大黃靈仙膠囊調(diào)控小鼠膽囊結(jié)石形成機(jī)制中BSEP、NTCP基因表達(dá)的研究

周洋，卓臣義，唐乾利，馮時(shí)，岑小寧，包崇嬋，黃麗芳，許彥

(1.右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，廣西 百色 533000；2.右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院，廣西 南寧 530001)

膽囊結(jié)石是膽道系統(tǒng)最常見疾病，主要為膽固醇結(jié)石。從過飽和的膽汁中沉淀出來的膽固醇結(jié)晶反應(yīng)了肝臟中膽固醇分泌的高水平[1]，肝細(xì)胞分泌功能是通過肝細(xì)胞膽小管側(cè)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來實(shí)現(xiàn)的，在眾多的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中，膽鹽輸出泵(bile salt export pump，BSEP)是介導(dǎo)膽鹽攝取和排泄最重要的膽鹽轉(zhuǎn)運(yùn)器[2]；鈉離子-牛磺膽酸共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(sodium taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP)是位于頂漿膜上介導(dǎo)膽鹽的重要因子，也是細(xì)胞攝取膽汁酸的主要載體系統(tǒng)[3]。BSEP與NTCP的協(xié)同作用在膽汁分泌和肝臟功能的正常運(yùn)作中至關(guān)重要，是驅(qū)動膽汁酸鹽肝腸循壞的重要動力。課題組前期證實(shí)大黃靈仙膠囊可以調(diào)控部分肝膽管側(cè)膜細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[4-5]，據(jù)此，本研究探討大黃靈仙膠囊對BSEP、NTCP蛋白和mRNA表達(dá)量調(diào)控及防治膽囊結(jié)石的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動物 5周齡SPF級C57BL/6小鼠，雄性，體重(18±2)g(購于湖南長沙天勤有限公司，許可證號SCXK(湘)2014-0011)，飼養(yǎng)于右江民族醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)濕度：55%～75%，室內(nèi)溫度：20～25℃，12 h黑白環(huán)境循環(huán)更替，實(shí)驗(yàn)一切操作嚴(yán)格遵守美國國立衛(wèi)生研究院公布的《實(shí)驗(yàn)動物護(hù)理使用指南》(NIH Pub.No.85-23，1996修訂)。本研究動物實(shí)驗(yàn)通過右江民族醫(yī)學(xué)院動物倫理委員會核查并審批。

1.2藥物 大黃靈仙膠囊由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥中學(xué)提供(桂藥監(jiān)注[2003]88號)，麻醉藥品由中國泰興市豪申化工貿(mào)易有限公司提供(CAS：302-17-0)，熊去氧膽酸購于四川科瑞德制藥有限公司(國藥準(zhǔn)字H20123205)，致石性飼料購于江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司(GB14924.3-2010)。

1.3主要試劑 Anti-BSEP抗體購于Thermo Fisher公司，Anti-NTCP抗體購于Thermo Fisher公司，β-actin抗體購于北京索萊寶生物科技技術(shù)有限公司，山羊抗兔的二抗購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，SDS購于上海碧云天生物科技技術(shù)有限公司。

1.4分組及造模 小鼠先于SPF級動物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)1周以適應(yīng)飼養(yǎng)環(huán)境并確定小鼠健康狀況，將60只小鼠隨機(jī)均分為5組：普食組(P組)、致石組(Z組)、致石+灌水組(Z+S組)、致石+大黃靈仙膠囊組(Z+D組)、致石+熊去氧膽酸組(Z+X組)。普食組予以普通飼料喂養(yǎng)，余4組均予以致石飼料喂養(yǎng)[高脂、高熱量、高膽固醇(15%脂肪、1.5%膽固醇、0.5%膽酸)]誘導(dǎo)方法造模8周，建立小鼠膽囊結(jié)石模型，此造模方法已被多次驗(yàn)證成功[6-8]。Z+D組給予大黃靈仙膠囊湯藥灌胃，Z+X組給予熊去氧膽酸膠囊溶液灌胃，Z+S組則給予相同體積的生理鹽水灌胃，藥物劑量根據(jù)小鼠與成人體重等效劑量換算。取膽囊組織觀察結(jié)石形成情況，小鼠膽囊內(nèi)有顆粒狀或泥沙狀沉積物可判斷為結(jié)石形成；取小鼠肝臟組織0.3 cm×0.3 cm×0.2 cm裝入EP管中暫時(shí)存放于液氮罐中，標(biāo)本采取完成后統(tǒng)一保存至-80℃冰箱可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.5Western-Blotting檢測小鼠肝臟組織BSEP、NTCP蛋白表達(dá) 提取小鼠肝臟組織蛋白并測定蛋白濃度，配平→蛋白質(zhì)變性→制備SDS-PAG凝膠→上樣、電泳→轉(zhuǎn)膜→封閉、洗膜→一抗、二抗孵育→曝光→灰度值分析。蛋白條帶見圖1。

注：1為Z組；2為P組；3為Z+S組；4為Z+D組；5為Z+X組。

1.6RT-PCR檢測小鼠肝臟組織BSEP、NTCP基因轉(zhuǎn)錄水平 引物的設(shè)計(jì)與合成→組織標(biāo)本RNA的提取→RNA濃度的測定→將符合標(biāo)準(zhǔn)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)→將提取好的DNA進(jìn)行上機(jī)→進(jìn)行Real Time PCR反應(yīng)。采用兩步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序→計(jì)算出各樣品的目的基因相對定量結(jié)果，即其他各個樣品相對于對照樣品(以P為對照樣本)，目的基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的差異。

1.7瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果 濃度測定后應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳測定所提取RNA完整度，結(jié)果見圖2。紫外燈下可見各組樣本28s、18s rRNA兩條條帶，條帶清晰、明亮、邊緣完整，且28s條帶寬度約為18s條帶的兩倍。所以認(rèn)定所提取的RNA完整性好，無污染，無降解。

圖2 各組瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2 結(jié)果

2.1結(jié)石形成情況 小鼠膽囊內(nèi)有顆粒狀或泥沙狀沉積物可判斷為結(jié)石形成，本次實(shí)驗(yàn)顯示多為泥沙狀沉積物，個別為顆粒狀(見表1、圖3)。不僅如此，所有致石飼料喂養(yǎng)的小鼠膽囊直徑大于對照組(圖3：Z為造模組，P為普通喂養(yǎng)組)。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)：P組與Z組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=20.308，P<0.001)，造模成功；Z+S組與Z+D組比較，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.224，P<0.05)，Z+X組與Z+D組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.000，P>0.05)，說明大黃靈仙膠囊、熊去氧膽酸具有防治膽囊結(jié)石形成作用，且兩種藥作用結(jié)果相當(dāng)。

表1 5組造模結(jié)果

注：顆粒狀結(jié)石(箭頭指向)；Z為造模組，P為普通喂養(yǎng)組。

2.2小鼠肝臟組織中BSEP、NTCP的蛋白表達(dá)水平 造模8周后，對比Z+X組、Z+D組、Z+S組肝臟組織中BSEP、NTCP的蛋白表達(dá)量發(fā)現(xiàn)：Z+D組>Z+S組、Z+X組>Z+S組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但Z+D組與Z+X組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2、圖4、圖5。(注：此次實(shí)驗(yàn)分為5組，P組和Z組比較用于驗(yàn)證造模，Z+S組、Z+D組和Z+X三組比較用于驗(yàn)證BSEP、NTCP蛋白、mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，故下列只列出Z+S組、Z+D組、Z+X組信息。)

表2 小鼠肝臟組織 BSEP、NTCP 的蛋白表達(dá)水平對比

注：“*”表示與Z+S組比較BSEP蛋白表達(dá)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

注：“*”表示與Z+S組比較NTCP蛋白表達(dá)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.3小鼠肝臟組織中BSEP、NTCP的mRNA表達(dá)水平 造模8周后，對比Z+X組、Z+D組、Z+S組肝臟組織中BSEP、NTCP mRNA轉(zhuǎn)錄水平發(fā)現(xiàn)：Z+D組>Z+S組、Z+X組>Z+S組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但Z+D組與Z+X組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3、圖6、圖7。

表3 小鼠肝臟組織BSEP、NTCP的mRNA表達(dá)水平對比

注：“*”表示與Z+S組比較BSEP mRNA轉(zhuǎn)錄水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

注：“*”表示與Z+S組比較NTCP mRNA轉(zhuǎn)錄水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 討論

大黃靈仙膠囊具有較好的預(yù)防結(jié)石形成的作用，本研究證實(shí)其調(diào)控小鼠肝膽管側(cè)膜細(xì)胞上BSEP、NTCP的蛋白及mRNA表達(dá)水平干預(yù)膽囊結(jié)石形成，另一可能機(jī)制為抑制膽囊黏膜炎癥及上調(diào)肝組織中CYP7A[9-10]，李泉等[9]在臨床實(shí)驗(yàn)中，通過B超隨訪提示患者膽囊收縮功能較術(shù)前明顯改善，綜合實(shí)驗(yàn)研究與臨床觀察結(jié)果表明，在保膽取石術(shù)后病人中，大黃靈仙膠囊有提高膽石癥手術(shù)療效、降低膽石癥術(shù)后殘石率及復(fù)發(fā)率的作用。熊去氧膽酸是一種親水性膽汁酸[11]，可以抑制膽固醇在腸道內(nèi)的重吸收，并且降低其向膽汁中分泌，抑制膽汁中膽固醇過飽和，膽固醇結(jié)石逐漸溶解，最終防止膽囊結(jié)石生成。大黃靈仙膠囊具有疏肝利膽功效，協(xié)調(diào)膽道系統(tǒng)功能，且有保護(hù)肝臟組織和促進(jìn)肝功能，即使采用致石性飼料灌胃，由于分泌較多膽汁沖刷膽道，不利于膽固醇成核異常；大黃靈仙膠囊可能保護(hù)膽囊功能，不致膽汁淤積，綜上，熊去氧膽酸、大黃靈仙膠囊都有抑制結(jié)石形成作用。所以Z+D組、Z+X組結(jié)石生成率相當(dāng)，均低于Z+S組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

NTCP作為一種跨膜糖蛋白，介導(dǎo)門脈結(jié)合膽汁酸進(jìn)入肝細(xì)胞，維持膽汁酸肝內(nèi)循環(huán)和肝內(nèi)膽汁酸正常濃度發(fā)揮重要作用，在轉(zhuǎn)錄水平NTCP主要受FXR核膽酸受體調(diào)控[12]。BSEP是肝內(nèi)膽汁酸清除的關(guān)鍵因素，膽汁淤積性藥物性肝損傷(DILI)患者大多BSEP表達(dá)顯著下調(diào)[13]。Z+D組BSEP、NTCP蛋白表達(dá)及mRNA轉(zhuǎn)錄都有提高，穩(wěn)定了膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)，抑制膽汁淤積，穩(wěn)定了膽汁酸池濃度平衡及肝臟分泌膽汁水平。大黃靈仙膠囊防治膽囊結(jié)石形成在于影響肝膽管轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)，此實(shí)驗(yàn)只對BSEP、NTCP兩個因子蛋白、基因表達(dá)水平做研究，如果可以從調(diào)控BSEP、NTCP兩因子的信號通路著手，對基因進(jìn)行檢測，將更具特異性及說明意義。