蒙藥制劑棘豆止咳散質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

扎拉嘎白乙拉 楊 楠 吳鳳嬌 郝俊生, 王青松 呼格吉勒 楊立國, 蘇都那布其 包曉華, 王秀蘭, 奧·烏力吉,

1.庫倫旗蒙醫(yī)醫(yī)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000；2.內(nèi)蒙古蒙醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，內(nèi)蒙古 通遼 028000；3.內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000

棘豆止咳散為內(nèi)蒙古通遼市庫倫旗蒙醫(yī)醫(yī)院院內(nèi)制劑達(dá)格沙-4的優(yōu)化改進(jìn)處方，是由多葉棘豆、川貝母、甘草、石膏等4味蒙(中)藥組成，該藥對于咳嗽具有明顯療效，且價格低廉，無毒副作用，老人、兒童均可使用[1]。為了更好地控制棘豆止咳散質(zhì)量，保證臨床用藥安全、有效，筆者對其進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，采用粉末顯微鑒別方法對制劑中的多葉棘豆、川貝母、甘草和石膏進(jìn)行了定性鑒別；采用薄層色譜法對制劑中川貝母和甘草進(jìn)行了定性鑒別；根據(jù)2015年版《中華人民共和國藥典》對其粒度、外觀均勻度和水分進(jìn)行了測定；通過HPLC法測定了其中甘草苷的含量。所建立的鑒別、檢查和含量測定方法簡便易行，重復(fù)性好，可用于生產(chǎn)過程中棘豆止咳散的質(zhì)量控制，為臨床上更加安全、可靠、有效的應(yīng)用棘豆止咳散奠定了方法基礎(chǔ)?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試劑

LC-20AT 高效液相色譜儀(島津公司)；Nikon E2000電子顯微鏡和DS-U3拍照裝置(北京恒三江儀器銷售公司)；T-1700M馬弗爐(鄭州天縱電氣設(shè)備公司)；DHG-9023A型電熱恒溫箱(寧波江南儀器廠)；BS224 S分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)公司)；FW-177高速萬能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)；HW-526數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海恒科學(xué)儀器有限公司)；硅膠G(薄層色譜)、硅膠GF254(薄層色譜)，青島海洋化工有限公司制造；薄層色譜硅膠G板(批號20170902)，青島海洋化工廠產(chǎn)；薄層色譜硅膠GF254板(批號20170608)，青島海洋化工廠產(chǎn)；棘豆止咳散(庫倫旗蒙醫(yī)醫(yī)院自制，批號201902001-201902003)；實驗用多葉棘豆藥材由赤峰榮興堂藥業(yè)有限責(zé)任公司蒙藥飲片廠提供(生產(chǎn)批號：1807046)；甘草藥材由赤峰榮興堂藥業(yè)有限責(zé)任公司蒙藥飲片廠提供(生產(chǎn)批號：170628)；川貝母藥材由赤峰榮興堂藥業(yè)有限責(zé)任公司蒙藥飲片廠提供(生產(chǎn)批號：1701036)；生石膏藥材由赤峰榮興堂藥業(yè)有限責(zé)任公司蒙藥飲片廠提供(生產(chǎn)批號：1703067)；甘草苷對照品(生產(chǎn)批號：111610-201607，中國食品藥品檢定研究院)；陰性對照樣品(內(nèi)蒙古蒙醫(yī)藥工程技術(shù)研究院自制)；95%乙醇(天津市永大化學(xué)有限公司)；乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 棘豆止咳散中多葉棘豆、川貝母、甘草、石膏的顯微鑒別 根據(jù)顯微鑒別方法(《中國藥典》2015年版四部通則2001)試驗。取棘豆止咳散(201902001)適量，水合氯醛、稀甘油制片，放顯微鏡下觀察，結(jié)果如圖1所示。

圖1 棘豆止咳散顯微特征圖

2.1.1 多葉棘豆 纖維多成束，碎斷，淡黃色，壁較厚，直徑10～40 μm；非腺毛為單細(xì)胞，長約88～430 μm，直徑15～50 μm；葉上、下表皮細(xì)胞為長方形或不規(guī)則形，垂直壁彎曲，并有不定式氣孔，類圓形或橢圓形，上表皮氣孔略小。

2.1.2 川貝母 淀粉粒眾多，呈廣卵形、貝殼形、腎形或橢圓形，直徑40～60 μm，臍點短縫狀、人字狀或馬蹄狀，層紋可察見。螺紋導(dǎo)管和網(wǎng)紋導(dǎo)管直徑可達(dá)64 μm。

2.1.3 甘草 粉末淡棕黃色。纖維成束，直徑8～15 μm，壁厚，纖維束周圍薄壁細(xì)胞含草酸鈣方晶，形成晶纖維。草酸鈣方晶多見。具緣紋孔導(dǎo)管較大，稀有網(wǎng)紋導(dǎo)管。木栓細(xì)胞紅棕色，多角形。

2.1.4 石膏 不規(guī)則片狀無色結(jié)晶，有平直紋理。低負(fù)突起，糙面不顯著。

2.2 棘豆止咳散中川貝母、甘草的薄層鑒別

2.2.1 棘豆止咳散中川貝母的薄層鑒別 取3批次棘豆止咳散各12 g，加氨試液25 mL，密塞，浸泡1 h，加二氯甲烷25 mL，超聲處理1 h，濾過，濾液用3%鹽酸振搖提取3次，每次8 mL，合并酸液，用氨水調(diào)pH=10，用二氯甲烷振搖提取3次，每次10 mL，合并二氯甲烷提取液，水浴蒸干，殘渣加1 mL甲醇使溶解，作為供試品溶液。另取川貝母對照藥材1 g，同法制成川貝母對照藥材溶液。再取多葉棘豆藥材2 g、甘草藥材2 g、石膏1 g，分別打粉、過篩、混合均勻，同法制成陰性溶液。照薄層色譜法(中國藥典2015年版四部通則0502)試驗，吸取上述5種溶液各3 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-氨水-水(25∶1∶1∶0.1)為展開劑，展開，取出，晾干，依次噴稀碘化鉍鉀試液和亞硝酸鈉乙醇試液。結(jié)果如圖2所示。

圖2 棘豆止咳散中川貝母薄層鑒別色譜圖

2.2.2 棘豆止咳散中甘草的薄層鑒別 取3批次棘豆止咳散各1 g，加65%乙醇10 mL，加熱回流2 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取甘草對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。再取甘草苷對照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(中國藥典2015年版四部通則0502)試驗，吸取上述5種溶液各3 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15∶1∶1∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點清晰。結(jié)果如圖3所示。

圖3 棘豆止咳散中甘草薄層鑒別色譜圖

2.3 棘豆止咳散粒度、外觀均勻度和水分測定 根據(jù)2015年版《中華人民共和國藥典》四部通則0982、0115、0832測定三批次棘豆止咳散中粒度、外觀均勻度、水分進(jìn)行了測定，結(jié)果見圖4、表1。

圖4 棘豆止咳散外觀均勻度檢查

表1 棘豆止咳散粒度、水分測定結(jié)果

2.4 棘豆止咳散中甘草苷含量測定

2.4.1 色譜條件 色譜柱：X Terra?MSC18 5.0 μm (4.6 mm×250 mm)；流動性：A相為乙腈，B相為0.05%磷酸水溶液；按表2進(jìn)行梯度洗脫；檢測波長237 nm；柱溫40 ℃；流速1.0 mL·min-1；檢測時間40 min；進(jìn)樣量10 μL。在上述條件下，供試品溶液中甘草苷色譜峰與其他相關(guān)峰均能達(dá)到較好分離，分離度大于1.5，理論塔板數(shù)以甘草苷計不低于2000。按棘豆止咳散處方制備工藝自制不含甘草藥材的陰性供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果陰性溶液對樣品測定無干擾。結(jié)果如圖5所示。

表2 流動相梯度洗脫表

圖5 甘草苷(A)、棘豆止咳散(201902001)、陰性對照樣品的HPLC色譜圖

2.4.2 對照品和供試品溶液的制備

2.4.2.1 對照品溶液的制備 取甘草苷對照品，精密稱定，加70%乙醇制成每1 mL含甘草苷0.1 mg的溶液，備用。

2.4.2.2 供試品溶液的制備 取棘豆止咳散約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇30 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，備用。

2.4.3 線性關(guān)系考察 精密稱量甘草苷對照品1.08 mg于10 mL容量瓶中，加70%乙醇溶液使其溶解，并稀釋至刻度，得其甘草苷濃度為0.108 mg/mL。分別精密吸取5、7.5、10、12.5、15μL，注入高效液相色譜儀，按“2.4.1”項下條件進(jìn)行測定，以對照品色譜峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程為y=198188x+184557，其中r2=0.9993，說明甘草苷在上述范圍內(nèi)有良好線性關(guān)系。

2.4.4 精密度試驗 精密吸取“2.4.2”項下對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6針，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，根據(jù)其峰面積計算其RSD值為0.502%，表明該儀器精密度良好。

2.4.5 重復(fù)性試驗 精密稱量同一批次棘豆止咳散粉末6份，分別按照“2.4.2”供試品溶液制備方法制備，按“2.4.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，同一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6針，根據(jù)其峰面積計算其RSD值為0.632%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗 按“2.4.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，精密稱取同一批棘豆止咳散散劑粉末一份，按照“2.4.2”供試品溶液制備方法制備，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，根據(jù)其峰面積計算其RSD值為2.849%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.7 回收率試驗 精密稱量甘草苷對照品10.06 mg于10 mL容量瓶中，加70%乙醇溶液使其溶解，并稀釋至刻度，得其甘草苷濃度為1.006 mg/mL。精密稱取同一批棘豆止咳散粉末9份，每份0.25 g，在其中加入甘草苷對照品0.5 mL、1 mL、1.5 mL，每組三份，共九份。按照“2.4.2”供試品溶液制備方法制備，按“2.4.1”項下色譜條件，結(jié)果見表3，根據(jù)其回收率計算其RSD值為2.968%。

表3 回收率試驗結(jié)果

2.4.8 樣品測定 分別精密吸取對照品溶液和三批次供試品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀測定，計算得到三批次棘豆止咳散中甘草苷的含量見表4。

表4 棘豆止咳散甘草苷含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 定性鑒別 棘豆止咳散中川貝母、甘草、石膏均為2015版《中國藥典》收載藥材[2]，粉末顯微特征明顯[3-5]，參照2015版《中國藥典》方法對上述三味藥材進(jìn)行了鑒別；多葉棘豆為1998版中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)-蒙藥分冊收載藥材[6]，但其中未見顯微鑒別內(nèi)容，我們參照相關(guān)文獻(xiàn)[7-8]對多葉棘豆進(jìn)行了顯微鑒別。

多葉棘豆為本處方君藥，但由于多葉棘豆藥材化學(xué)成分較為復(fù)雜[9-13]，主產(chǎn)地不明確，不同批次多葉棘豆化學(xué)成分差別較大，因此，本研究未能確定處方中源自多葉棘豆的主要指標(biāo)成分，加之市場上尚無法定的多葉棘豆對照藥材，所以，本研究薄層鑒別中僅對處方中川貝母和甘草進(jìn)行了薄層鑒別，未能對多葉棘豆進(jìn)行薄層鑒別。

3.2 定量測定 在參照相關(guān)文獻(xiàn)基礎(chǔ)上[14-15]，本研究比較了甲醇-水、乙腈-水系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)以乙腈-水為流動相，檢測波長為237 nm時，被測組分的分離效果好，分離度符合要求。從2.4.3可知，相關(guān)系數(shù)r2=0.9993，說明甘草苷在上述范圍內(nèi)有良好線性關(guān)系。其精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性的RSD值均小于3.0%，從表3可以看出，其回收率在90.19%～97.87%，滿足中國藥典規(guī)定的當(dāng)待測組分含量為0.1%時，其回收率限度為90%～108%的要求。

4 結(jié)論

本研究建立了棘豆止咳散中各組方藥材顯微鑒別方法、棘豆止咳散中川貝母和甘草的薄層鑒別方法及棘豆止咳散中甘草苷的含量測定方法，試驗表明以上方法操作簡單，靈敏度高，重復(fù)性好，專屬性強(qiáng)，可作為棘豆止咳散的質(zhì)量控制方法，為臨床上更加安全、可靠、有效的應(yīng)用棘豆止咳散奠定方法基礎(chǔ)。