氣體信號(hào)分子硫化氫下調(diào)CTGF途徑在改善小鼠酒精性腎間質(zhì)纖維化中的應(yīng)用

張愛民，劉佳麗，向長(zhǎng)鐵，劉茂軍，吳 倩，陳 堅(jiān)，聶連桂，張晶晶，楊 軍

(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，湖南 衡陽 421001)

在酒文化歷史悠久的中國(guó)，隨著社會(huì)發(fā)展、經(jīng)濟(jì)水平的提高，新型行業(yè)的崛起，飲酒已成為聚會(huì)、應(yīng)酬不可或缺的一部分。過量飲酒會(huì)導(dǎo)致多臟器功能損害，現(xiàn)已成為當(dāng)今世界范圍內(nèi)的重要公共衛(wèi)生問題之一[1]。肝臟作為乙醇代謝及易受損傷的主要器官之一，其相關(guān)機(jī)制已有較深入探索[2-4]，而隨著對(duì)酒精性相關(guān)疾病研究的深入，腎臟作為僅次于肝臟的乙醇排泄器官，發(fā)現(xiàn)乙醇對(duì)腎臟也有明顯損傷作用，但相關(guān)研究尚少見報(bào)道。腎間質(zhì)纖維化是指各種原發(fā)性、繼發(fā)性腎損害發(fā)展至終末期的共同通路[5-7]，抑制腎纖維化的發(fā)展有助于延緩腎功能減退。酒精性腎損傷作為腎間質(zhì)纖維化原因之一，探討酒精性腎損傷所致腎間質(zhì)纖維化相關(guān)作用機(jī)制對(duì)延緩腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展和指導(dǎo)治療具有重要意義。MMPs/TIMPs失調(diào)是引起腎間質(zhì)纖維化細(xì)胞外基質(zhì)集聚的重要調(diào)控機(jī)制[8]。結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor，CTGF)也被認(rèn)為是導(dǎo)致膠原重構(gòu)的一個(gè)重要介質(zhì)，其異常表達(dá)在腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程中也起著至關(guān)重要作用[9]。目前已有研究表明，H2S能延緩慢性腎臟病發(fā)展，參與肝、腎、心等多器官纖維化，但對(duì)酒精性腎間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制尚缺乏足夠的研究[10-11]。因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過飲用乙醇水溶液建立慢性酒精性腎損害小鼠模型，觀察H2S對(duì)小鼠酒精性腎間質(zhì)纖維化及MMP-8、TIMP-1與CTGF蛋白表達(dá)水平的影響以及在酒精性腎間質(zhì)纖維化的潛在治療及機(jī)制。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料：40只成年體健雄性昆明小鼠，購(gòu)自南華大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；實(shí)驗(yàn)小鼠分別單籠飼養(yǎng)于室內(nèi)，溫度約為(24±3)℃，按時(shí)消毒；小鼠可以自由獲得水和食物。硫氫化鈉(H2S)供體、內(nèi)源性H2S生成酶抑制劑炔丙基甘氨酸(PAG)購(gòu)于美國(guó) Sigma 公司；兔一抗MMP-8、TIMP-1、CTGF、GAPDH購(gòu)于中國(guó)博士德公司；兔二抗購(gòu)于美國(guó)Proteintech公司；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)于中國(guó)博士德公司；細(xì)胞裂解液購(gòu)于碧云天公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法：酒精性腎損傷小鼠模型制備及分組：將40只成年體健雄性昆明小鼠在上述環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,已排除外界干擾因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。之后將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(Control組)、酒精性腎損傷組(ARD組)、硫化氫干預(yù)組(H2S組)、內(nèi)源性H2S生成酶抑制劑炔丙基甘氨酸組(PAG組)，每組各10只。除Control組外，其他各組小鼠在標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)的基礎(chǔ)上，每日飲用4%的乙醇水溶液12周以構(gòu)建酒精性腎損傷模型(4%的乙醇水溶液是ARD組、H2S組及PAG組小鼠的唯一飲用水源)，每天早晨更換4%乙醇一次；Control組小鼠則每天飲用清水。另外，H2S組小鼠每天腹腔注射NaSH(50μmol/kg)，PAG組小鼠每天腹腔注射PAG(40 mg/kg)，Control組和ARD組小鼠則每天腹腔注射等劑量生理鹽水。根據(jù)組織病理形態(tài)學(xué)結(jié)果評(píng)價(jià)造模是否成功。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1PAS染色觀察腎臟組織形態(tài)學(xué)改變：取腎臟組織, 投入固定液內(nèi)固定脫水、透明、浸蠟、包埋。常規(guī)切片,脫蠟至水，蒸餾水沖洗，70%乙醇沖洗。浸入高碘酸酒精溶液10 min，70%乙醇沖洗后入還原液中1 min，70%乙醇沖洗后入無色鹽基性品紅溶液1 h，流水沖洗10 min，用哈瑞蘇木精復(fù)染細(xì)胞核3 min后，再用1%的鹽酸酒精分化，流水沖洗5 min，常規(guī)脫水、透明、封固。200倍光鏡下觀察小鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)改變。

1.3.2Masson染色觀察腎臟組織間質(zhì)纖維化程度：取小鼠腎臟組織，以100 g/L多聚甲醛固定后，取甲醛固定的腎臟組織；石蠟包埋,切片5 μm；切片脫蠟,入5%鐵明礬水溶液24 h；蒸餾水洗,用Regaud鐵木素染24 h；蒸餾水洗,入2.5%鐵明礬水溶液,至細(xì)胞核清晰顯出；自來水洗10 min；入1%冰醋酸配制的1%酸性復(fù)紅5 min；蒸餾水洗,加入磷鉬酸水溶液脫色；加入含2.5%冰醋酸苯胺藍(lán)飽和水溶液染5 min；蒸餾水洗,入1%冰醋酸水脫去過多的苯胺藍(lán)及磷鉬酸；入0.1%冰醋酸的無水酒精；用無水酒精脫水,二甲苯透明,封固。200倍光鏡下觀察小鼠腎臟組織間質(zhì)纖維化程度。

1.3.3Western Blot檢測(cè)MMP-8、TIMP-1和CTGF蛋白的表達(dá)水平：取各組小鼠新鮮腎臟組織研磨提取蛋白，采用BCA比色法進(jìn)行蛋白定量；配置10% SDS-PAGE分離膠電泳分離蛋白，蛋白樣品在100℃煮沸5 min，每孔20 μl蛋白樣品上樣，將膠置于電泳緩沖液中電泳用以分離目的蛋白，后將目的條帶切下，以10 V半干式電轉(zhuǎn)膜30 min將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用TBST配制的5% BSA封閉2 h，封閉后以MMP-8、TIMP-1和CTGF為一抗(稀釋度為 1∶500)、GAPDH為內(nèi)參37 ℃孵育1 h 后 4 ℃冰箱過夜；經(jīng)TBST洗膜后，用HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(稀釋度為1∶8 000)在37 ℃溫度下孵育1 h，用TBST洗膜，ECL顯色，曝光后掃描，用 Image J 圖像分析軟件進(jìn)行光密度分析。

2 結(jié)果

2.1大鼠存活情況：12周后，共存活35只大鼠，其中ARD組、H2S組、PAG組分別有2 只、1 只、2 只大鼠死亡。

2.2各組小鼠腎臟免疫組化結(jié)果的比較

2.2.1PAS染色：光鏡下可見ARD組與Control組相比，腎臟纖維排列明顯紊亂，腎小球、腎小管、腎間質(zhì)腫脹，腎小管退行性改變及系膜基質(zhì)增多；而H2S組與ARD組相比，腎臟纖維排列明顯改善，間質(zhì)有少量疏松結(jié)締組織，系膜基質(zhì)減少。PAG組小鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)和纖維排列與ARD組類似。見圖1。

A：Control組；B：ARD組；C：H2S組；D：PAG組

2.2.2Masson染色：與Control組相比，ARD組可見明顯腎小管間質(zhì)纖維化；與ARD組相比，H2S組腎小管間質(zhì)纖維化明顯改善；PAG組小鼠腎小管間質(zhì)纖維化程度與ARD組無明顯差異。見圖2。

A：Control組；B：ARD組；C：H2S組；D：PAG組

2.3硫化氫降低酒精性腎損傷大鼠腎臟組織中MMP-8、TIMP-1和CTGF蛋白的表達(dá)：取Control組、ARD組、H2S組和PAG組的腎臟組織，用Western blot法檢測(cè)各組蛋白MMP-8、TIMP-1和CTGF表達(dá)水平。結(jié)果：與Control組相比，ARD組小鼠腎臟組織中MMP-8、TIMP-1和CTGF蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與ARD組相比，H2S組小鼠腎臟MMP-8、TIMP-1和CTGF蛋白表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；PAG組與ARD組比較，MMP-8、TIMP-1和CTGF蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。提示硫化氫干預(yù)可抑制酒精性腎損害小鼠腎臟組織中MMP-8、TIMP-1和CTGF蛋白表達(dá)的上調(diào)。見圖3。

圖3 各組小鼠腎臟組織中MMP-8、TIMP-1和CTGF的蛋白表達(dá)水平(*:P<0.05,與control組比較；#：P<0.05，與ARD組比較)

3 討論

機(jī)體長(zhǎng)期攝入大量酒精后可導(dǎo)致多臟器功能損害，目前也有眾多酒精性肝損傷及其防治方面的研究報(bào)道，但對(duì)酒精引起的腎損傷尚未引起足夠重視。有研究提示酒精性腎損傷機(jī)制可能與乙醇在體內(nèi)代謝過程中氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)損傷、毒性代謝產(chǎn)物蓄積、誘導(dǎo)多種細(xì)胞生長(zhǎng)因子產(chǎn)生等直接或間接損害腎小球及腎間質(zhì)最終引起腎間質(zhì)纖維化有關(guān)[12]，其中以機(jī)體在各種生長(zhǎng)因子共同作用下不斷刺激成纖維細(xì)胞過度增殖活化，持續(xù)分泌不易降解的膠原蛋白，引起合成和降解失衡，造成細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellularma-trix, ECM)異常沉積，損傷腎小管，引起腎間質(zhì)纖維化為主要特征，但具體調(diào)控機(jī)制尚不明確。

腎間質(zhì)纖維化嚴(yán)重程度與腎功能不全具有明確相關(guān)性，是引起酒精性腎功能衰竭的重要病理機(jī)制，間質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)沉積、白細(xì)胞滲入、腎小管細(xì)胞凋亡和壞死等為其重要病理特征。MMPs是一類高度保守的依賴性內(nèi)肽酶，是降解細(xì)胞外基質(zhì)成分的主要酶系，可選擇性地分解ECM的各種成分[13]。MMP-8主要由嗜中性粒細(xì)胞合成，亦稱嗜中性粒細(xì)胞膠原酶，是一種專門降解細(xì)胞外基質(zhì)成分的酶，既參與炎性反應(yīng)刺激，還可通過增加I型膠原蛋白水解酶活性從而降解細(xì)胞外基質(zhì)參與組織重塑[14]。TIMPs 是 MMPs 的內(nèi)源性特異性抑制劑，TIMP-1參與心、腎重塑調(diào)節(jié)并作為心腎功能衰竭的標(biāo)志物。當(dāng) MMPs/TIMPs調(diào)節(jié)異常時(shí)，細(xì)胞外基質(zhì)合成增加、降解減少引起的基質(zhì)沉積在腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用[8]。CTGF是一類新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞生長(zhǎng)因子，廣泛存在于人類組織中，尤以腎組織含量最多，被認(rèn)為是導(dǎo)致膠原纖維重構(gòu)的重要介質(zhì)，參與腎臟、肝臟、肺等多臟器的纖維化過程，其機(jī)制可能與CTGF通過自身促進(jìn)成纖維細(xì)胞有絲分裂、增殖、趨化性和黏附或者聯(lián)合其他細(xì)胞因子調(diào)控腎系膜細(xì)胞的分化、細(xì)胞外間質(zhì)合成與降解參與腎間質(zhì)纖維化的發(fā)病過程[15-16]。CTGF還能直接誘導(dǎo)TIMP-1參與組織修復(fù)和重塑[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，酒精性腎損傷小鼠出現(xiàn)明顯腎小管間質(zhì)纖維化，且CTGF、MMP-8表達(dá)水平明顯上調(diào)，其抑制劑TIMP-1表達(dá)水平也代償性上調(diào)，提示腎間質(zhì)纖維化可能與CTGF信號(hào)通路及其調(diào)控的MMP-8/TIMP-1失調(diào)有關(guān)。

H2S是一種具有廣泛生理功能的新型氣體信號(hào)分子，由半胱氨酸通過光硫醚γ-裂解酶(GCL)和胱硫醚β-合酶(CBS)合成。目前多研究表明，H2S可通過抗氧化應(yīng)激、抗炎、抑制細(xì)胞凋亡等對(duì)心血管系統(tǒng)起保護(hù)作用[18]。也有研究表明H2S具有增加腎血流量、腎小球?yàn)V過率和抑制蛋白尿等作用，還能防止足細(xì)胞損傷，保持腎小球結(jié)構(gòu)的完整性等，從而對(duì)腎臟發(fā)揮保護(hù)作用[19]。本試驗(yàn)成功構(gòu)建酒精性腎損傷小鼠模型，表明H2S干預(yù)可明顯改善酒精性腎損害小鼠腎間質(zhì)纖維化，同時(shí)腎臟組織中MMP-8、TIMP-1和CTGF蛋白的表達(dá)也顯著下調(diào)，提示H2S可能通過下調(diào)CTGF信號(hào)通路及其調(diào)控的MMP-8/TIMP-1失調(diào)而抑制腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的激活、增殖，減少細(xì)胞生長(zhǎng)因子生成發(fā)揮抗纖維化作用，因此，抑制CTGF、MMP-8、TIMP-1表達(dá)對(duì)延緩酒精性腎損害所致腎間質(zhì)纖維化有重要作用。