蛤蚧不同炮制品的抗疲勞作用研究

黃馨慧，熊桂玉，劉舒凌*，王曉珊，張 兵，朱明鳳

(1.廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院，廣西 南寧 530021；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001)

蛤蚧為壁虎科動物蛤蚧GekkogeckoLinnaeus除去內(nèi)臟的干燥體，其性平味咸，歸肺、腎經(jīng)，具有補(bǔ)肺益腎、納氣定喘、助陽益精的功效，常用于肺氣不足、虛喘氣促、勞嗽咳血、陽痿的治療[1]。近年來蛤蚧研究多集中于補(bǔ)腎壯陽、抗腫瘤等藥理研究，并發(fā)現(xiàn)蛤蚧可以增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抑制腫瘤細(xì)胞生長、促進(jìn)造血功能、清除機(jī)體內(nèi)的自由基[2]，而對蛤蚧及其不同炮制品的抗疲勞作用的研究較少。蛤蚧不同炮制品是否均有抗疲勞作用，不同炮制品的抗疲勞作用是否有區(qū)別，目前尚無文獻(xiàn)報道。本課題擬研究蛤蚧不同炮制品(生品、酒制品、油酥制品、蛤粉制品)的抗疲勞作用，以期為蛤蚧炮制品的臨床合理應(yīng)用，以及闡明其炮制原理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級昆明種小白鼠，雄性，體質(zhì)量18～22 g，購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，許可證號SCXK(湘)2016-0002。

1.2 藥物與試劑

蛤蚧購于安徽亳州中藥材市場，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室樊蘭蘭副研究員鑒定為壁虎科動物蛤蚧(GekkogeckoLinnaeus)的干燥藥材。金匱腎氣丸(北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠，18030641)；會稽山紹興花雕酒特醇紹興花雕酒(會稽山紹興酒股份有限公司，20161117)；金龍魚芝麻油(益海嘉里(武漢)糧油工業(yè)有限公司，LH20160122)；蛤粉(廣西仙茱中藥科技有限公司，20170620)；乳酸測試盒(南京建成生物工程研究所，20190305)；尿素檢測試劑盒(寧波瑞源生物科技有限公司，2019012901)；肝/肌糖原試劑盒(南京建成生物工程研究所，20190511)。

1.3 儀器與設(shè)備

高速中藥粉碎機(jī)(瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司，111B)；小型臺式高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf，5430 R)；電子天平(德國賽多利斯公司，BP211D)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海齊欣儀科學(xué)儀器有限公司，DHG-9140A)；電炒鍋(廣西柳州龍騰電器廠，LT-116)；全自動生化儀(羅氏集團(tuán)，P800型)；紫外可見分光光度計(美國安捷倫公司，Aglient8453)。

2 方法

2.1 樣品制備

蛤蚧樣品制備：取干燥蛤蚧除去鱗片、足，齊眼處切去頭，切成大小均勻的小塊。酒蛤蚧樣品制備：取凈蛤蚧塊用黃酒浸潤后，加熱烘烤至外表微黃時，取出放涼，每100 g蛤蚧，用黃酒20 g[3]。油酥蛤蚧樣品制備：取凈蛤蚧，涂以麻油，烘至稍黃質(zhì)脆，去頭(齊眼處切除)、足及鱗片，切成小塊[4]。蛤粉炒蛤蚧樣品制備：取凈蛤蚧塊，照蛤粉燙制法，燙至黃色，質(zhì)酥脆，取出，篩去蛤粉[5]。將以上各炮制品分別打粉，過60目篩，貯存于4 ℃冰箱備用，使用前用生理鹽水配成相應(yīng)濃度。

2.2 動物分組、給藥及篩選

小鼠按體重隨機(jī)分為6組，即空白組、陽性組、蛤蚧組、酒蛤蚧組、油酥蛤蚧組、蛤粉制蛤蚧組。陽性組(金匱腎氣丸)給藥劑量1.3 g/kg，蛤蚧組、酒蛤蚧組、油酥蛤蚧組、蛤粉制蛤蚧組的給藥劑量為1.2 g/kg，小鼠灌胃體積是0.2 mL/10 g/只，空白組灌胃等體積蒸餾水，每天灌胃1次，灌胃給藥21 d。在給藥期間，小鼠每周進(jìn)行1～2次適應(yīng)性游泳訓(xùn)練，剔除不會游泳的小鼠。各組篩選出游泳訓(xùn)練合格小鼠進(jìn)入下一步實(shí)驗(yàn)。

2.3 小鼠負(fù)重力歇游泳時間測定

取小鼠72只，分組、給藥及篩選參照“2.2”項。末次給藥30 min后，在小鼠尾巴上負(fù)荷其體重7%的鉛絲，放入裝有水溫(25±2) ℃、水深40～50 cm的大鐵桶中進(jìn)行負(fù)重力竭游泳。記錄小鼠游泳開始至完全沉入水中10 s仍不能沖出水面的時間，即為負(fù)重力歇游泳時間。

2.4 小鼠游泳后血清乳酸含量測定

取小鼠72只，分組、給藥及篩選參照“2.2”項。末次給藥30 min后，將小鼠放入裝有水溫(25±2)℃、水深40～50 cm的大鐵桶中進(jìn)行無負(fù)重游泳10 min，取出后立即用干毛巾擦干小鼠眼睛周圍，隨即摘眼球取血，3 000 r/min離心10 min，分離血清，檢測血清乳酸含量。

2.5 小鼠游泳后血清尿素氮含量測定

取小鼠72只，分組、給藥及篩選參照“2.2”項。末次給藥30 min后，末次給藥30 min后，將小鼠放入裝有水溫(25±2)℃、水深40～50 cm的大鐵桶中進(jìn)行無負(fù)重游泳90 min，取出后休息30 min后，立即摘眼球取血，3 000 r/min離心10 min，分離血清，檢測血清尿素氮含量。

2.6 小鼠游泳后肝糖原含量測定

取小鼠60只，分組參照“2.2”項。各組連續(xù)灌胃給藥21 d，末次給藥30 min后，處死小鼠，取新鮮肝臟，用生理鹽水漂洗，濾紙拍干后，按肝糖原試劑盒說明書進(jìn)行肝糖原測定。

2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

3 結(jié)果

3.1 對小鼠負(fù)重力歇游泳時間的影響

與空白組對比，金匱腎氣丸組、蛤蚧組、酒蛤蚧組、油酥蛤蚧組、蛤粉制蛤蚧組小鼠的負(fù)重力歇游泳時間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。與蛤蚧組相比，油酥蛤蚧、蛤粉制蛤蚧雖然游泳時間高于蛤蚧組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 蛤蚧不同炮制品對小鼠負(fù)重力歇游泳時間的影響

3.2 對小鼠游泳后血清乳酸水平的影響

與空白組比較，金匱腎氣丸組、蛤蚧各炮制品組小鼠運(yùn)動后的血清乳酸含量顯著降低(P<0.01)。與蛤蚧組比較，金匱腎氣丸組、油酥蛤蚧組的血清乳酸含量明顯升高(P<0.05)。酒蛤蚧、蛤粉制蛤蚧的血清乳酸與蛤蚧組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 蛤蚧不同炮制品對游泳后小鼠血清乳酸含量的影響

3.3 對小鼠游泳后血清尿素氮水平的影響

與空白組相比，金匱腎氣丸組尿素氮水平顯著降低(P<0.05)，蛤蚧不同炮制品組無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。與蛤蚧組相比，酒蛤蚧組尿素氮含量顯著升高(P<0.05)，油酥蛤蚧組、蛤粉制蛤蚧組無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表3。

表3 蛤蚧不同炮制品對游泳后小鼠血清尿素氮含量的影響

3.4 對小鼠肝糖原含量的影響

與空白組相比，蛤蚧不同炮制品組能升高肝糖原含量(P<0.05)。與蛤蚧組相比，酒蛤蚧組、油酥蛤蚧組、蛤粉制蛤蚧組無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表4。

表4 蛤蚧不同炮制品對小鼠肝糖原含量的影響

4 討論

蛤蚧生品味腥，質(zhì)地柔韌，不易粉碎調(diào)劑。蛤蚧炮制后可以矯臭矯味，改善口感，便于粉碎和調(diào)劑。蛤蚧炮制方法有多種，傳統(tǒng)炮制技術(shù)有酒制、酥制、醋制等，少數(shù)民族尚有醋浸烤制、奶油烤制等方法[6]。蛤蚧生品以補(bǔ)肺益精、納氣定喘見長，為肺腎兩虛、腎不納氣、久咳虛喘要藥，常用于肺虛咳嗽或腎虛作喘[7]。蛤蚧酒浸焙、酒浸酥炙借酒行藥勢增強(qiáng)補(bǔ)腎的作用，多用于腎陽不足、精血虧損的陽痿[8]。油酥蛤蚧，腥氣減少，氣香，便于粉碎，其功效為補(bǔ)腎益肺、納氣定喘，常用于肺虛咳嗽或腎虛作喘的治療[9]。用蛤粉燙制蛤蚧可增強(qiáng)止咳平喘的作用[10]。

疲勞是由于運(yùn)動引起機(jī)體生化改變，從而降低了肌肉力量。評價疲勞的方法有耐力實(shí)驗(yàn)和生化指標(biāo)檢測，小鼠負(fù)重力竭游泳時間是評定抗疲勞特性中最常用的指標(biāo)，是體能的綜合表現(xiàn)[11]，本實(shí)驗(yàn)中小鼠服用蛤蚧各炮制品均沒有延長小鼠負(fù)重游泳的時間。影響小鼠游泳時間的因素很多，如小鼠游泳難以保證其具有相同的運(yùn)動節(jié)奏，部分小鼠在剛下水后極力掙扎，運(yùn)動速度快且激烈，易縮短游泳時間。因此不能憑單項實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)而否認(rèn)蛤蚧不同炮制品的抗疲勞作用，需綜合考量才能判定蛤蚧不同炮制品是否具有抗疲勞作用。

劇烈運(yùn)動時，機(jī)體相對缺氧，可加快糖酵解，產(chǎn)生大量乳酸，使H+濃度上升、pH值下降，導(dǎo)致機(jī)體疲勞[12]。乳酸在體內(nèi)的積聚取決于乳酸的產(chǎn)生與消除速度，減少乳酸的產(chǎn)生或加快乳酸的消除速度，都可延緩疲勞發(fā)生或加快疲勞的消除。能源耗竭是疲勞產(chǎn)生的重要原因之一，糖原作為機(jī)體中的重要能源物質(zhì)可以反映疲勞發(fā)生的快慢和程度[13]。分析本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，可知小鼠連續(xù)服用21 d蛤蚧不同炮制品后，能夠顯著降低血清乳酸的含量，升高肝糖原含量，表明蛤蚧各炮制品均具有緩解疲勞的作用，但各炮制品組與蛤蚧組的區(qū)別不大。

血清尿素氮含量可以反映機(jī)體肌肉蛋白質(zhì)的分解和合成代謝情況，可以用于分析與評價機(jī)體在大強(qiáng)度運(yùn)動條件下體力負(fù)荷承受能力的狀況[14]。機(jī)體長時間不能通過糖、脂肪分解代謝得到能量，加快蛋白質(zhì)與氨基酸分解代謝速度，使血中尿素氮含量增加[15]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，小鼠在大強(qiáng)度耐力運(yùn)動游泳后，服用蛤蚧、油酥制蛤蚧、蛤粉制蛤蚧的小鼠血清尿素氮含量與空白組比較無統(tǒng)計學(xué)差異，服用酒蛤蚧組的小鼠血清尿素氮含量高于空白組。推測原因可能為蛤蚧是富含蛋白質(zhì)類的藥物，小鼠長期服用可能會造成運(yùn)動后血清尿素氮的含量增加。

綜上所述，服用蛤蚧不同炮制品能減少運(yùn)動后血清中的乳素堆積量、提高肝糖原含量，蛤蚧不同炮制品在一定程度上具有緩解疲勞的作用。酒蛤蚧、油酥蛤蚧、蛤粉制蛤蚧的抗疲勞作用與蛤蚧有一定區(qū)別，但作用差異不大。尋求蛤蚧不同炮制品的藥效作用差別還需多模型、多指標(biāo)進(jìn)一步研究。