不同發(fā)育期云南‘三臺(tái)’核桃營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)研究

耿樹(shù)香，寧德魯，賀 娜，肖良俊，方文亮

(云南省林業(yè)和草原科學(xué)院，昆明 650201)

云南‘三臺(tái)’核桃屬鐵核桃(JuglanssigillataDode)種，主產(chǎn)于云南省楚雄州大姚縣，屬傳統(tǒng)農(nóng)家栽培品種，是經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期天然和人工選育的優(yōu)良核桃品種，具有殼薄、光滑、刻紋淺細(xì)、取仁容易、仁黃味香、出油率高及利于加工等優(yōu)點(diǎn)，是目前云南省四大優(yōu)良核桃品種之一[1]。

研究表明，鐵核桃果實(shí)中粗脂肪含量平均為61.051%，核桃油中除富含多種不飽和脂肪酸外，還含有豐富的功能性成分，如維生素E、磷脂、角鯊烯等，核桃仁中粗脂肪含量、粗蛋白質(zhì)含量、氨基酸總量、維生素E含量、褪黑素含量和磷脂含量的變異系數(shù)均較小，說(shuō)明這6種營(yíng)養(yǎng)成分遺傳穩(wěn)定性好[2-3]?，F(xiàn)有研究集中于普通核桃(JuglansregiaL.)中的蛋白質(zhì)、脂肪等營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)及部分生理活性成分[4-8]，而對(duì)鐵核桃相關(guān)研究較少，且集中于鐵核桃成熟后營(yíng)養(yǎng)成分的研究[9-12]，而缺乏對(duì)不同發(fā)育期云南核桃組分的研究。本文對(duì)云南鐵核桃種中的‘三臺(tái)’品種4個(gè)不同發(fā)育期主要營(yíng)養(yǎng)成分油脂、脂肪酸、膳食纖維、粗蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素等指標(biāo)進(jìn)行系統(tǒng)分析，以期為云南鐵核桃的整個(gè)生理發(fā)育代謝提供數(shù)據(jù)支持，為后期云南鐵核桃分子育種中尋找相關(guān)功能基因及主要代謝通路奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以云南大姚‘三臺(tái)’核桃品種為試驗(yàn)對(duì)象，在授粉后30、60、90、120 d，分別在所選3株同一‘三臺(tái)’品種株樣樹(shù)冠中部的東西南北4個(gè)方位隨機(jī)采摘果實(shí)50個(gè)，脫皮取仁45℃烘箱干燥至恒重，置于帶硅膠的干燥器保存，備用。

甲醇、乙腈、乙醇均為色譜純(Merck)；磷、鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液，質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL(購(gòu)于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心)；正己烷、氫氧化鈉、三氟化硼均為優(yōu)級(jí)純。

液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS/MS)，氣相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-Q-TOF)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基本指標(biāo)的測(cè)定

蛋白質(zhì)，依據(jù)GB 5009.5—2016中第一法檢測(cè)；含油率，依據(jù)GB 5009.6—2016中第二法檢測(cè)；膳食纖維，依據(jù)GB 5009.88—2014檢測(cè)；磷脂，依據(jù) GB/T 5537—2008中第二法檢測(cè)；磷元素，依據(jù)GB 5009.87—2016檢測(cè)；鐵元素，依據(jù)GB 5009.90—2016檢測(cè)。

1.2.2 維生素的測(cè)定

維生素C，依據(jù)GB 5009.86—2016檢測(cè)。維生素E，依據(jù)GB 5009.82—2016中第一法檢測(cè)。維生素B3，采用LC-MS/MS測(cè)定，具體測(cè)定方法如下:①樣品提取。利用研磨儀研磨樣品至粉狀，稱(chēng)取100 mg溶于水中，置于4℃冰箱過(guò)夜，期間渦旋3次以提高提取率，然后在10 000g下離心10 min，吸取上清液，用0.22 μm微孔過(guò)濾膜過(guò)濾稀釋后進(jìn)行LC-MS/MS測(cè)定。②LC-MS/MS測(cè)定條件。Acquity UPLC H CLASS液相色譜儀；配AcquityTQD檢測(cè)器的質(zhì)譜儀；ACQUITY UPLCr HSS T3色譜柱(2.1 mm×100 mm×1.8 μm)；柱溫40℃；進(jìn)樣量2 μL；流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為0.1%甲酸溶液，洗脫時(shí)間6 min，梯度比例見(jiàn)表1；電噴霧離子源(ESI)溫度500℃，質(zhì)譜電壓5 500 V,簾氣(CUR)172.4 kPa,碰撞誘導(dǎo)電離(CAD)參數(shù)設(shè)置為高。在三重四級(jí)桿(QQQ)中，每個(gè)離子對(duì)根據(jù)優(yōu)化的去簇電壓(DP)和碰撞能進(jìn)行掃描檢測(cè)。

表1 梯度比例

1.2.3 20種氨基酸組成的測(cè)定

取一定量的核桃仁樣品，粉碎，過(guò)40目篩，混勻。稱(chēng)取約100 mg(精確至0.000 1 g)混勻后樣品，置于20 mL水解管中，加入15 mL鹽酸溶液(鹽酸與超純水體積比1∶1)，在水解管中充入高純氮?dú)?，密封。將水解管放?110±1)℃恒溫烘箱中，水解22 h，取出后冷卻。將冷卻后的水解液過(guò)濾，取200 μL至10 mL試管中，蒸干，加入1 mL超純水(除氨)復(fù)溶后，再蒸干。用1 mL pH 2.2的緩沖液溶解后過(guò)0.45 μm有機(jī)濾膜，上機(jī)分析。

測(cè)試條件：液相采用Acquity UPLC H CLASS；質(zhì)譜采用AcquitySQD2檢測(cè)器；ACQUITY UPLCr HSS T3色譜柱(2.1 mm×100 mm×1.8 μm)；柱溫35℃；進(jìn)樣量2 μL；流動(dòng)相A為甲醇，B為0.1%甲酸溶液，洗脫時(shí)間8 min，梯度比例見(jiàn)表2。

表2 梯度比例

1.2.4 油脂脂肪酸組成的測(cè)定

采用GC-Q-TOF測(cè)定脂肪酸組成。稱(chēng)取5 g核桃仁樣品，分別用10 mL正己烷超聲提取3次，氮吹干，得到核桃油。稱(chēng)取約0.05 g核桃油于燒瓶中，加入2%氫氧化鈉-甲醇溶液8 mL，(80±1)℃水浴回流直至油滴消失，加入7 mL 14%三氟化硼-甲醇溶液，(80±1)℃水浴中繼續(xù)回流2 min。停止加熱，從水浴上取下燒瓶，迅速冷卻至室溫，加入約5 mL正庚烷振搖2 min，再加入飽和氯化鈉水溶液，靜置分層。吸取上層正庚烷提取溶液約5 mL至15 mL試管中，加入3～5 g無(wú)水硫酸鈉，振搖1 min，靜置5 min,吸取上層溶液到進(jìn)樣瓶中待測(cè)定。

測(cè)定條件：安捷倫7890B-5977B氣相色譜儀；TG-WAX色譜柱(30 m×250 μm×0.25 μm)；程序升溫為初始溫度120℃，以3℃/min升至280℃；進(jìn)樣口溫度270℃；載氣為高純氦氣，流速1.0 mL/min；柱前壓100 kPa；進(jìn)樣量0.5 μL；分流比10∶1。采用質(zhì)譜定性，面積歸一化法定量。

1.2.5 油脂中角鯊烯的測(cè)定

采用GC-Q-TOF測(cè)定角鯊烯。取1.2.4中

提取的核桃油0.1 g，加入約2 mL 2 mol/L氫氧化鉀-乙醇溶液，密封，搖晃均勻，在80℃水浴下皂化40 min，每隔10 min振搖30 s。反應(yīng)結(jié)束后，放入冷水中迅速冷卻至室溫，然后加入1 mL水和5 mL正己烷，密封振蕩2 min，靜置分層，將上層清液轉(zhuǎn)移至40 mL玻璃樣品瓶中，下層再分別用5 mL正己烷重復(fù)萃取3次，合并3次萃取液，在80℃水浴下蒸干，取出小瓶，以移液管向其中加入5 mL正己烷定容，用1 mL注射器取溶液過(guò)0.22 μm濾膜，轉(zhuǎn)移至安捷倫小瓶中，待測(cè)。

測(cè)定條件：TG-5MS色譜柱(30 m×250 μm×0.25 μm)，進(jìn)樣口溫度300℃，其他條件同1.2.4。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2010建立原始數(shù)據(jù)表，并進(jìn)行初步分析，運(yùn)用SPSS 21.0進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)成分相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)育期‘三臺(tái)’核桃含油率及脂肪酸組成變化(見(jiàn)表3)

表3 不同發(fā)育期‘三臺(tái)’核桃含油率及主要脂肪酸組成變化 %

由表3可見(jiàn)：‘三臺(tái)’核桃含油率在整個(gè)生長(zhǎng)期逐漸升高，特別是在前3個(gè)發(fā)育期，油脂急劇積累，含量顯著增高，而從第3到第4發(fā)育期，油脂積累趨于平穩(wěn)；棕櫚酸在第1發(fā)育期含量較高，后期含量漸低，至含量為8%左右平穩(wěn)；棕櫚烯酸在前3個(gè)發(fā)育期含量逐漸降低，從第2到第3發(fā)育期，降幅趨于平緩，在第4發(fā)育期稍有升高；硬脂酸在整個(gè)發(fā)育期含量變幅不大，在1.91%～3.40%之間；油酸在前3個(gè)發(fā)育期含量逐漸升高,在3.39%～26.75%之間；亞油酸在第1發(fā)育期含量最低，為38.16%，在第2發(fā)育期含量最高，為57.37%，從而導(dǎo)致這一時(shí)期的多不飽和脂肪酸(PUFA)在整個(gè)生長(zhǎng)期含量最高，達(dá)75.60%；亞麻酸在前3個(gè)發(fā)育期含量急劇降低，為26.09%～9.26%，在油脂積累初期含量最高，在第4發(fā)育期含量最低。在‘三臺(tái)’核桃的4個(gè)發(fā)育期中均檢出少量芥酸，在油脂積累初期含量最高，為0.398%，隨發(fā)育期延長(zhǎng)降至0.023%，而在普通核桃中未檢出芥酸[8]。飽和脂肪酸(SFA)含量從第1發(fā)育期到第2發(fā)育期下降較多，而后期下降幅度較小，單不飽和脂肪酸(MUFA)含量在4個(gè)發(fā)育期中先升高后略有下降，多不飽和脂肪酸(PUFA)含量在第2發(fā)育期最高。脂肪酸生物合成是植物體內(nèi)最重要的代謝途徑之一，是一個(gè)復(fù)雜的碳源分配過(guò)程，其含量的高低由脂肪酸合成酶控制，核桃脂肪代謝調(diào)控機(jī)制是以核桃含油率及脂肪酸組成為基礎(chǔ)。后期可通過(guò)不同發(fā)育期‘三臺(tái)’核桃轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，觀察調(diào)控核桃油脂組成基因表達(dá)水平，找到控制脂肪酸組成關(guān)鍵基因，闡明核桃營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝遺傳調(diào)控機(jī)制。

不同發(fā)育期‘三臺(tái)’核桃含油率和脂肪酸組成相關(guān)性分析見(jiàn)表4。

由表4可見(jiàn)：在‘三臺(tái)’核桃的4個(gè)發(fā)育期，含油率與亞麻酸呈極顯著的負(fù)相關(guān)，與油酸呈顯著正相關(guān)，與棕櫚酸呈顯著負(fù)相關(guān)；棕櫚酸與棕櫚烯酸呈極顯著正相關(guān)；油酸與亞麻酸呈顯著負(fù)相關(guān)。

表4 不同發(fā)育期‘三臺(tái)’核桃含油率和脂肪酸組成相關(guān)性分析

2.2 不同發(fā)育期‘三臺(tái)’核桃蛋白質(zhì)含量及氨基酸組成變化(見(jiàn)表5)

對(duì)核桃樣品蛋白質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果表明，核桃授粉后30、60、90、120 d采集樣品的蛋白質(zhì)含量分別為(1.96±0.85)%、(17.8±1.25)%、(15.0±2.18)%、(16.5±1.37)%?！_(tái)’核桃蛋白質(zhì)含量在第2發(fā)育期時(shí)最高，而在第1發(fā)育期最低。不同發(fā)育期‘三臺(tái)’核桃仁中氨基酸組成變化見(jiàn)表5。

表5 不同發(fā)育期‘三臺(tái)’核桃仁中氨基酸組成變化 mg/kg

由表5可見(jiàn)，‘三臺(tái)’核桃不同發(fā)育期樣品中共檢出13種氨基酸，包括色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蘇氨酸、纈氨酸7種人體必需氨基酸。13種氨基酸均在第2發(fā)育期含量相對(duì)較高。精氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、天門(mén)冬酰胺在第1發(fā)育期未檢出。大部分氨基酸在第4發(fā)育期繼續(xù)下降，只有5種氨基酸含量升高。4個(gè)發(fā)育期的總氨基酸含量在775.0～7 554.0 mg/kg之間，人體必需氨基酸含量在546.0～3 836.0 mg/kg之間。

2.3 不同發(fā)育期‘三臺(tái)’核桃中維生素C、維生素B3、磷、鐵、膳食纖維及核桃油中維生素E、角鯊烯、磷脂的變化(見(jiàn)表6)

表6 不同發(fā)育期‘三臺(tái)’核桃中維生素C、維生素B3、磷、鐵、膳食纖維及核桃油中維生素E、角鯊烯、磷脂的變化

由表6可見(jiàn)：維生素C含量在4個(gè)發(fā)育期逐漸升高；4個(gè)發(fā)育期中維生素B3含量在3.60～6.40 mg/kg之間，第3發(fā)育期含量最低；磷元素含量也是在第2發(fā)育期最高，可達(dá)4 998.0 mg/kg；4個(gè)發(fā)育期中鐵元素含量在26.03～36.06 mg/kg之間，變化幅度不大；膳食纖維含量在油脂積累初期最高，為37.10 g/100 g；脂溶性維生素E含量在121.0～381.0 μg/g之間，在第2發(fā)育期最高，這也是油脂積累最活躍期；角鯊烯含量在油脂積累活躍期即第2發(fā)育期最高，為21.62 mg/kg；磷脂含量在第3發(fā)育期最高，為100.90 mg/kg，第2發(fā)育期最低。

核桃種子的形成有兩個(gè)重要階段，胚的形成及種子成熟，在其種子發(fā)育期，干重和鮮重迅速增加，油脂、蛋白質(zhì)和RNA合成速率加快，蛋白質(zhì)及油脂快速積累。‘三臺(tái)’核桃中的蛋白質(zhì)含量在第2發(fā)育期最高，膳食纖維含量在第1發(fā)育期最高，而含油率在第3發(fā)育期急劇升高，這也許是在油脂積累過(guò)程中，大量與油脂合成相關(guān)基因表達(dá)升高，油脂中不同脂肪酸成分發(fā)生變化，從而導(dǎo)致每一發(fā)育期油脂脂肪酸不盡相同，同時(shí)含油率也不斷升高。核桃蛋白中的總氨基酸和必需氨基酸含量均在第2發(fā)育期最高，是核桃油脂急劇積累前期的物質(zhì)貯備。

3 結(jié) 論

‘三臺(tái)’核桃在授粉30、60、90、120 d的發(fā)育過(guò)程中，油脂積累呈穩(wěn)定上升趨勢(shì)，在第4發(fā)育期含油率達(dá)67.3%。核桃油脂肪酸主要是C16及C18脂肪酸。在‘三臺(tái)’核桃4個(gè)發(fā)育期，核桃油中均檢出芥酸，且在第1發(fā)育期含量最高，為0.398%，而在第4發(fā)育期含量最低，為0.023%。核桃油中飽和脂肪酸(SFA)含量從第1發(fā)育期到第2發(fā)育期下降較多，而后期下降幅度較小，單不飽和脂肪酸(MUFA)含量在4個(gè)發(fā)育期中先升高后略有下降，多不飽和脂肪酸(PUFA)含量在第2發(fā)育期最高。核桃油中脂溶性成分角鯊烯含量在第2發(fā)育期最高，而磷脂含量在第3發(fā)育期最高。水溶性維生素C與維生素B3含量均在第4發(fā)育期時(shí)最高，而脂溶性維生素E含量則在第2發(fā)育期最高。