• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    富油微藻分離鑒定技術(shù)研究進(jìn)展

    2020-08-12 10:44:36王天強(qiáng)周林宗王紫荊王江鵬王子敬田海燕
    云南化工 2020年7期
    關(guān)鍵詞:微藻污水培養(yǎng)基

    王天強(qiáng),周林宗,王紫荊,王江鵬,王子敬,張 偉,田海燕

    (楚雄師范學(xué)院,云南 楚雄 675000)

    隨著人類社會(huì)、經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,人口數(shù)量的增多,能源需求量也愈來(lái)愈大。煤、石油、天然氣作為不可再生的化石能源,大部分已被開采。能源短缺、急切需要加快尋找綠色清潔能源的步伐。生物柴油是新型清潔能源,不會(huì)像化石燃料一樣面臨枯竭,且燃燒后對(duì)環(huán)境的污染小。目前世界各國(guó)把目光聚集在生物柴油的研發(fā)上,生物柴油勢(shì)必將成為新能源開發(fā)的新趨勢(shì)[1]。

    生物柴油是通過(guò)動(dòng)物、植物體油脂等和醇類在酸或堿催化劑下反應(yīng)得到[2]。傳統(tǒng)油料作物因其產(chǎn)量低、成本高、與農(nóng)作物爭(zhēng)地、受季節(jié)性影響高等缺點(diǎn)不宜大規(guī)模應(yīng)用。微藻是一種生長(zhǎng)在自然水體和土壤中的單細(xì)胞生物,生長(zhǎng)迅速、繁殖快、可以利用污水內(nèi)成分生長(zhǎng),是理想的生物柴油替代品[3]。

    1 微藻研究發(fā)展歷程

    直到目前為止,自從微藻生物能源概念的提出和發(fā)展,微藻已成為污水處理行業(yè)的熱門研究對(duì)象,在微藻工藝、設(shè)備、及機(jī)理方面已有許多成果。

    1)微藻研究發(fā)展歷程。美國(guó)麻省理工學(xué)院的研究學(xué)者于1950年在校園內(nèi)建筑物的屋頂開始進(jìn)行養(yǎng)殖藻類生產(chǎn)生物燃料的試驗(yàn),并在研究中第一次提到微藻生物能源概念;之后,Oswald等1957年提出了利用微藻來(lái)處理污水中的氮磷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[4],這為藻類應(yīng)用于污水處理奠定了基礎(chǔ)。Mcgriff等在1971年提出了“活性藻”的概念,顧名思義,把活性污泥和藻相結(jié)合,然后微藻處理污水的方式便和活性污泥處理污水的方式相同,結(jié)果表明,這種方式可以去除污水中92%的氮和94%的磷[5]。受第一次石油危機(jī)的影響,美國(guó)能源部可再生能源國(guó)家實(shí)驗(yàn)室于1978年啟動(dòng)了水生物種項(xiàng)目研究,該項(xiàng)目歷時(shí)19年、耗資2505萬(wàn)美元,且項(xiàng)目篩選出300余種產(chǎn)油藻種,重點(diǎn)開發(fā)適于微藻生物柴油生產(chǎn)的培養(yǎng)系統(tǒng)和制備工藝。直至20世紀(jì)90年代,日本國(guó)際貿(mào)易和工業(yè)部投資資金25億美元,用于支持 “地球研究更新技術(shù)計(jì)劃”,著力開發(fā)密閉光合生物反應(yīng)器技術(shù),利用微藻吸收火力發(fā)電廠煙氣中的二氧化碳,將之轉(zhuǎn)化為有機(jī)能源生物能源;90年代后期油價(jià)大幅下降,微藻能源研究處于停滯狀態(tài)。21世紀(jì)以來(lái)微藻以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),重新成為研究的熱點(diǎn),并作為污水處理及能源行業(yè)研究的重點(diǎn)。

    2)微藻利用研究。20世紀(jì)50年代以來(lái),國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者證明了微藻是海洋中的主要初級(jí)生產(chǎn)者,是海洋生態(tài)系統(tǒng)和食物鏈的基礎(chǔ),且驅(qū)動(dòng)著整個(gè)海洋生態(tài)系統(tǒng)的能量流動(dòng)和物質(zhì)循環(huán),在海洋生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)中起著不可替代的作用。如Tam等利用小球藻對(duì)模擬生活污水進(jìn)行脫氮除磷處理,結(jié)果表明,懸浮態(tài)小球藻對(duì)氮磷的去除率分別為40%和59%,而固定態(tài)小球藻對(duì)這兩種物質(zhì)的去除率達(dá)到了78%和94%[6]。此外,有研究表明固定化藻類可以回收污水中的重金屬,如Cu2+、Zn2+、Hg2+、Au3+等離子[7]。

    微藻凈化污水具有較好的效果,目前對(duì)微藻凈化污水的機(jī)理的研究也較多,主要從脫氮除磷和吸附重金屬兩方面進(jìn)行研究。污水中的各種含氮化合物是微藻自身生長(zhǎng)繁殖所需的氮源,CO2和碳酸鹽等無(wú)機(jī)物作為碳源,在光照作用下進(jìn)行自養(yǎng)生長(zhǎng),微藻吸收轉(zhuǎn)化后的化學(xué)物質(zhì)用于合成微藻自身的氨基酸、蛋白質(zhì)、其他細(xì)胞結(jié)構(gòu)等[8-9]。

    2005年,隨著生物能源發(fā)展,國(guó)外第一輛采用海藻燃料和大豆油(調(diào)合體積比為1∶9)為能源的示范轎車在印度完成實(shí)驗(yàn),并實(shí)現(xiàn)了1500km的里程,打開微藻生物能源在交通運(yùn)輸中的開端。緊跟腳步,2007年美國(guó)國(guó)際能源公司啟動(dòng)了“海藻變油”的研發(fā)計(jì)劃,通過(guò)海藻的光合作用來(lái)生產(chǎn)可再生柴油和噴氣燃料。而應(yīng)用于航天的生物柴油,也隨著Solazyme等人利用異養(yǎng)法養(yǎng)殖高含油微藻研究變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)。

    3)微藻利用機(jī)理研究。污水中的磷酸鹽可以通過(guò)直接吸收或通過(guò)磷酸化途徑轉(zhuǎn)化成ATP,或者以磷酸鹽的形式沉淀[10]。微藻的培養(yǎng)不僅僅是培養(yǎng)出生長(zhǎng)速度快,環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)的微藻,更重要的是對(duì)微藻工程利用的機(jī)理加以探索,實(shí)現(xiàn)微藻的污水生物處理,體現(xiàn)理想的經(jīng)濟(jì)、環(huán)境和社會(huì)效益。目前對(duì)于微藻的誘變、選育以及產(chǎn)脂性能研究方面關(guān)注度較高,并且成果顯著[11]。

    4)我國(guó)微藻固碳研究與生物能源技術(shù)研究較之國(guó)外起步較晚,但后期厚積爆發(fā),取得不菲的成績(jī)。目前,在高產(chǎn)油藻種的選育與改造、高效微藻光反應(yīng)器、高密度培養(yǎng)、高效加工等技術(shù)研究[12]方面有了顯著進(jìn)步。

    目前,微藻在分子生物學(xué)研究、污水處理工藝研究、脂肪積累機(jī)理等研究方面關(guān)注度較高,研究成果豐富。但是隨著環(huán)境問題的突出,是否導(dǎo)致微藻資源的變化,如種類和數(shù)量方面的變化,該方向值得深入研究。另一方面微藻資源的調(diào)查分析與種質(zhì)資源保存方面研究具有重大意義,種質(zhì)資源的保存有助于我們了解環(huán)境變化對(duì)生物的影響,為未來(lái)微藻研究積累資源。

    2 微藻分離技術(shù)及流程

    微藻分離指的是通過(guò)環(huán)境取樣,采集含有微藻的樣品(如水樣、土壤樣品等),通過(guò)適宜的培養(yǎng)基,經(jīng)過(guò)前期微藻富集增加微藻數(shù)量,再進(jìn)行微藻的分離工作,最終獲得純種微藻的過(guò)程。

    2.1 微藻樣品采集

    微藻種類繁多,適用能力極強(qiáng),水環(huán)境中的淡水和咸水,以及土壤環(huán)境(一般土壤和沙漠土壤)均有微藻的分布,不同環(huán)境內(nèi)微藻樣品采集方式有所差異。

    1)水環(huán)境微藻樣品的采集。淡水環(huán)境微藻水樣采集常用分層取樣的形式,采用水質(zhì)取樣器采集不同深度水樣,水樣采集后存放于無(wú)菌采樣瓶中[13],現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定溫度等部分水樣常規(guī)指標(biāo),其他指標(biāo)帶回實(shí)驗(yàn)室測(cè)定。海水樣品的采集主要指海洋水樣的采集,采集后置于采樣瓶中帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)[14]。水環(huán)境樣品采集時(shí)除了采集水樣外,水體沉積物也需進(jìn)行采樣,如湖泊沉積物、海洋底泥等,用采樣鏟子將樣品標(biāo)本收集于取樣袋內(nèi),帶回進(jìn)行微藻的分離培養(yǎng)。

    2)土壤環(huán)境微藻樣品的采集。選取環(huán)境中含微藻的取樣點(diǎn),用鏟子小心采集土壤表面層及其至10cm深處土壤,沙漠土壤樣品采集帶回實(shí)驗(yàn)室后直接用于后續(xù)分離培養(yǎng)試驗(yàn)[15],收集于密封袋中帶回實(shí)驗(yàn)室的樣品,可在黑暗、室溫條件下保存[16]。

    2.2 微藻培養(yǎng)基選擇

    由于采集帶回實(shí)驗(yàn)室的樣品內(nèi)含有多種微生物,如細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物等,快速、定向富集微藻需要優(yōu)選適宜的培養(yǎng)基,常見的培養(yǎng)基有SE培養(yǎng)基、BG11培養(yǎng)基、f/2培養(yǎng)基、D1培養(yǎng)基、BBM培養(yǎng)基、TAP培養(yǎng)基和MA培養(yǎng)基,各培養(yǎng)基用途及適宜微藻類型如表1。

    表1 微藻分離常用培養(yǎng)基

    培養(yǎng)基為微藻的生長(zhǎng)提供碳源、氮源、水和各類無(wú)機(jī)生長(zhǎng)因子,因此在對(duì)未知微藻進(jìn)行分離培養(yǎng)時(shí),可對(duì)培養(yǎng)基的成分進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整,以適應(yīng)微藻研究需求。

    這種突破性貢獻(xiàn),也讓她個(gè)人取得無(wú)上殊榮——成為人類歷史上第一個(gè)兩度獲得諾貝爾獎(jiǎng)的人,各種獎(jiǎng)金與頭銜更是不勝枚舉。

    2.3 微藻富集過(guò)程

    微藻富集指的是利用適宜培養(yǎng)基,將采集微藻樣品接種于培養(yǎng)基內(nèi),一方面快速增加微藻數(shù)量,另一方面抑制其他生物的生長(zhǎng)。常見加速富集速率的方法有樣品預(yù)處理、培養(yǎng)基的優(yōu)化[21]、抑菌方案的篩選[22]和培養(yǎng)條件設(shè)計(jì)。

    采集回實(shí)驗(yàn)室的樣品首先進(jìn)行微藻的顯微鏡檢測(cè),若微藻數(shù)量較高,則直接進(jìn)行微藻分離,否則將采取富集培養(yǎng)的方式。在富集培養(yǎng)之前,需對(duì)水樣進(jìn)行預(yù)處理,如去除大的砂石和土壤顆粒、水樣進(jìn)行初步過(guò)濾,去除非目標(biāo)生物等。

    培養(yǎng)基優(yōu)化,淡水培養(yǎng)基常用BG11和SE,但是培養(yǎng)基的pH值和培養(yǎng)條件可進(jìn)行優(yōu)化,甚至可在培養(yǎng)基內(nèi)加入土壤浸提液或者原位滅菌的水樣。如響應(yīng)曲面法優(yōu)化后的BG11培養(yǎng)基適宜于養(yǎng)豬廢水內(nèi)刺鏈帶藻的生長(zhǎng)[23],研究學(xué)者優(yōu)化后的培養(yǎng)基可作為微藻富集分離培養(yǎng)基。

    抑菌方案的設(shè)計(jì),抑菌方案主要通過(guò)培養(yǎng)基設(shè)計(jì),如培養(yǎng)基內(nèi)缺少C源且光照培養(yǎng)可定向培養(yǎng)光能自養(yǎng)微藻,進(jìn)行黑暗培養(yǎng)條件下培養(yǎng)能夠篩選異養(yǎng)生長(zhǎng)的微藻,寡異養(yǎng)培養(yǎng)基可抑制大部分微生物的生長(zhǎng),加入抗生素可抑制微生物的同時(shí)定向篩選微藻[22]。

    微藻培養(yǎng)條件的不同,將微藻培養(yǎng)方式分為光照培養(yǎng)和黑暗培養(yǎng),不同微藻的生長(zhǎng)類型不同,需要進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整。常見微藻培養(yǎng)條件為21~25℃、光暗周期為 12h,如月牙藻[24]、小球藻[25]和柵藻[26]等的培養(yǎng)。除此以外,光暗比 14∶10 h、16∶8 h、全光照和無(wú)光照[22]等條件也在微藻篩選中被應(yīng)用。培養(yǎng)至富集微藻液體顏色發(fā)生顯著變化時(shí),取部分樣品進(jìn)行顯微鏡檢測(cè),目標(biāo)微藻成為優(yōu)勢(shì)藻并且達(dá)到分離濃度即可進(jìn)入下一步微藻分離的過(guò)程。

    2.4 微藻分離技術(shù)

    2.4.1 平板分離技術(shù)

    微藻培養(yǎng)過(guò)程中若改變pH條件,以及減小凝固劑對(duì)微藻的影響,可將瓊脂換為結(jié)冷膠,以提高純化效果。另外,在純化過(guò)程中,為了適用不同微藻類群,也可采取半固體培養(yǎng)基進(jìn)行微藻的分離試驗(yàn)。

    2.4.2 細(xì)胞培養(yǎng)板分離技術(shù)

    該方法原理為稀釋分離法,將微藻富集液稀釋至適宜濃度,直至每一份樣品內(nèi)僅含有單個(gè)微藻細(xì)胞時(shí),對(duì)單個(gè)微藻細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。如微藻細(xì)胞培養(yǎng)板分離技術(shù),該方法將富集藻液進(jìn)行稀釋,稀釋至1~10滴稀釋液內(nèi)僅含有一個(gè)微藻細(xì)胞為止,然后在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板每個(gè)培養(yǎng)孔內(nèi)加入1滴稀釋液,并再加入無(wú)菌培養(yǎng)液,放置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),培養(yǎng)7d后用倒置顯微鏡觀察微藻生長(zhǎng)情況,用無(wú)菌滴管吸出藻液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),即可獲得純種微藻藻株。

    2.4.3 單細(xì)胞吸取技術(shù)

    該方法通過(guò)一定的儀器和設(shè)備直接取出富集液內(nèi)的特定微藻細(xì)胞,對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行獨(dú)立培養(yǎng),常見的有顯微操作技術(shù),流式細(xì)胞儀技術(shù)。顯微操作技術(shù)指的是在顯微鏡下找到單個(gè)的微藻細(xì)胞,用毛細(xì)管玻璃針吸取單個(gè)細(xì)胞,放于培養(yǎng)液內(nèi)單獨(dú)培養(yǎng),該方法可快速獲取純種微藻細(xì)胞。

    流式細(xì)胞儀輔助技術(shù)可以對(duì)細(xì)胞快速檢測(cè)、識(shí)別與分選,通過(guò)前期對(duì)微藻的富集培養(yǎng),提高微藻數(shù)量,然后采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行微藻種類的檢測(cè),并實(shí)現(xiàn)定向高效分選微藻,獲得純種微藻藻株。

    3 微藻鑒定技術(shù)

    3.1 形態(tài)鑒定

    前期分離的純種微藻,用接種針挑取少量于載玻片上,加蓋玻片后顯微鏡觀察,在高倍鏡下記錄其顯微形態(tài)與顏色。微藻顯微鏡觀察前可采用魯格氏液固定[27]、結(jié)晶紫染色[28]等方式讓微藻形態(tài)更為明顯。根據(jù)觀察到的形態(tài),參考《中國(guó)淡水藻類-系統(tǒng)、分類及生態(tài)》對(duì)微藻進(jìn)行初步分類鑒定。此外可配合掃描電鏡對(duì)微藻細(xì)胞表面形態(tài)進(jìn)行觀察,加強(qiáng)顯微鑒定的準(zhǔn)確性。

    3.2 分子鑒定

    分子鑒定技術(shù)通過(guò)對(duì)微藻的18 SrDNA測(cè)序和比對(duì),實(shí)現(xiàn)種群的鑒定。具體操作方法為:首先將純種高濃度藻液離心收集微藻細(xì)胞,采用CTAB、試劑盒等法提取微藻DNA,獲得高純度DNA;其次對(duì)微藻18sr DNA設(shè)計(jì)引物[28],設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)腜CR反應(yīng)程序,對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行擴(kuò)增;擴(kuò)增片段的測(cè)序,由序列測(cè)序公司完成(如上海生工、華大基因等);測(cè)序完成片段去除兩段無(wú)效片段,將中間片段輸入NCBI內(nèi)進(jìn)行比對(duì),選取相似性較高的數(shù)據(jù)庫(kù)已知微藻DNA序列,與目標(biāo)序列采用MEGA等軟件進(jìn)行聚類分析,分析目標(biāo)微藻的種群聚類,最終實(shí)現(xiàn)微藻的鑒定,若相似性低于97%,則可判斷為新種微藻[28]。

    4 富油微藻篩選技術(shù)

    分離鑒定的微藻需快速檢測(cè)其油脂含量,或者從大批量微藻中篩選出富油微藻,采用尼羅紅染色是較為迅速的檢測(cè)手段,使用尼羅紅對(duì)微藻進(jìn)行染色,以三油精為標(biāo)準(zhǔn)品,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,480nm為激發(fā)波長(zhǎng),580nm為吸收波長(zhǎng)測(cè)定熒光值,根據(jù)熒光值測(cè)定油脂含量[28],快速篩選富油微藻的尼羅紅染色法、是一種很好的初級(jí)篩選方法。此外,總脂含量的索氏提取測(cè)定方法[29]、乙酸乙酯/正己烷混合溶劑萃取法[30],脂肪酸的 GCMs測(cè)定方法[31]均能夠?qū)ξ⒃逵椭瑱z測(cè),實(shí)現(xiàn)富油微藻的篩選。通過(guò)藻種比生長(zhǎng)速率、生物量以及油脂含量的測(cè)定,建立了優(yōu)良藻種的綜合評(píng)價(jià)方法[32]。

    5 微藻發(fā)展趨勢(shì)

    隨著國(guó)內(nèi)化石燃料的大量消耗,生物柴油,尤其是微藻生物能源的開發(fā)異常迅速。目前對(duì)微藻的開發(fā)主要集中在富油微藻的篩選與育種、微藻生物柴油的工業(yè)生產(chǎn)與開發(fā)。在前期微藻篩選階段,由于自然環(huán)境微藻資源的豐富性,每年都有新種微藻被發(fā)現(xiàn),甚至部分微藻在人工培養(yǎng)條件下難以獲得純種的藻株。因此,開發(fā)新的微藻篩選工藝、新的微藻培養(yǎng)方法、新的微藻保存措施等可有效加速微藻資源的探索與開發(fā)。甚至通過(guò)微藻資源的調(diào)查,將微藻在生物能源、食品、醫(yī)療、化妝品、化工等等諸多領(lǐng)域開拓。

    猜你喜歡
    微藻污水培養(yǎng)基
    什么是核污水
    處理污水
    代食品運(yùn)動(dòng)中微藻的科研與生產(chǎn)
    污水的自述
    小讀者(2019年20期)2020-01-04 02:13:58
    污水罐坍塌
    南方周末(2019-12-05)2019-12-05 11:17:43
    絮凝法采收生物燃料微藻的研究進(jìn)展
    蛹蟲草液體發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選
    各種培養(yǎng)基制作應(yīng)注意的幾個(gè)事項(xiàng)
    KBM581培養(yǎng)基:人T細(xì)胞誘導(dǎo)與擴(kuò)增培養(yǎng)基應(yīng)用指南
    茯磚茶中優(yōu)勢(shì)微生物在不同培養(yǎng)基的差異性比較
    十分钟在线观看高清视频www | 人妻系列 视频| 亚洲精品国产成人久久av| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 国产淫片久久久久久久久| 亚洲精品国产色婷婷电影| 日本wwww免费看| 欧美日韩综合久久久久久| av视频免费观看在线观看| 亚洲精品456在线播放app| 国产精品久久久久成人av| 天堂8中文在线网| 十分钟在线观看高清视频www | 一区在线观看完整版| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 中文字幕免费在线视频6| av女优亚洲男人天堂| 国精品久久久久久国模美| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 边亲边吃奶的免费视频| 国产黄片美女视频| 午夜免费观看性视频| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 亚洲四区av| 久久久久人妻精品一区果冻| 精品久久久久久电影网| 国产黄色免费在线视频| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 久久久精品免费免费高清| 国产爽快片一区二区三区| 亚洲精品日本国产第一区| 成人特级av手机在线观看| 亚洲欧洲国产日韩| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国产在线视频一区二区| 日本欧美视频一区| 亚洲图色成人| 国产精品久久久久久久久免| 丝袜脚勾引网站| 一区二区三区乱码不卡18| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 成人国产av品久久久| 成人亚洲精品一区在线观看| 久久狼人影院| 久久久久久久久久久丰满| 国产淫片久久久久久久久| 国精品久久久久久国模美| 黑人猛操日本美女一级片| 免费观看a级毛片全部| 亚洲一区二区三区欧美精品| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 秋霞伦理黄片| 亚洲不卡免费看| 亚洲精品成人av观看孕妇| 美女cb高潮喷水在线观看| 久久6这里有精品| 丰满迷人的少妇在线观看| 久久久久视频综合| 久久久久精品久久久久真实原创| 男女啪啪激烈高潮av片| 国产免费福利视频在线观看| 国产高清不卡午夜福利| 国产一区二区三区综合在线观看 | 欧美日韩视频精品一区| 91久久精品电影网| 国产高清不卡午夜福利| 天堂中文最新版在线下载| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 老女人水多毛片| 亚洲精品国产av蜜桃| 韩国av在线不卡| 欧美日韩av久久| 春色校园在线视频观看| 久久韩国三级中文字幕| 丰满迷人的少妇在线观看| 高清av免费在线| 国产亚洲91精品色在线| 亚洲av成人精品一二三区| 一区二区三区精品91| 亚洲第一区二区三区不卡| 伦理电影大哥的女人| 一个人看视频在线观看www免费| 国产精品国产av在线观看| 国产色婷婷99| videos熟女内射| 极品少妇高潮喷水抽搐| 纯流量卡能插随身wifi吗| 亚洲av综合色区一区| 一级黄片播放器| 国产黄色视频一区二区在线观看| 亚洲av免费高清在线观看| av女优亚洲男人天堂| 乱系列少妇在线播放| 国产黄色视频一区二区在线观看| 欧美日韩av久久| 国产 精品1| 99热6这里只有精品| 欧美xxxx性猛交bbbb| 一级黄片播放器| 免费看av在线观看网站| 国产精品久久久久久精品古装| 欧美xxxx性猛交bbbb| 免费看av在线观看网站| 久热久热在线精品观看| 晚上一个人看的免费电影| 欧美日韩亚洲高清精品| 成年av动漫网址| 国产日韩欧美亚洲二区| 熟妇人妻不卡中文字幕| 国产在线一区二区三区精| 一级爰片在线观看| 午夜视频国产福利| 尾随美女入室| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 看十八女毛片水多多多| av天堂中文字幕网| 国产精品久久久久久久电影| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 国产成人午夜福利电影在线观看| 97超碰精品成人国产| 亚洲性久久影院| 免费大片黄手机在线观看| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 亚洲欧美精品专区久久| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 777米奇影视久久| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产亚洲91精品色在线| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 另类精品久久| 三级国产精品片| 国产日韩欧美视频二区| 亚洲精品成人av观看孕妇| 亚洲精品456在线播放app| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产91av在线免费观看| 九九爱精品视频在线观看| 熟妇人妻不卡中文字幕| 久久精品国产亚洲av天美| 九九爱精品视频在线观看| 又爽又黄a免费视频| 观看免费一级毛片| 丝袜喷水一区| 夜夜爽夜夜爽视频| 两个人免费观看高清视频 | 99热国产这里只有精品6| 国产真实伦视频高清在线观看| 一级,二级,三级黄色视频| 这个男人来自地球电影免费观看 | 亚洲国产色片| 国产成人aa在线观看| 国模一区二区三区四区视频| 能在线免费看毛片的网站| 亚洲欧美清纯卡通| 国产亚洲精品久久久com| 亚洲av免费高清在线观看| 国内精品宾馆在线| 最近的中文字幕免费完整| 97精品久久久久久久久久精品| 亚洲国产成人一精品久久久| 一级av片app| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 亚洲三级黄色毛片| 日韩欧美一区视频在线观看 | 亚洲精品国产色婷婷电影| 一级二级三级毛片免费看| 日韩成人av中文字幕在线观看| 国产av国产精品国产| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 老司机亚洲免费影院| 日本欧美国产在线视频| 国产精品99久久99久久久不卡 | 国产亚洲5aaaaa淫片| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 日韩三级伦理在线观看| 大片电影免费在线观看免费| 亚洲精品国产色婷婷电影| 久久 成人 亚洲| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 国产有黄有色有爽视频| 三级国产精品欧美在线观看| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 日本午夜av视频| 少妇人妻久久综合中文| 亚洲国产欧美在线一区| 多毛熟女@视频| 91在线精品国自产拍蜜月| 99九九在线精品视频 | 国产成人午夜福利电影在线观看| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | av在线观看视频网站免费| 久久久久精品久久久久真实原创| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 成人影院久久| 六月丁香七月| 熟女人妻精品中文字幕| 久热久热在线精品观看| 国产伦在线观看视频一区| 国产午夜精品一二区理论片| 久久久久国产网址| 边亲边吃奶的免费视频| 99热国产这里只有精品6| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 91精品伊人久久大香线蕉| 欧美xxxx性猛交bbbb| 亚洲精品一区蜜桃| 尾随美女入室| 制服丝袜香蕉在线| 婷婷色麻豆天堂久久| 一级毛片 在线播放| 综合色丁香网| 乱系列少妇在线播放| 久久久久久久久久久丰满| 黄色一级大片看看| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 成人黄色视频免费在线看| 日韩中字成人| 大片电影免费在线观看免费| 免费观看性生交大片5| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 亚洲精品国产av蜜桃| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 亚洲第一区二区三区不卡| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 成人特级av手机在线观看| 国产黄片视频在线免费观看| 五月天丁香电影| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 久久久久久久亚洲中文字幕| 亚洲久久久国产精品| 99精国产麻豆久久婷婷| 日韩av在线免费看完整版不卡| 26uuu在线亚洲综合色| 亚洲av福利一区| 大片免费播放器 马上看| 黄色视频在线播放观看不卡| 亚洲av在线观看美女高潮| a级片在线免费高清观看视频| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 免费高清在线观看视频在线观看| 久久久久久伊人网av| 嫩草影院入口| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 伊人久久国产一区二区| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 99精国产麻豆久久婷婷| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 男男h啪啪无遮挡| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 热re99久久精品国产66热6| 美女中出高潮动态图| 精品酒店卫生间| 亚洲真实伦在线观看| 亚洲内射少妇av| 在线观看免费高清a一片| 国产69精品久久久久777片| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 一区二区av电影网| 嫩草影院新地址| 久久久久久人妻| 五月开心婷婷网| 美女主播在线视频| a级毛片免费高清观看在线播放| 免费观看的影片在线观看| 99久久人妻综合| 十八禁网站网址无遮挡 | 我要看黄色一级片免费的| 国产精品伦人一区二区| 国产淫语在线视频| 国产av精品麻豆| 国产欧美日韩综合在线一区二区 | 美女福利国产在线| 性色av一级| 在线观看一区二区三区激情| 亚洲av二区三区四区| 久久久久精品久久久久真实原创| 9色porny在线观看| 99热6这里只有精品| 国产乱人偷精品视频| 成人综合一区亚洲| 波野结衣二区三区在线| 国产又色又爽无遮挡免| 人妻夜夜爽99麻豆av| 色94色欧美一区二区| 22中文网久久字幕| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 免费观看性生交大片5| 麻豆乱淫一区二区| 国产日韩欧美在线精品| 波野结衣二区三区在线| 黄片无遮挡物在线观看| 一级毛片电影观看| 国产片特级美女逼逼视频| 又爽又黄a免费视频| 国产在线视频一区二区| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 七月丁香在线播放| av国产精品久久久久影院| 狂野欧美激情性bbbbbb| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 少妇人妻 视频| 久久青草综合色| 成人二区视频| 性高湖久久久久久久久免费观看| 精品一区二区免费观看| 免费观看性生交大片5| 99热全是精品| 久热这里只有精品99| 成人亚洲精品一区在线观看| av免费观看日本| av又黄又爽大尺度在线免费看| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 在线观看www视频免费| 亚洲人成网站在线观看播放| 一级,二级,三级黄色视频| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| av不卡在线播放| 久久精品国产a三级三级三级| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 一级毛片我不卡| 91精品国产九色| 国产毛片在线视频| 亚洲精品,欧美精品| av天堂久久9| 丝袜脚勾引网站| 亚洲第一av免费看| 99视频精品全部免费 在线| 草草在线视频免费看| 久久97久久精品| 色视频www国产| 色5月婷婷丁香| freevideosex欧美| 我要看日韩黄色一级片| 欧美xxxx性猛交bbbb| 97超碰精品成人国产| 日韩一本色道免费dvd| 大片电影免费在线观看免费| 亚洲av免费高清在线观看| 国产乱人偷精品视频| 亚洲av二区三区四区| 十分钟在线观看高清视频www | 亚洲四区av| 国产色婷婷99| 我的老师免费观看完整版| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 男男h啪啪无遮挡| 亚洲国产欧美日韩在线播放 | 夫妻午夜视频| 少妇 在线观看| 久热这里只有精品99| av.在线天堂| 亚洲精品乱久久久久久| 国产av国产精品国产| 精品亚洲成a人片在线观看| 老司机影院毛片| 少妇人妻 视频| av卡一久久| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 中文资源天堂在线| 国产精品偷伦视频观看了| 午夜免费鲁丝| 亚洲人成网站在线播| 国产高清不卡午夜福利| 国产一区二区在线观看av| 卡戴珊不雅视频在线播放| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 免费少妇av软件| 交换朋友夫妻互换小说| 中国国产av一级| 国产精品国产三级国产专区5o| 熟女av电影| 欧美日韩视频精品一区| 亚洲,一卡二卡三卡| 51国产日韩欧美| 久久久精品免费免费高清| 国产 一区精品| 精品少妇内射三级| 午夜视频国产福利| 精品国产露脸久久av麻豆| 日本wwww免费看| 色婷婷久久久亚洲欧美| 久久这里有精品视频免费| 久久久亚洲精品成人影院| 成人漫画全彩无遮挡| 在线观看www视频免费| 国产在线免费精品| 又大又黄又爽视频免费| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 少妇人妻一区二区三区视频| 色哟哟·www| 精品一区二区三区视频在线| 日韩一区二区视频免费看| 国产成人精品无人区| 欧美性感艳星| 美女视频免费永久观看网站| 久久精品国产亚洲av涩爱| 99久久精品热视频| 日韩免费高清中文字幕av| 久久狼人影院| 国产精品无大码| 91久久精品国产一区二区成人| 久久久久久人妻| 久久鲁丝午夜福利片| 精品久久久久久久久亚洲| 美女内射精品一级片tv| av在线老鸭窝| 久久免费观看电影| 在线观看国产h片| 中文字幕制服av| 亚洲电影在线观看av| 高清av免费在线| 人妻人人澡人人爽人人| 国产色爽女视频免费观看| 亚洲精品aⅴ在线观看| 亚洲国产精品一区三区| 自线自在国产av| av网站免费在线观看视频| 亚洲国产精品一区三区| 18禁动态无遮挡网站| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 草草在线视频免费看| 亚洲精品日本国产第一区| 80岁老熟妇乱子伦牲交| freevideosex欧美| 天美传媒精品一区二区| 新久久久久国产一级毛片| 三级国产精品欧美在线观看| √禁漫天堂资源中文www| 亚洲精品456在线播放app| 亚洲成人av在线免费| 在线观看三级黄色| 韩国av在线不卡| 久久鲁丝午夜福利片| 亚洲国产精品专区欧美| av不卡在线播放| 少妇的逼水好多| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 高清视频免费观看一区二区| 99热国产这里只有精品6| 亚洲四区av| 亚洲丝袜综合中文字幕| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 校园人妻丝袜中文字幕| 欧美成人午夜免费资源| 永久免费av网站大全| 国产av国产精品国产| 成人美女网站在线观看视频| a级毛片在线看网站| 日韩强制内射视频| 中文字幕亚洲精品专区| 亚洲成人av在线免费| 日韩强制内射视频| 内地一区二区视频在线| 久久人妻熟女aⅴ| 久久ye,这里只有精品| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 秋霞在线观看毛片| 老女人水多毛片| 最新的欧美精品一区二区| 亚洲综合精品二区| 内射极品少妇av片p| 七月丁香在线播放| 久久精品国产亚洲网站| 国产av码专区亚洲av| 在线观看美女被高潮喷水网站| 亚洲不卡免费看| 亚洲av欧美aⅴ国产| av卡一久久| 日韩在线高清观看一区二区三区| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 黄色视频在线播放观看不卡| 国产在线免费精品| 欧美少妇被猛烈插入视频| 亚洲国产欧美日韩在线播放 | 午夜激情久久久久久久| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 精品熟女少妇av免费看| 视频中文字幕在线观看| 赤兔流量卡办理| 一级片'在线观看视频| 亚洲国产成人一精品久久久| 免费观看在线日韩| 青青草视频在线视频观看| 涩涩av久久男人的天堂| 亚洲熟女精品中文字幕| 热99国产精品久久久久久7| 亚洲,欧美,日韩| 午夜激情久久久久久久| 亚洲人成网站在线播| 一区在线观看完整版| 日韩 亚洲 欧美在线| 三级经典国产精品| 成人漫画全彩无遮挡| 精品久久久噜噜| 日韩制服骚丝袜av| 色视频www国产| 伊人亚洲综合成人网| 老司机亚洲免费影院| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 嫩草影院新地址| 亚洲性久久影院| 成人特级av手机在线观看| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 国产一区二区在线观看日韩| 在线免费观看不下载黄p国产| 欧美最新免费一区二区三区| 在线观看美女被高潮喷水网站| 老女人水多毛片| 国产极品粉嫩免费观看在线 | 婷婷色综合大香蕉| 国产精品99久久99久久久不卡 | 中文字幕av电影在线播放| 人妻 亚洲 视频| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 天堂俺去俺来也www色官网| 亚洲第一区二区三区不卡| 男男h啪啪无遮挡| 在线精品无人区一区二区三| 成人特级av手机在线观看| 在线观看一区二区三区激情| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 狂野欧美激情性bbbbbb| 寂寞人妻少妇视频99o| 大片免费播放器 马上看| 九草在线视频观看| 9色porny在线观看| 国产伦精品一区二区三区四那| 亚洲伊人久久精品综合| 特大巨黑吊av在线直播| 亚洲av中文av极速乱| 黄色视频在线播放观看不卡| 亚洲av日韩在线播放| 一级毛片电影观看| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 国产黄色视频一区二区在线观看| 永久网站在线| 亚洲国产最新在线播放| 国产黄片美女视频| 国产免费视频播放在线视频| 欧美日本中文国产一区发布| 青青草视频在线视频观看| 国产精品不卡视频一区二区| 多毛熟女@视频| 99久久精品一区二区三区| 大片电影免费在线观看免费| 在线观看人妻少妇| 国产成人免费观看mmmm| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 精品国产乱码久久久久久小说| 国产精品久久久久久精品古装| 男女啪啪激烈高潮av片| 国产精品99久久99久久久不卡 | av不卡在线播放| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 好男人视频免费观看在线| 伦理电影大哥的女人| 久久97久久精品| 亚洲国产日韩一区二区| 天美传媒精品一区二区| 99re6热这里在线精品视频| 天堂8中文在线网| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 美女内射精品一级片tv| 最近中文字幕2019免费版| 久久久久网色| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 晚上一个人看的免费电影| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 99热这里只有精品一区| 精品久久久久久电影网| videos熟女内射| 十分钟在线观看高清视频www | 亚洲国产日韩一区二区| 久久 成人 亚洲| 国产熟女欧美一区二区| 国产精品一区www在线观看| 男的添女的下面高潮视频| 日本黄色片子视频| 国产伦精品一区二区三区视频9| 中文字幕免费在线视频6| 日韩中字成人| 国产爽快片一区二区三区| 国产伦精品一区二区三区视频9| 高清毛片免费看| 色婷婷av一区二区三区视频| 精品亚洲成国产av| 777米奇影视久久| 欧美97在线视频| 国产精品三级大全| 国产av一区二区精品久久| 欧美国产精品一级二级三级 | 精品一区二区免费观看| 免费黄频网站在线观看国产| 少妇的逼好多水| 久久亚洲国产成人精品v| 久久97久久精品| 插逼视频在线观看| 久久久久精品性色| 国产精品成人在线| 九九爱精品视频在线观看| 国产伦精品一区二区三区视频9| 成人二区视频| 街头女战士在线观看网站| 日韩一区二区三区影片| 街头女战士在线观看网站| 亚洲国产精品国产精品| 国产精品国产三级国产av玫瑰|