熊果酸對甲狀腺癌TPC-1細胞增殖的抑制作用

侯東升，張 靜，馮 麗，張晶晶，王 穎

0 引 言

熊果酸又稱烏索酸，是一種五環(huán)三萜類化合物，以游離或結(jié)合成苷的形式廣泛存在于多種藥用植物中[1]，在鎮(zhèn)靜、抗炎、殺菌、降糖、抗?jié)兊确矫婢幸欢ㄗ饔肹2]。有研究發(fā)現(xiàn)熊果酸在抑制 HL-60細胞增殖、誘導其凋亡方面效果顯著，能增強小鼠的巨噬細胞吞噬能力[3]。其抗腫瘤作用也逐漸引起人們的重視。目前在抗乳腺癌、肝癌、胃癌等方面的研究得到廣泛開展并取得了一定的研究進展，已成為防治腫瘤的研究熱點。 本研究旨在探究熊果酸對甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞增殖、凋亡途徑方面的影響， 以期為甲狀腺癌的防治尋找一種新的可行性方案。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及細胞株熊果酸(索萊寶公司)；DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清(澳洲AusGeneX公司)；二甲基亞砜(美國Sigma公司)；0.25%胰蛋白酶消化液(美國Gibco公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS，美國Gibco公司)；CCK8試劑盒(日本同仁公司)；細胞凋亡檢測試劑盒(武漢聯(lián)科生物公司)；JC-1試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)；活性氧檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)；總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)；PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)；PCR擴增試劑盒(寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)；甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞(武漢普諾賽生命科技有限公司)。

1.2 CCK-8試劑檢測細胞增殖抑制率待細胞生長至對數(shù)期，胰蛋白酶室溫消化3～5 min，加入適量培養(yǎng)液終止消化后離心收集細胞。將收集到的細胞用培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細胞濃度為4000～6000個/mL，以每孔100 μL接種至96孔板，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。細胞貼壁后棄原培養(yǎng)基，分別加入不含胎牛血清的不同濃度的熊果酸培養(yǎng)基(濃度分別為0、2、4、8、16、32 μmol/L，其中以0 μmol/L為對照)，再以不含細胞的培養(yǎng)基為空白組，每組設(shè)6個復孔，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。分別于24 h、48 h后終止培養(yǎng)，每孔加CCK-8溶液10 μL，繼續(xù)孵育2～4 h。用酶標儀檢測 450 nm 下的各孔吸光度(A)值，再根據(jù)所得到的吸光度值，細胞抑制率計算公式如下：

增殖抑制率=(對照組A-實驗組A)/(對照組A-空白組A)×100%

以上實驗重復3次，計算藥物半抑制濃度(IC50)。

1.3 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡將生長至對數(shù)期的細胞按6×104個/mL的濃度種植于無菌6孔板中培養(yǎng)，當細胞融合至70%～80%時，更換無胎牛血清的不同濃度的熊果酸培養(yǎng)基(濃度分別為0、4、8 μmol/L)處理24 h。用不含EDTA 胰蛋白酶消化細胞，離心收集細胞。按試劑盒使用說明書用Annexin V 及PI 標記細胞。采用流式細胞儀對樣品進行檢測，TPC-1細胞凋亡率計算如下：

TPC-1細胞凋亡率=[細胞總凋亡率(%)=B2象限細胞比例(%)+ B4象限細胞比例(%)

1.4 JC-1試劑盒測線粒體膜電位將生長至對數(shù)期的細胞按6×104個/mL的濃度種植于無菌6孔板中培養(yǎng)， 當細胞融合至70%～80%時，更換無胎牛血清的不同濃度的熊果酸培養(yǎng)基(濃度分別為0、4、8 μmol/L)處理24 h。按試劑盒使用說明書用JC-1染色緩沖液(1×)處理細胞。 采用熒光顯微鏡觀察細胞。

1.5 活性氧檢測試劑盒測細胞內(nèi)活性氧水平細胞內(nèi)活性氧的相對含量以 DCF的熒光強度表示。將生長至對數(shù)期的細胞按6×104個/mL的濃度種植于無菌6孔板中培養(yǎng)，當細胞融合至70%～80%時，更換無胎牛血清的不同濃度的熊果酸培養(yǎng)基(濃度分別為0、4、8 μmol/L)處理24 h。將DCFH-DA試劑用無血清培養(yǎng)液稀釋1000倍至10 μmol/L，按試劑盒使用說明書用稀釋好的DCFH-DA試劑處理細胞。采用熒光顯微鏡觀察細胞并拍照。

1.6 流式細胞術(shù)測蛋白表達將對數(shù)期細胞胰酶消化后制備成單細胞懸液，加培養(yǎng)液將細胞濃度調(diào)整為6×104個/mL，接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，當細胞融合至孔底70%～80%時，棄去舊培養(yǎng)基，分別加入不含胎牛血清的不同濃度的熊果酸培養(yǎng)基(濃度分別為0、4、8 μmol/L)處理24 h。胰蛋白酶消化收集細胞，離心機(京立LDZ5-2型離心機)1000 r/min，離心5 min，離心半徑15 cm。用75%冰乙醇將細胞固定20 min后離心，PBS洗兩遍。3% BSA封閉細胞1 h，每半小時混勻一次。將處理好的細胞離心，PBS洗一遍，計數(shù)細胞。按抗體使用說明書加入比率一抗，做好陰性對照，室溫孵育1 h，每半小時混勻一次。再次離心細胞去除上清液，PBS洗滌兩遍。在光線較暗的房間用PBS按1∶1500比例稀釋熒光素標記的二抗，每孔加150 μL，在暗室孵育1 h，每半小時混勻一次。離心細胞去上清，PBS洗一遍，加入150 μL的PBS混勻上機。 檢測各組細胞的熒光強度。

1.7RT-PCR法測mRNA的表達情況用熊果酸對TPC-1細胞干預24h后，按提取試劑盒說明提取各組細胞RNA；按反轉(zhuǎn)錄盒使用說明書對提取的各組RNA進行處理，反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，引物分別為：存活素上游：5′- GGACCACCGCATCTCTACATTC-3′,下游5′-CCGCAGTTTCCTCAAATTCTTTC-3′,VEGF上游5′- GAGGCTCCAGGGCATT AGAC-3′,下游5′-TCACCAAGGCCAGCA CATAG-3′，GAPDH上游5′-GGAAGCTTG TCATCAATGGAAATC-3′，下游5′-TGATG ACCCTTTTGGCTCCC-3′；利用7500熒光定量PCR儀檢測各組細胞的存活素、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF) mRNA表達水平。

進行單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。不同時間點均值比較采用重復測量分析。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 熊果酸對細胞增殖的影響2、4、8、16、32 μmol/L熊果酸對TPC-1細胞抑制率較0 μmol/L 明顯升高(P<0.01)；48 h時熊果酸對TPC-1細胞抑制率較24 h明顯升高(P<0.05)。TPC-1細胞抑制率與熊果酸濃度及時間呈正相關(guān)(P<0.05)。見表1。24 h及48 h熊果酸的IC50分別為(13.46±0.45)μmol/L、(10.69±0.41)μmol/L。

表 1 不同時間點不同濃度熊果酸對TPC-1細胞的抑制作用

2.2 熊果酸誘導細胞凋亡情況0 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L熊果酸的細胞凋亡率分別為(4.13±0.61)%、(6.53±0.65)%、(13.13±1.59)%，且隨熊果酸藥物濃度的增加，TPC-1細胞凋亡率逐漸增加(P<0.05)。熊果酸可有效誘導TPC-1細胞凋亡，見圖1。

a:0 μmol/L;b:4 μmol/L;c:8 μmol/L

2.3熊果酸對細胞線粒體膜電位的影響熊果酸 0 μmol/L時顯示細胞有較強紅色熒光，未見綠色熒光，隨熊果酸藥物濃度的增加，紅色熒光逐漸減弱，綠色熒光逐漸增強。見圖2。

2.4 熊果酸對細胞內(nèi)活性氧含量的影響隨熊果酸藥物濃度的增加，細胞熒光強度逐漸減弱，說明隨熊果酸藥物濃度的增加，各濃度細胞中活性氧含量逐漸降低。見圖3。

圖示隨著熊果酸濃度增加，熒光強度逐漸減弱

a:0 μmol/L;b:4 μmol/L;c:8 μmol/L

2.5 間接免疫熒光標記法測細胞中存活素及VEGF的蛋白表達情況4、8 μmol/L熊果酸存活素、VEGF的蛋白相對表達量較0 μmol/L明顯降低(P<0.05)，8 μmol/L較4 μmol/L明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組細胞所得熒光強度值

2.6 qRT-PCR法測細胞中存活素及VEGF mRNA的表達情況4、8 μmol/L熊果酸存活素 mRNA的表達(0.53±0.07、0.71±0.09)較0 μmol/L熊果酸(1.00±0.00)明顯降低(P<0.01)，8 μmol/L熊果酸較4 μmol/L明顯降低(P<0.05)。4、8 μmol/L熊果酸VEGF mRNA的表達量(0.68±0.04、0.42±0.07)較0 μmol/L熊果酸(1.00±0.00)明顯降低(P<0.01)，8 μmol/L熊果酸較4 μmol/L明顯降低(P<0.05)。

3 討 論

甲狀腺乳頭狀癌是甲狀腺癌中最常見的病理類型，屬分化型，惡性度較其他類型低[4]，但對放化療不敏感，因此手術(shù)治療仍是目前最有效的治療方法[5]。近年來，甲狀腺乳頭狀癌發(fā)病率逐年上升，占甲狀腺癌發(fā)病率的90%以上[6]。 由于診斷水平的提高及診斷程序的改進，使更小的腫瘤(尤其是微小乳頭狀癌)的檢測成為可能[7]，甲狀腺癌的年發(fā)病率在過去40年中幾乎增加了2倍[8-9]。甲狀腺乳頭狀癌發(fā)展緩慢，臨床不適癥狀少見，因而其疾病性質(zhì)易被忽視。給予本病患者適當手術(shù)干預及放射性碘治療，部分患者加用促甲狀腺激素抑制治療均可獲得良好預后。但本病早期易發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移，有報道稱約40%～60%的甲狀腺乳頭狀癌病例在首診時已發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的復發(fā)率約是未轉(zhuǎn)移病例的6倍[10]。因而研究甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)病機制并探尋新的防治方法成為研究的熱點，如分子靶向治療、中醫(yī)藥治療等[11]。

熊果酸作為一種廣泛存在于果蔬中的天然物質(zhì)，近年來其抗腫瘤作用得到了國內(nèi)外學者的普遍關(guān)注。目前與熊果酸及其衍生物相關(guān)抗腫瘤作用研究已涉及乳腺癌、肝癌、肺癌、胃癌等多個方面[12-15]，并取得了實質(zhì)性進展。范源等[2]對其抗腫瘤作用機制進行研究，發(fā)現(xiàn)熊果酸可通過多種細胞信號通路對腫瘤進行抑制作用，包括對腫瘤形成細胞毒作用、抑制其增殖、誘導其凋亡，并且在抗腫瘤細胞侵襲和抗腫瘤血管形成方面也具有一定作用。但其對甲狀腺癌細胞有無作用及相關(guān)作用機制的研究暫未見報道。因此本研究對甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞進行 熊果酸干預，檢測其對TPC-1細胞增殖的影響時發(fā)現(xiàn)，隨熊果酸濃度的逐漸增加，TPC-1細胞的增殖抑制率逐漸增大，說明熊果酸對TPC-1細胞增值具有一定的抑制作用。應用流式細胞術(shù)檢測熊果酸對TPC-1細胞的凋亡有無影響時發(fā)現(xiàn)，隨熊果酸濃度的增加，TPC-1細胞的細胞凋亡率逐漸增大，說明熊果酸對促進TPC-1細胞凋亡具有一定的作用。

惡變發(fā)生后，腫瘤組織生長加速，需氧量增加，供氧血管需求增大。機體為適應缺氧環(huán)境分泌多種生物因子來促進血管生成。VEGF是促進腫瘤血管生成的關(guān)鍵因子，在促進血管內(nèi)皮細胞分裂、增殖，促進血管生成以改善腫瘤組織缺氧方面起到關(guān)鍵性作用[16]。VEGF不僅在促進腫瘤新生血管形成方面作用顯著，而且也是促進腫瘤細胞增殖的重要因素，因此VEGF已成為目前腫瘤診治的重要研究對象。VEGF和VEGFR抑制劑已在晚期腫瘤的治療中獲得重大突破。存活素是一種凋亡抑制蛋白，為凋亡抑制蛋白 (inhibitor of apoptosis protein, IAP) 家族成員，具有腫瘤特異性，只表達于腫瘤和胚胎組織，正常組織中不表達或低表達。 存活素具有抗凋亡、調(diào)控細胞分化增殖等作用。本研究采用間接免疫熒光標記法及qRT-PCR法分別檢測TPC-1細胞中存活素及VEGF的蛋白和mRNA表達情況及隨藥物濃度的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照組中存活素及VEGF 的蛋白及mRNA呈高表達，隨熊果酸藥物濃度的增高，存活素及VEGF的蛋白和 mRNA 的表達均逐漸降低，說明熊果酸可有效抑制TPC-1細胞中存活素和VEGF的表達。Ma等[17]認為VEGF 可上調(diào) 存活素 的表達。Mesri 等[18]認為 存活素 是在VEGF介導下調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增殖及血管生成，且認為VEGF的存在是存活素起調(diào)節(jié)血管生成作用的條件。結(jié)合本實驗結(jié)論可知熊果酸可通過調(diào)節(jié)細胞中存活素及VEGF的表達來影響TPC-1細胞的增殖及組織血管生成。

在腫瘤細胞的凋亡過程中，存活素的表達增強可進一步抑制細胞線粒體內(nèi)凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3、Caspase-9的活化及凋亡活性物質(zhì)的釋放[19-20]。當腫瘤細胞受到內(nèi)部凋亡刺激因子的作用時，可誘發(fā)鈣超載、活性氧含量增加，進而導致線粒體跨膜電位降低甚至消失等現(xiàn)象[21]，造成線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔不可逆性開放，進而釋放細胞色素C和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase-3)等一系列變化的發(fā)生，進而啟動細胞凋亡程序。本研究利用JC-1試劑盒及熒光探針DCFH-DA檢測熊果酸作用于TPC-1細胞后其線粒體膜電位變化及活性氧的變化情況。當線粒體膜電位較高時，JC-1在線粒體基質(zhì)中結(jié)合為紅色熒光的物質(zhì)；當線粒體膜電位較低時，JC-1不能參與聚集，此時為帶有綠色熒光JC-1單體物質(zhì)。所以我們可根據(jù)熒光的顏色來觀測線粒體膜電位的變化情況，由實驗可見隨熊果酸濃度的增加TPC-1細胞線粒體膜電位逐漸降低，DCF的熒光強度逐漸減弱。因此考慮熊果酸誘導TPC-1細胞的凋亡可能通過增加線粒體內(nèi)活性氧含量，導致線粒體膜電位下降，進而啟動線粒體途徑導致細胞凋亡，但具體量化指標及相關(guān)檢測有待進一步實驗驗證。

綜上所述，本研究顯示熊果酸可通過抑制甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞中存活素及VEGF的表達，進而有效抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡及影響腫瘤組織的血管生成；其誘導凋亡途徑可能通過增加線粒體內(nèi)活性氧含量，導致線粒體膜電位下降，進而啟動線粒體凋亡途徑來實現(xiàn)。