌廣譜性。發(fā)酵濾液對葡萄座腔菌的抑菌率為95.21%±0.00%,對膠孢炭疽菌的抑菌率為83.08%±1.38%,對蘋果擬莖點霉的抑菌率為91.04%±1.55%,對番茄灰霉病菌的抑菌率為77.60%±3.67%,對南天竹炭疽菌的抑菌率為66.88%±1.10%,對君子蘭莖基腐尖孢鐮刀菌的抑菌率為64.03%±0.82%,對小麥赤霉病菌的抑菌率為82.03%±2.28%,對小麥紋枯病菌的抑菌率為80.89%±0.96%,對小麥全蝕病菌的抑菌率為31.27%±2.13%。對葡萄座腔菌、蘋果擬莖點霉的抑菌作用強,抑菌率在90% 以上; 對小麥赤霉病菌、小麥紋枯病菌的抑菌率超過80%,表現出較強的抑菌效果。與甲基硫菌靈和多菌靈抑菌作用相比(表2),5 mL的菌株A-m1發(fā)酵濾液對番茄灰霉病菌的抑制作用高于1 g·L-1濃度70% 甲基硫菌靈,對番茄灰霉病菌、小麥紋枯病菌的防抑制作用高于1 g·L-1濃度80% 多菌靈。
圖6 不同發(fā)酵條件菌株 A-m1發(fā)酵濾液抑菌活性Fig.6 Antibacterial activity of strain A-m1 under different fermentation conditions
圖7 菌株 A-m1 發(fā)酵濾液對 9 種植物病原菌平板對峙Fig.7 The antagonism of the strain A-m1 fermentation broth to 9 plant diseasesA.葡萄座腔菌B. dothidea; B.膠孢炭疽菌C. gloeosporioides; C.蘋果擬莖點霉P. mali; D.番茄灰霉病菌 B. cinerea; E.南天竹炭疽病菌C. karstii; F.君子蘭莖基腐病菌F. oxysporum; G.小麥赤霉病菌F. graminearum; H.小麥紋枯病菌R. cerealis; I.小麥全蝕病菌 G. graminis. 每幅圖左培養(yǎng)皿為空白平板對照,有培養(yǎng)皿為添加有發(fā)酵濾液平板。 Each petri dish on the left is a blank plate control, and the right petri dish is a plate with a fermentation filtrate added.
表2 菌株A-m1發(fā)酵濾液和2種農藥對9種植物病原菌抑制作用Tab.2 Inhibition effect of strain A-m1 fermentation broth and two pesticides on 9 plant diseases
關于婁徹氏鏈霉菌在植物病害生防上已有一些研究,如:菌株Lj20是從山西臨汾辣椒根部分離的內生菌 (馬林等,2008),其抗真菌代謝產物是2,6-二叔丁基對甲酚和3,5-二叔丁基-4-羥基-苯甲醚;婁徹氏鏈霉菌ACTA1551(Kaninietal., 2013)是分離自希臘的一株內生菌,可防治尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)引起的番茄枯萎病,同時還能促進植株的生長;菌株TRM42561從新疆鹽環(huán)境中分離得到 (柳成賓等,2014),室內對棉花黃萎病菌(Verticilliumdahliae)菌絲生長抑制率為 83.75%,孢子萌發(fā)抑制率為 68.75%,田間防治效果達到 41.65%;婁徹氏鏈霉菌菌株ZZ-9出甘肅隴東蘋果根際土壤中分離得到 (薛應鈺等,2016),對蘋果樹腐爛病菌Cytosporasp.生長抑制率可達96%。 但以上研究中并未提及發(fā)酵液產生色素的現象,本研究中分離得到的婁徹氏鏈霉菌 A-m1在抑菌作用高的時候,發(fā)酵液呈現出黃色。A-m1發(fā)酵液高抑菌活性與其色素產生同步的現象是本研究初次報道,該現象可能是菌株A-m1特有性狀。菌株A-m1在多種固體培養(yǎng)基中也有色素產生,但不能使明膠液化,這與菌株Lj20(馬林等, 2008)特征存在區(qū)別。這也說明不同地理條件下的婁徹氏鏈霉菌由于其生態(tài)適應性存在一定差別,其他未知的生物功能差別有待進一步研究。
葡萄座腔菌寄主范圍廣泛,除蘋果外,還可危害楊樹(Populus)等十多種樹木(楊蕾等, 2015)。由葡萄座腔菌引起的蘋果輪紋病,不僅造成枝干枯死,嚴重削弱樹勢,甚至可導致爛果,造成較大的經濟損失,在我國各蘋果產區(qū)都有發(fā)生,且近年來病情逐漸加重; 同時擬莖點霉菌和膠孢炭疽菌也危害蘋果等果樹的枝條和主干,造成枯枝和枯干,嚴重時甚至整株死亡(胡玉清等, 2016)。目前化學防治是蘋果枝干病害最主要的方法,化學農藥的長期使用,易造成環(huán)境污染,農藥殘留超標,威脅人類健康,甚至導致病原菌產生抗藥性(李曉軍等, 2009; 楊煒華等, 2002)。本試驗中菌株A-m1發(fā)酵濾液5 mL對葡萄座腔菌抑菌率超過95%,超過1 g·L-1的多菌靈產生的作用效果,A-m1發(fā)酵濾液對膠孢炭疽菌的抑菌率為83.08%±1.38%,對蘋果擬莖點霉的抑菌率為91.04%±1.55%,對3種蘋果枝干病原均表現出良好的抑菌活性。薛應鈺等(2016) 報道了婁徹氏鏈霉菌菌株ZZ-9對殼囊孢Cytosporasp.的抑制作用,但引起蘋果樹腐爛病菌的病原種類有多種,ZZ-9對本研究中選擇的3種蘋果枝干病害病原的活性尚不明確。筆者還采用了接種試驗評價菌株A-m1的致病性,結果表明其對蘋果枝干不具有致病性(李永麗等, 2020),該菌株來源于新疆野蘋果內生菌,理論上也能生存于蘋果樹體內,將A-m1用于蘋果樹病害生防是否長期發(fā)揮防效有待進一步驗證。
在對3種蘋果枝干病原表現出抑菌活性之外,本研究還選擇了園林植物、蔬菜、和糧食作物上的幾種病原開展了抑菌試驗。番茄灰霉病是蔬菜重要病害,多年來一直依賴化學藥劑防治,對多種農藥都產生了抗藥性(紀明山等, 2003)。對番茄灰霉病菌的生長抑制試驗中,A-m1發(fā)酵濾液抑菌作用高于甲基硫菌靈和多菌靈。A-m1發(fā)酵濾液對參試的園林植物、蔬菜、和糧食作物的部分病原均表現出抑菌作用,菌株 A-m1抑菌具有廣譜性,抑菌活性明顯,具有對多種植物病害進行生物防治的應用潛力。
鏈霉菌防治植物病害的作用機制主要有3種: 抗生作用、競爭作用和寄生作用,其中最主要的是抗生作用。在本研究中用到了A-m1發(fā)酵濾液,對多種病原表現出抑菌活性,說明A-m1產生了抗生物質; 但其抗生物質是否是一種或多種物質,其含量也不清楚,有必要對抑菌物質開展萃取和分離進一步研究,有可能為開發(fā)新型抑菌化合物提供參考。Abbasi等(2019) 用婁徹氏鏈霉菌Y28菌株處理番茄后能誘導植物中過氧化氫酶和過氧化物酶活性的增加,從而誘導出對鐮刀菌(Fusariumoxysporumf. sp.lycopersici)3菌株特異性的系統(tǒng)抗性。本研究使用的A-m1菌株是否能引起相關植物的系統(tǒng)抗病性,還有待進一步試驗研究。
本研究從新疆野蘋果枝干中分離得到1株內生具生防作用的婁徹氏鏈霉菌S.rocheiA-m1,中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號為CCTCC M 2019266。高抑菌發(fā)酵條件最適基礎培養(yǎng)基為高氏一號,最佳碳源為可溶性淀粉,最佳氮源為硝酸鉀; 發(fā)酵起始種子液接種量4%,在23~32 ℃、pH6~8之間、裝液量100/500 mL和發(fā)酵培養(yǎng) 4 天為較優(yōu)的發(fā)酵條件。發(fā)酵濾液對供試的3種蘋果枝干病害和6種其他植物病原菌均表現出很強的抑菌活性,具抑菌廣譜性。S.rocheiA-m1 抑菌譜較廣、抑菌活性高,具有防治部分作物真菌性病害的應用潛力。