部分蘋果屬種質(zhì)遺傳多樣性分析及分子身份證構(gòu)建

侯麗媛 ，董艷輝 ，鄧 舒 ，肖 蓉 ，張春芬 ，趙 菁 ，曹秋芬

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院）生物技術(shù)研究中心，山西太原030031；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院）果樹研究所，山西太原030031）

蘋果樹是世界上最重要的果樹之一，而我國是世界上最大的蘋果生產(chǎn)國，每年的蘋果出口量也位居世界前列。蘋果品質(zhì)資源復(fù)雜多樣，加之我國乃至世界各地的頻繁交流，很容易造成蘋果種質(zhì)的混雜，為了對蘋果種質(zhì)資源進(jìn)行保護(hù)，有必要對蘋果品種資源進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，這也是對蘋果種質(zhì)資源保存和利用的前提，更是對其進(jìn)行知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)的必要手段。

SSR 標(biāo)記是特異性強(qiáng)的一類分子標(biāo)記技術(shù)，具有共顯性、豐富的多態(tài)性、高度重復(fù)性及可靠性，同時操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，近年來應(yīng)用非常廣泛[1]，是構(gòu)建指紋圖譜比較理想的分子標(biāo)記[2-3]。熒光SSR 分子標(biāo)記技術(shù)是在SSR 分子標(biāo)記基礎(chǔ)上發(fā)展起來的和熒光測序技術(shù)有效結(jié)合的一種新技術(shù)。其具有高度智能化特點(diǎn)，這種標(biāo)記利用測序儀對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行自動檢測，不僅效率高而且靈敏度和準(zhǔn)確性好，同時還避免了人工判讀條帶帶來的誤差。目前，熒光SSR 分子標(biāo)記已被應(yīng)用于許多園藝植物研究中[4-5]，而且國內(nèi)外園藝植物DNA 分子身份證研究方面已取得了許多進(jìn)展[6-11]。

本研究通過對選取的山定子和我國華北地區(qū)種植面積相對較大的25 份蘋果栽培品種作為試驗(yàn)材料，運(yùn)用熒光SSR 分子標(biāo)記技術(shù)對供試材料進(jìn)行分子鑒定，并在此基礎(chǔ)上對供試材料進(jìn)行了遺傳多樣性分析，同時建立了各供試材料的指紋圖譜和分子身份證，并在分子水平對山定子作為最常用蘋果砧木進(jìn)行了驗(yàn)證，旨在為蘋果種質(zhì)資源的利用與知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

為保證供試材料的可靠性，本研究選用的試驗(yàn)材料均取自國家果樹種質(zhì)興城蘋果圃，包括砧木系材料1 份（山定子），栽培品種25 份，其中，美國育成品種11 份、日本育成品種7 份、我國育成品種6 份、加拿大育成品種 1 份（表 1）。

表1 26 份供試材料來源

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA 提取和引物合成 采用德國QIAGEN 的 DNeasy Plant Mini Kit 的 DNA 試劑盒提取供試材料春季嫩葉基因組DNA。

表2 16 對熒光標(biāo)記SSR 引物及退火溫度

SSR 引物序列選擇擴(kuò)增片段長度100～300bp，結(jié)合 HOKANSON 等[12]、LIEBHARD 等[13]、YAMAMOTO 等[14-15]、GUILFORD 等[16]和高源等[17]報(bào)道的 SSR引物序列，同時參考高源等[18]報(bào)道的熒光標(biāo)記引物，在對大量蘋果品種鑒定的基礎(chǔ)上，共篩選出16 對熒光SSR 引物用于本試驗(yàn)（表2）。帶有6-FAMTM熒光標(biāo)記的5′端SSR正向引物和SSR 反向引物均由上海Sangon 公司合成。

1.2.2 試驗(yàn)程序 PCR 反應(yīng)體系和PCR 程序參照文獻(xiàn)[19]，并稍作修改。其中，PCR 反應(yīng)體系為 15 μL，包括模板DNA（20 ng/μL）3 μL、F-primer（2 μmol/L）1.5 μL、R-primer（2 μmol/L）1.5 μL、10×PCR Buffer（不含 Mg2+）1.5 μL、Mg2+（25 mmol/L）0.9 μL、dNTP（25 mmol/L）0.12 μL，Taq酶（5 U/μL）0.12 μL，ddH2O 6.36 μL。

PCR 程序：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 1 min，退火1 min（退火溫度因引物而異），72 ℃延伸2 min，32 個循環(huán)；72 ℃延伸 10 min；4 ℃保存。

PCR 擴(kuò)增采用乙醇進(jìn)行純化，95 ℃變性5 min，在美國ABI 3730 基因測序儀上對純化后的SSR熒光標(biāo)記產(chǎn)物進(jìn)行熒光檢測，并對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行收集。

1.2.3 核心引物篩選 在前期篩選出的16 對熒光SSR 引物中進(jìn)一步篩選出7 對SSR 核心引物用于分子身份證構(gòu)建。這7 對SSR 核心引物能對本研究選用的試驗(yàn)材料進(jìn)行有效的區(qū)分，其分別是GD142、GD147、GD162、CH01h01、CH01f02、H02d08、CH02d12。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

對ABI3730 基因測序儀上獲得的不同樣品的指紋數(shù)據(jù)（即不同樣品在每個SSR 位點(diǎn)的擴(kuò)增片段長度）利用GeneMapper 3.0 軟件進(jìn)行分析。遺傳數(shù)據(jù)分析利用軟件GenAlEx 6.501 進(jìn)行，計(jì)算遺傳多樣性指標(biāo)多態(tài)性等位基因數(shù)（Na）、SSR 位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)（Ne）、觀察雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、香農(nóng)多樣性指數(shù)（I）以及固定指數(shù)（F）等。

采用Jaccard 相似系數(shù)，對供試材料的SSR 數(shù)據(jù)應(yīng)用NTSYS-pc 2.10e 軟件進(jìn)行計(jì)算，得到相似系數(shù)矩陣，然后利用UPGMA（Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic Mean）方法進(jìn)行聚類分析，從而構(gòu)建出供試材料基因型間的親緣關(guān)系樹狀圖。

利用PopGen 32 軟件對獲得的供試材料的指紋數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到各熒光SSR 引物多態(tài)性，然后將每對引物獲得的等位基因從小到大按照順序進(jìn)行排序，并對排列的等位基因用阿拉伯?dāng)?shù)字從0開始賦值，對供試材料在7 個SSR 位點(diǎn)獲得的等位基因按照賦值數(shù)字分別進(jìn)行編碼，即可獲得每份供試材料獨(dú)有的字符串。在此基礎(chǔ)上，將每份材料按照相同位點(diǎn)順序排列的編碼字符串利用條碼技術(shù)轉(zhuǎn)化成每份材料獨(dú)特的條碼標(biāo)識，即得到不同材料的分子身份證。

2 結(jié)果與分析

2.1 多態(tài)性分析

16 對熒光SSR 位點(diǎn)的遺傳多樣性進(jìn)行特征分析，結(jié)果如表3 所示。

表3 16 對熒光SSR 位點(diǎn)的遺傳多樣性特征分析

對供試的26 份材料基因組DNA 在16 對熒光SSR 標(biāo)記的位點(diǎn)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，共得到139 個多態(tài)性等位基因，其中，多態(tài)性等位基因數(shù)在5（NH015a）和 11（CH05e03）之間，平均等位基因數(shù)（Na）為7.938，供試樣品在每個熒光SSR 位點(diǎn)產(chǎn)生2 個相同（表現(xiàn)為單峰）或不同（表現(xiàn)為雙峰）的等位基因數(shù)；有效等位基因數(shù)（Ne）在 2.711（GD147）和 6.563（GD142）之間，平均值為 4.123；觀察雜合度（Ho）在 0.654 和 0.962 之間，平均值為 0.802；期望雜合度（He）在0.631 和0.848 之間，平均值為0.743；無偏雜合度期望值（uHe）在 0.644 和 0.864之間，平均值為0.758；香濃多樣性指數(shù)（I）在1.147和1.977 之間，平均值為1.616；固定指數(shù)（F）平均值為 -0.082（表 3）。

2.2 指紋圖譜構(gòu)建

利用篩選出的16 對SSR 熒光引物對26 份供試材料進(jìn)行擴(kuò)增，準(zhǔn)確獲得了不同材料在不同位點(diǎn)的等位基因片段大小以及相應(yīng)的毛細(xì)管電泳圖，即指紋圖譜（圖1）。每對SSR 引物的擴(kuò)增帶型為5～11 個，平均為 7.938 個。26 份蘋果種質(zhì)在 16 對熒光SSR 位點(diǎn)的指紋圖譜互不相同（表4），是各種質(zhì)的特定譜帶，獲得的指紋圖譜可以為種質(zhì)鑒定提供理論依據(jù)。

表4 26 份試材在16 對SSR 位點(diǎn)的指紋圖譜

續(xù)表4

2.3 聚類分析

根據(jù)16 對SSR 熒光標(biāo)記擴(kuò)增26 份蘋果種質(zhì)的標(biāo)記信息計(jì)算不同種質(zhì)間的相似系數(shù)，得到各材料的Jaccard 系數(shù)矩陣，并在此基礎(chǔ)上，利用UPGMA 對供試材料進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建出供試材料基因型間的親緣關(guān)系樹狀圖（圖2）。

26 份供試材料之間的Jaccard 相似系數(shù)分布在0.617 和 1.000 之間，平均值達(dá)到 0.805（表 5），說明各供試材料之間在分子水平上親緣關(guān)系相對較近（圖2）。以相似系數(shù)0.617 為標(biāo)準(zhǔn)，可以明顯分為2 個類群，類群I 為山定子組，只有一個種質(zhì)——山定子；類群II 為蘋果組，包括除山定子以外的其他蘋果栽培品種。以相似系數(shù)0.680 為標(biāo)準(zhǔn)，蘋果栽培品種分為5 類。

表5 26份供試材料相似系數(shù)

2.4 分子身份證的建立

對26 份供試材料在7 對熒光SSR 位點(diǎn)獲得的指紋圖譜數(shù)據(jù)從小到大按順序進(jìn)行排列，并從0 開始用阿拉伯?dāng)?shù)字進(jìn)行賦值，其結(jié)果列于表6。例如，熒光SSR 引物CH01f02 對供試材料進(jìn)行PCR 擴(kuò)增共獲得了10 個等位基因片段，其中，最小的等位基因片段為162 bp，最大的等位基因片段為206 bp，對未獲得等位基因的位點(diǎn)標(biāo)記為-9；先將等位基因片段按照從小到大順序排列，并從0 開始賦值，即將最小等位基因片段162 bp 賦值為0，最大等位基因片段206 bp 賦值為10，這樣即得到了每份材料在熒光SSR 引物CH01f02 獨(dú)有的字符串。以金冠為例，在 7 個熒光 SSR 位點(diǎn) GD142、GD147、GD162、CH01h01、CH01f02、CH02d08 和 CH02d12 獲得的等位基因分別為 142、135、214/233、116/118、170/179、225/225、220/232 bp，其對應(yīng)的賦值分別為 6、4、0/5、3/4、1/9、4/5 和 3/6，按照排列獲得的字符串即為66440534134536。然后再將字符串利用條形碼技術(shù)轉(zhuǎn)化成獨(dú)特的條形碼標(biāo)識即為分子身份證（表7）。

表6 等位基因的賦值標(biāo)準(zhǔn)

表7 供試材料的分子身份證

3 討論

3.1 構(gòu)建分子身份證的意義

種質(zhì)資源是親代傳遞給子代基因的載體，是種質(zhì)創(chuàng)新和培育作物新品種的原始材料。種質(zhì)資源的研究對于種質(zhì)資源的利用效率、作物育種和生產(chǎn)發(fā)展的水平具有一定的意義[20]。在蘋果種質(zhì)資源方面，一方面隨著各地蘋果種質(zhì)資源的頻繁交流，造成了種質(zhì)混雜現(xiàn)象層出不窮；另一方面隨著蘋果新品種的選育和推廣，急需對種質(zhì)資源進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定和保護(hù)。種質(zhì)資源的準(zhǔn)確鑒定為知識產(chǎn)權(quán)的保護(hù)及利用提供了保障。指紋圖譜數(shù)字化后的結(jié)果即為分子身份證，各品種的分子身份證可以通過計(jì)算機(jī)進(jìn)行自動比對，更高效、方便和準(zhǔn)確。另外，分子身份證能夠簡單明了地區(qū)分品種間的差異，可以在大規(guī)模品種比對中廣泛使用。

3.2 遺傳多樣性分析

本研究利用16 對熒光SSR 引物在26 份材料中共擴(kuò)增出139 個多態(tài)性等位基因，多態(tài)性等位基因數(shù)在 5（NH015a）和 11（CH05e03）之間，平均等位基因數(shù)（Na）為7.938；供試樣品在每個熒光SSR 位點(diǎn)產(chǎn)生2 個相同（表現(xiàn)為單峰）或不同（表現(xiàn)為雙峰）的等位基因數(shù)；有效等位基因數(shù)（Ne）在2.711（GD147）和 6.563（GD142）之間，平均值為 4.123；觀察雜合度（Ho）在0.654 和0.962 之間，平均值為0.802；期望雜合度（He）為 0.631～0.848，平均值為0.743；無偏雜合度期望值（uHe）在 0.644 和 0.864之間，平均值為0.758。

一般認(rèn)為，沒有經(jīng)過高強(qiáng)度的人工選擇，遺傳多樣性較高的種群雜合度高于0.5[21]。本研究中，觀察雜合度、期望雜合度和無偏雜合度期望值均高于0.5，說明材料間遺傳多樣性相對較高。固定指數(shù)也稱為近交系數(shù)，是群體中雜合子頻率差異的估計(jì)值，是用來衡量群體是否隨機(jī)交配的重要指標(biāo)，通過雜合子頻率偏差反映群體在某個位點(diǎn)的遺傳分化程度[22]。本研究中，26 份蘋果屬材料在16 對熒光SSR位點(diǎn)檢測固定指數(shù)，平均值為-0.082，結(jié)果顯示，供試材料之間雜合子缺陷度不高，同時也表明Hardy-Weinberg 平衡的偏離程度不大。固定指數(shù)在5 個SSR 位點(diǎn)為正值，說明在一定程度上雜合子缺乏，純合子過量，材料間存在近交現(xiàn)象；在11 個SSR位點(diǎn)為負(fù)值，在位點(diǎn)Ch02d12 雜合頻率最高，表明供試材料在該位點(diǎn)的雜合性較為豐富。

3.3 聚類分析結(jié)果

從分子水平上來說，遺傳相似系數(shù)越小，種質(zhì)間的遺傳分化越大，遺傳多樣性也越高。本研究中，26 份供試材料之間的Jaccard 相似系數(shù)分布在0.617 和1.000 之間，平均值達(dá)到了0.805。相似系數(shù)越大，表明所選品種間的遺傳關(guān)系越近，遺傳多態(tài)性偏低，遺傳基礎(chǔ)相對狹窄。

以相似系數(shù)0.617 為標(biāo)準(zhǔn)，可以明顯分為2 個類群，類群I 為山定子組，只有一個種質(zhì)（山定子）；類群II 為蘋果組，包括除山定子以外的其他25 個蘋果栽培品種。這一結(jié)果僅就山定子和其他蘋果栽培品種來說，山定子和其他蘋果組材料之間遺傳相似系數(shù)相對較低，二者間親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)，另一方面就遺傳相似系數(shù)來說，數(shù)值越大表明親緣關(guān)系越近。本研究結(jié)果在相似系數(shù)0.617 處分為2 個類群，也表明山定子和蘋果組種質(zhì)間的遺傳分化不是太大。山定子為我國蘋果生產(chǎn)中經(jīng)常使用的野生蘋果砧木，與蘋果嫁接親和性高，說明蘋果栽培品種與山定子間嫁接親和性的差異與遺傳信息確實(shí)有關(guān)，從而可以在分子水平上解釋為什么山定子被作為最為常用的蘋果砧木的原因。

以相似系數(shù)0.680 為標(biāo)準(zhǔn)，蘋果栽培品種分為5 類，II-1 組只包括舞美一個品種，其為芭蕾蘋果的一種、蘋果中的極矮化品種，是英國東茂林試驗(yàn)站從威賽克旭（McIntosh wijeik）自然實(shí)生苗中選育的柱型蘋果，與其他普通型蘋果之間親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)；II-2 組只有祝光，其是美國古老品種之一、實(shí)生選種，早熟；II-3 組是蜜脆，其為美國品種，中熟，由Macoun×Honeygold 雜交選育而來。這一結(jié)果進(jìn)一步證明，舞美、祝光和蜜脆與其他蘋果栽培品種之間遺傳距離相對較遠(yuǎn)。II-4 組包括其余的22 個蘋果品種，在II-4 組中分為兩大組，其中，II-4-1 組中以相似系數(shù)0.797 為標(biāo)準(zhǔn)，初秋、旭和王林聚在一起，初秋是從紅玉和金冠的雜交種中選育而來的；旭原產(chǎn)于加拿大，實(shí)生選種；王林是從金冠實(shí)生苗中選育而來的。說明它們之間相對遺傳距離較近。在相似系數(shù)0.781 處，千秋、秋紅嘎拉、宮藤富士、長富1 號、北海道9 號、寒富、國光聚在一組，其中，千秋由東光（金冠×印度）×富士（國光×元帥）雜交而來；秋紅嘎拉是嘎拉（（元帥×桔蘋）×金冠）的芽變；宮藤富士、長富1 號、寒富都是富士（國光×元帥）芽變；北海道9 號是從富士（國光×元帥）×津輕的雜交后代中選育而來的，在這一組中富士系都聚在了一起。以相似系數(shù)0.836 為標(biāo)準(zhǔn)，紅星、元帥、金矮生和青香蕉聚在一起，紅星蘋果為元帥的芽變品種；金矮生是金冠的短枝芽變；青香蕉由實(shí)生選育而來。上述品種中除旭和青香蕉之外都有元帥和金冠的血緣，親緣關(guān)系相對較近，而旭和青香蕉都是古老品種，由實(shí)生選育而來，說明這2 個早期的蘋果實(shí)生品種的來源很相近。II-4-2 組，在相似系數(shù)0.828 處，津輕、金冠、丹霞、喬納金和秦冠聚為一組，其中，津輕為金冠的自然雜交種；丹霞是由金冠實(shí)生苗選育而來，喬納金是金帥（金冠）×紅玉的雜交種；秦冠是從金冠×雞冠的雜交種中選育而來，在這一組中，津輕、丹霞、喬納金和秦冠都含有金冠的血緣，從遺傳學(xué)角度來說更多地保留了金冠的遺傳特性。在相似系數(shù)0.750 處，紅玉、錦玉和中秋聚在一起，紅玉為可口香的實(shí)生后代，原產(chǎn)于美國；錦玉是紅玉的芽變；中秋是紅玉和元帥的雜交種，中秋更多保留了紅玉的遺傳特性；錦玉和中秋都含有紅玉的血緣。因此，紅玉、錦玉和中秋聚在了一起。

從聚類圖中還可以看出，以相似系數(shù)1.000 為標(biāo)準(zhǔn)，金冠和丹霞聚在了一起，丹霞是從金冠實(shí)生苗選育而來的。這一結(jié)果也顯示，二者之間的親緣關(guān)系很近，基本不存在差異。如果想對這些材料進(jìn)行區(qū)分只能增加引物數(shù)量，以進(jìn)一步篩選二者間多態(tài)性的引物，尋找之間的差異。

本研究所用試材的大部分分類結(jié)果與已知蘋果品種間的譜系較為一致，絕大部分系譜相同或相近的品種聚在一起，與HOKANSON 等[23]的試驗(yàn)結(jié)果相近。

4 結(jié)論

本研究以山定子和我國華北地區(qū)種植面積相對較大的25 份蘋果栽培品種為供試材料，在進(jìn)行分子鑒定的基礎(chǔ)上，對供試材料進(jìn)行了遺傳多樣性分析，同時建立了各供試材料的指紋圖譜和分子身份證，在分子水平對山定子作為最常用蘋果砧木進(jìn)行了驗(yàn)證。該研究對于有效地利用和保護(hù)這些種質(zhì)資源具有重要的參考價值，同時也提示育種者在育種工作中要盡量擴(kuò)大選擇范圍，引入新的種質(zhì)，促使種群間的基因交流和重組，以提高后代的品質(zhì)。