帚枝千屈菜白粉病的病原鑒定

任毓忠，李 妍，方治豪，海 艷，王凱濤

（石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲害治理與植保資源利用重點實驗室，新疆石河子832003）

帚枝千屈菜（Lythrum virgatumLinn.）為千屈菜科（Lythraceae）宿根多年生濕生小灌木類植物，別稱水柳[1]。它具有耐鹽堿、耐旱、耐寒等特性，對生長環(huán)境的適應(yīng)性很強(qiáng)。另外，帚枝千屈菜秀麗整齊的高大株叢、淡雅美麗的花色、較長的花期和觀賞時間、簡單的養(yǎng)護(hù)管理方法以及凈化水體的優(yōu)良功效，在全國各地的河岸沿線、濕地及湖邊都可作為景觀植物栽植。在城市園林設(shè)計中，常常用作鑲嵌于林地邊緣的花鏡或道路邊的綠化隔離帶[2]，也可栽植于城市景觀河邊，發(fā)揮其進(jìn)化水體的城市生態(tài)衛(wèi)士功能。其全草還可入藥[3]。石河子市也大量從外地引種和栽植帚枝千屈菜，主要作為花鏡和水體保護(hù)應(yīng)用于城市景觀。關(guān)于帚枝千屈菜病害的報道并不多見，白粉病主要危害其葉片、莖稈和花梗等部位，以白色粉狀物覆蓋葉片，使葉片失綠甚至干枯死亡，導(dǎo)致植株早衰，花期縮短，嚴(yán)重影響其觀賞價值。南斯拉夫和我國內(nèi)蒙古都已報道了千屈菜（L.salicaria）白粉病的發(fā)生和危害，依據(jù)病菌的形態(tài)特征，將病原確定為千屈菜白粉病菌Erysiphe lythri[4-5]，但并未記錄病菌是否可以感染千屈菜屬的其他種類，包括小灌木類的帚枝千屈菜（E.lythri）。

本研究擬通過田間調(diào)查、病菌形態(tài)觀察和rD-NA-ITS 區(qū)序列分析，明確石河子帚枝千屈菜白粉病的危害現(xiàn)狀及病原菌種類，為帚枝千屈菜白粉病的防控提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病樣的采集

2018 年7 月上旬帚枝千屈菜白粉病在石河子市初始發(fā)生，在病害發(fā)生較普遍的市區(qū)景觀河公園內(nèi)，每隔7～10 d，采集白粉病癥狀明顯的新鮮葉片或莖稈，用自封袋帶回石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院實驗室，用于病菌的形態(tài)觀察和鑒定，直到9 月上旬結(jié)束。

1.2 田間癥狀觀察

從7 月上旬開始，每隔7～10 d 定點觀察田間白粉病的發(fā)生擴(kuò)展情況，記錄病害的癥狀表現(xiàn)，以及病菌有性時代閉囊殼的出現(xiàn)時間等。

1.3 病原形態(tài)特征觀察

將采集的新鮮白粉病樣本帶回實驗室后，用透明膠帶粘貼病組織上的新鮮病斑，然后將膠帶粘貼面向下，小心放置在滴加蒸餾水的載玻片表面，如果氣泡太多，可在水中添加少量的洗衣粉（1%）。用光學(xué)顯微鏡（MOTIC BA300）觀察和記錄描述病菌的形態(tài)特征，并測量病菌各個營養(yǎng)體和繁殖體的大小，主要包括外生菌絲、附著胞的形狀、分生孢子梗的特征和大小、分生孢子的著生方式及形態(tài)大小；閉囊殼的顏色、形態(tài)大小，閉囊殼上附屬絲的形態(tài)、附屬絲數(shù)量；閉囊殼內(nèi)含有的子囊數(shù)、子囊的形態(tài)、大小，單個子囊內(nèi)子囊孢子數(shù)、孢子特征形態(tài)和大小等[6-7]。將觀察記錄的病菌特征結(jié)果，參考白粉菌系統(tǒng)分類鑒定方法[8-12]，明確引起石河子帚枝千屈菜白粉病的病原分類地位。

1.4 病原分子鑒定

1.4.1 基因組DNA 的提取和PCR 擴(kuò)增 在白粉病發(fā)生高峰期，采集新鮮的白粉病癥狀明顯的葉片帶回室內(nèi)，用干凈的毛筆刷取葉片表面的白粉層，收集大約0.5 g 病菌樣品，用真菌基因組DNA 提取試劑盒（BioFlux 公司），依據(jù)說明書的步驟提取白粉菌基因組DNA。PCR 擴(kuò)增采用真菌rDNA-ITS 區(qū)通用引物為ITS1/ITS4，引物交上海生工生物工程有限公司合成，序列分別為ITS1（5′-TCCGTAGGTG AACCTGCGG-3′）、ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGAT ATGC-3′）[7]。PCR 擴(kuò)增程序參照 MORI 等[9]的方法進(jìn)行，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測目標(biāo)片段。

1.4.2 病菌rDNA-ITS 區(qū)序列的分析 將電泳檢測后的病菌rDNA-ITS 區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測序，測序結(jié)果進(jìn)行拼接、校正后，在 GenBank（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）數(shù)據(jù)庫上傳測序結(jié)果，并進(jìn)行核酸序列BLAST 比對和分析，比對結(jié)果用于病菌rDNA-ITS 區(qū)的序列同源性分析和鑒定；同時查閱千屈菜（Lythrum）白粉病的相關(guān)資料和已登錄的序列，同時查閱和下載白粉菌屬（Erysiphe）相近種的rDNA-ITS 區(qū)序列，采用DNAMAN 8.0 軟件分析序列的同源性，MEGA 7.0 軟件用鄰近距離法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[13-15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀

觀察發(fā)現(xiàn)，在石河子市，帚枝千屈菜白粉病從7 月初開始，病菌以感染葉片為主，莖稈、葉柄、花穗軸、萼片和托葉也可感染，花瓣一般不感染。發(fā)病初期，植株下部葉片正面先出現(xiàn)零星白色的小霉斑，后逐漸擴(kuò)展至上部葉片；發(fā)病嚴(yán)重時，葉片正反面都覆蓋有白色粉狀物，葉片形成褐色到紅褐色的失綠小斑點，隨后整個葉片顏色變深，呈黃褐色到紅褐色，質(zhì)地變硬變脆，植株早衰（圖1-A）。主莖、花穗軸以及葉柄感病一般先從幼嫩部位開始，表面先出現(xiàn)不規(guī)則的白色霉斑，進(jìn)一步擴(kuò)展后，上部莖稈和穗軸均覆蓋有白色粉狀物，后期莖稈顏色變褐（圖1-B、C）。托葉和萼片癥狀與葉片相似，嚴(yán)重時除花瓣外的全部花序組織密布白色粉層，造成花蕾大部分脫落或花朵提早凋萎，花期大大縮短或觀賞品質(zhì)降低（圖1-C）；8 月中旬后，葉片正面的病斑上形成初期黃色、后變黑色的顆粒狀小點，即白粉菌的閉囊殼，閉囊殼在病斑表面多散生，少聚生（圖1-D）。

2.2 病原的形態(tài)特征

病菌經(jīng)光學(xué)顯微觀察，帚枝千屈菜白粉病菌的菌絲體外生，無色透明，菌絲直徑為5.7 μm（4.1～7.6 μm），附著胞多單生，少數(shù)對生，呈乳突狀或裂瓣狀（圖2-A）；分生孢子梗直立，由1～4 個細(xì)胞組成，長度為 52.9 μm（26.3～78.9 μm），腳胞直或彎曲，圓柱狀；上單生1 個分生孢子（圖2-B），分生孢子單細(xì)胞，無色透明，多為短棒狀，少數(shù)桶形或橢圓，大小為 33.4 μm（27.2～43.4 μm）×17.2 μm（14.0～21.6 μm），表面無纖維狀體（圖 2-C）；分生孢子萌發(fā)只產(chǎn)生1 個芽管，芽管從孢子的單側(cè)頂端伸出（圖2-D）。

病菌的閉囊殼初為黃色，成熟后變?yōu)楹稚梁谏鄶?shù)散生，少聚生，扁球形或球形，直徑為98.7 μm（90.5～112.3 μm），壁細(xì)胞呈不規(guī)則的多邊形；附屬絲長菌絲狀，13～23 根，頂端無分枝，彎曲或部分呈曲折狀，附屬絲0～6 個分隔，長度為66～700 μm，是閉囊殼直徑的 0.6～7 倍（圖 2-E）；成熟的附屬絲全長褐色，或基部細(xì)胞顏色較深，頂端細(xì)胞無色透明；閉囊殼內(nèi)著生有3～7 個子囊（圖2-F）；子囊近圓形或卵圓形，無柄或少數(shù)短柄，子囊大小為（53.4～65.6）μm×（35.4～54.8）μm；子囊內(nèi)有3～6 個子囊孢子，子囊孢子單胞無色，橢圓形至球形，大小為（17.3～28.2）μm×（12.3～18.3）μm（圖2-G）。

根據(jù)以上所觀察的石河子帚枝千屈菜白粉病病原的形態(tài)特征，與BRANISLAV 等[4]和劉鐵志等[5]描述的千屈菜白粉菌（E. lythri）特征表現(xiàn)一致，因此，初步將石河子帚枝千屈菜白粉病的病原鑒定為千屈菜白粉菌（Erysiphe lythri）。

2.3 rDNA-ITS 區(qū)序列的測定和分析

對石河子市帚枝千屈菜白粉病菌株SHZLV01 rDNA-ITS 區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得的目標(biāo)片段大小為639 bp，將目標(biāo)片段的序列在NCBI 核酸數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行 BLAST 比對（登錄號：MK779057），擴(kuò)增序列與GenBank 中已登錄的中國千屈菜（Lythrum salicaria）白粉菌Erysiphe lythri（登錄號：MG797990和MG786589）序列相似性高達(dá)98.75%以上；系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3）的結(jié)果也顯示，SHZLV01 菌株與千屈菜白粉菌（E. lythri）處于同一分支上，與白粉菌屬的其他種之間的序列同源性相對較低。由此證明，新疆石河子帚枝千屈菜上感染的白粉病菌與千屈菜白粉菌（E. lythri）存在極大的親緣關(guān)系。

綜合病菌的形態(tài)特征和rDNA-ITS 區(qū)序列的比對和分析結(jié)果，將引起石河子市區(qū)帚枝千屈菜白粉病的病原鑒定為千屈菜白粉菌（Erysiphe lythri），這是該病菌在新疆的初次發(fā)現(xiàn)和報道。

3 結(jié)論與討論

帚枝千屈菜由于其很強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性和優(yōu)良的觀賞價值，已在很多城市作為城市綠化美化的花種之一，白粉病的發(fā)生嚴(yán)重影響了其觀賞性能。BRANISLAV 等[4]報道了引起南斯拉夫千屈菜（L.salicaria）白粉病的病原為Erysiphe lythri，并對病菌的形態(tài)特征進(jìn)行了描述，認(rèn)為該病菌的分生孢子和分生孢子梗很少，對無性世代特征描述較簡單。劉鐵志等[5]報道了在內(nèi)蒙古的千屈菜（L. salicaria）上有該病菌的侵染，并描述了其形態(tài)特征。本研究中在石河子市區(qū)帚枝千屈菜（L. virgatum）上的白粉病菌的特征與已報道的基本一致。菌株rDNA-ITS 區(qū)序列的BLAST 比對時發(fā)現(xiàn)，該序列與已登錄的來自黑龍江的千屈菜（L. salicaria）白粉病菌E. lythri（登錄號：MG797990 和MG786589）序列同源性最高，但來自黑龍江菌株的形態(tài)特征并未見報道。本研究將病菌形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定相結(jié)合，將引起新疆帚枝千屈菜白粉病的病原確定為千屈菜白粉病菌（Erysiphe lythri），這是該病菌引起帚枝千屈菜白粉病的首次報道。