復方鉤藤口服液的質(zhì)量標準研究

周 卿，陸瑩華，燕 飛

(1.遵義醫(yī)科大學 藥學院藥物分析教研室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學 藥學院2014級學生，貴州 遵義 563099)

在失眠癥狀的治療方法中，中醫(yī)藥治療因具有療效穩(wěn)定，安全、無毒、副作用小等特點而日益成為臨床常用的手段之一。大量研究也顯示，許多中草藥具有天然的鎮(zhèn)靜安神及催眠的功效，可以較好地調(diào)節(jié)睡眠功能[1-4]。復方鉤藤口服液由鉤藤、天麻、酸棗仁、遠志、山萸肉5味藥材組成，是地方名醫(yī)的經(jīng)驗方，經(jīng)多年臨床使用，療效明確，具有較好地改善睡眠的作用，為方便藥物的服用，經(jīng)劑型改進為口服液制劑。組方中鉤藤味甘性涼，可清熱平肝，息風定驚，具有鎮(zhèn)靜，降壓作用[5-7]。天麻甘平柔潤，亦可息風定驚，具有鎮(zhèn)靜、抗驚厥、抗焦慮功效，二者為主藥，合用可平肝息風，鎮(zhèn)靜安神[8-10]；輔以的酸棗仁是鎮(zhèn)靜助眠佳品，甘酸質(zhì)潤，可養(yǎng)血補肝[11-12]；遠志味苦性溫，常用于心腎不交引起的失眠多夢，健忘驚悸的治療等[13]；山萸肉可補益肝腎，收斂固澀；幾味藥合用可起到寧心除煩、鎮(zhèn)靜安神的功效。為保證臨床用藥的安全性和可控性，本研究采用薄層色譜法對復方鉤藤口服液中的鉤藤、天麻和酸棗仁進行定性鑒別，并采用高效液相色譜法測定該口服液中的鉤藤堿和天麻素的含量，以期較全面有效地控制、評價復方鉤藤口服液的質(zhì)量[14]。

1 材料

1.1 儀器 RE-2000E型旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；安捷倫1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)；pH計(美國EUTEOH公司)；BT125D型分析天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司)；SG3300HE型超聲清洗儀(上海冠特有限公司)；ZF-7型暗箱三用紫外分析儀(上海嘉鵬科技有限公司)。

1.2 藥品與試劑 復方鉤藤口服液(遵義醫(yī)科大學藥學院藥物分析實驗室自制，批號20170721、20170805、20170827，規(guī)格：10mL/只)；鉤藤堿(批號：150907)，異鉤藤堿(批號：16032)，天麻素(批號：150518)，酸棗仁皂苷A(批號：160513)，酸棗仁皂苷B(批號：160820)，鉤藤對照藥材(批號：121190)均購自北京世紀奧科生物技術有限公司；鉤藤藥材購自貴州省劍河縣，天麻、酸棗仁、遠志、山萸肉、甘草藥材均購自遵義中藥飲片公司，經(jīng)遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院藥劑科楊建文主任藥師鑒定為真品。甲醇、乙腈均為色譜純，購自迪馬科技有限公司；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 復方鉤藤口服液的制備 取組方中的藥材加水浸泡30 min，以水為藥材質(zhì)量的12倍分別提取3次(鉤藤在第一次煎煮后20 min加入)，合并煎煮濾液，減壓濃縮至含生藥為1 g/mL，加乙醇至含醇量為70 %，醇沉24 h，過濾，減壓濃縮至無醇味，加水調(diào)節(jié)濃度至含生藥0.5 g/mL，放置15 h后，過濾，濾液用10 %氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值為5.0，加入0.15 %的尼泊金甲酯和尼泊金乙酯的等量混合物，攪拌均勻，高溫滅菌，灌裝即得復方鉤藤口服液。

2.2 復方鉤藤口服液的定性鑒別

2.2.1 鉤藤藥材的鑒別 取鉤藤藥材粉碎，過40目篩，精密稱取1.0 g，加入氨水1 mL浸泡30 min后，加入25.0 mL三氯甲烷加熱回流2 h，過濾，濾液蒸干，所得殘渣加1.0 mL甲醇溶解，作為鉤藤藥材的供試品溶液；另取鉤藤對照藥材1.0 g，采用上述鉤藤藥材供試品溶液制備方法得到鉤藤對照藥材溶液。精密取鉤藤堿、異鉤藤堿對照品，分別加甲醇溶解并定容配制成1.0 mg/mL溶液，作為鉤藤堿和異鉤藤堿的對照品溶液。分別吸取上述4種溶液各10 μL，點于同一薄層硅膠G板上，以石油醚-丙酮(6∶4，V/V)為展開劑，展開，取出，晾干，置于254 nm紫外光燈下檢視[15]。結果從色譜圖1可知，鉤藤藥材供試品溶液、鉤藤對照藥材溶液與其鉤藤堿和異鉤藤堿的對照品溶液在對應位置上顯相同斑點。

1：鉤藤堿對照品；2：異鉤藤堿對照品；3：鉤藤藥材；4：鉤藤對照藥材。

2.2.2 口服液中鉤藤的鑒別 取復方鉤藤口服液20 mL，用氨水調(diào)節(jié)pH至10.0，加100 mL三氯甲烷，加熱回流1 h，取上層溶液重復用50 mL三氯甲烷加熱回流1 h，合并兩次下層溶液，蒸干后殘渣用0.5 mL甲醇溶解作為鉤藤供試品溶液。按復方鉤藤口服液的處方除去鉤藤后，制備缺鉤藤的陰性對照口服液，同上述方法制得缺鉤藤的陰性樣品溶液。取鉤藤堿、異鉤藤堿對照品，分別加甲醇溶解并定容配制成1.0 mg/mL的溶液，作為鉤藤堿和異鉤藤堿的對照品溶液。分別吸取上述4種溶液各10μL，點于同一薄層硅膠G板上，以石油醚-丙酮(6∶4,V/V)為展開劑，展開，取出，晾干后置于254 nm紫外光燈下檢視[15]。結果從色譜圖2可知，復方鉤藤口服液與鉤藤堿和異鉤藤堿對照品溶液在對應位置均顯相同斑點，而缺鉤藤的陰性對照溶液不顯斑點，不干擾測定。

1：鉤藤堿對照品；2：異鉤藤堿對照品；3～5：鉤藤供試品；6：陰性對照品。

2.2.3 口服液中天麻的鑒別 取復方鉤藤口服液10 mL，蒸干，殘渣用1 mL甲醇溶解作為天麻供試品溶液。按復方鉤藤口服液的處方除去天麻后，制備缺天麻的陰性對照口服液，同上述方法制得缺天麻的陰性樣品溶液。精密稱取天麻素對照品，用甲醇配制成1.0 mg/mL的溶液，作為天麻素對照品溶液。分別吸取上述3種溶液各10 μL，點于同一薄層硅膠G板上，以乙酸乙酯-甲醇-水(9∶1∶0.2，V/V/V)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%磷鉬酸的乙醇溶液，于110 ℃加熱至斑點顯清晰顏色[15]。結果從色譜圖3可知，復方鉤藤口服液與天麻素對照品溶液在對應位置顯相同顏色斑點，缺天麻的陰性對照溶液不顯斑點，不干擾測定。

1：天麻素對照品；2～4：天麻供試品；5：陰性對照品。

2.2.4 口服液中酸棗仁的鑒別 取復方鉤藤口服液10 mL，蒸干，殘渣用1 mL甲醇溶解作為酸棗仁供試品溶液。按復方鉤藤口服液的處方除去酸棗仁后，制備缺酸棗仁的陰性對照口服液，同上述方法制得缺酸棗仁的陰性樣品溶液。分別精密稱取酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B的對照品，分別用甲醇配制成1.0 mg/mL的溶液，作為酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B對照品溶液。分別吸取上述4種溶液各10μL，點于同一薄層硅膠G板上，以水飽和的正丁醇溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%香草醛硫酸溶液，于110 ℃加熱至斑點顯清晰顏色[15]。結果從色譜圖4可知，復方鉤藤口服液與酸棗仁皂苷A和酸棗仁皂苷B對照品溶液在對應位置顯相同斑點，而缺酸棗仁的陰性對照溶液不顯斑點，不干擾測定。

1：酸棗仁皂苷A對照品；2：酸棗仁皂苷B對照品;3～5：酸棗仁供試品；6：陰性對照品。

2.3 復方鉤藤口服液中鉤藤堿含量的測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Agilent Eclipse Plus-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動相為乙腈(A):0.05 %冰醋酸緩沖液(加三乙胺調(diào)節(jié)pH為7.5)(B)，梯度洗脫(0 min，40 % A；8 min，50 % A；20 min，60 %A；24 min，80 % A)；流速為1.0 mL/min；檢測波長為243 nm；柱溫為25 ℃；進樣量為20 μL。

2.3.2 溶液的配制 ①對照品溶液的配制：取鉤藤堿對照品適量，精密稱定，用甲醇溶解并定容至10 mL，制成濃度為1.84 mg/mL的對照品溶液。②供試品溶液的配制：精密量取復方鉤藤口服液10.0 mL，經(jīng)微孔濾膜(0.22 μm)過濾，置于4 ℃條件下儲藏待用。③陰性對照溶液的配制：按復方鉤藤口服液的處方除去鉤藤后，按其制備工藝制成缺鉤藤的陰性樣品溶液，精密量取10.0mL經(jīng)微孔濾膜(0.22 μm)過濾，即得。

2.3.3 系統(tǒng)適應性試驗 取“2.3.2”項下各溶液，按“2.3.1”項下色譜條件分別進樣20 μL，色譜圖見圖5。結果顯示，鉤藤堿保留時間為9.7 min，理論塔板數(shù)按鉤藤堿峰計不低于3 000，分離度大于1.5，陰性對照溶液在鉤藤堿對照品相同保留時間處無色譜峰出現(xiàn)，表明樣品中其它成分不干擾鉤藤堿的測定。

A：鉤藤堿對照品；B：復方鉤藤口服液；C：缺鉤藤陰性樣品；a：鉤藤堿。

2.3.4 線性關系考察 精密量取鉤藤堿對照品溶液適量，用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.92、3.68、7.36、11.04、14.78、18.40 μg/mL 的對照品系列溶液，按“2.3.1”項下色譜條件分別進樣分析，記錄色譜峰峰面積，以對照品溶液濃度C(μg/mL)為橫坐標，對照品的峰面積 A為縱坐標進行線性回歸，線性方程為A=46.36×C+13.44(r=0.999 2)，結果表明鉤藤堿在0.92 μg/mL～18.40μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關系良好。

2.3.5 定量限和檢測限的考察 精密量取鉤藤堿對照品溶液，用甲醇稀釋定容配制成濃度為0.92 μg/mL 的溶液，逐級稀釋，稀釋后溶液分別在“2.3.1”色譜條件下進樣分析測定，記錄峰面積，以信噪比為10∶1計算鉤藤堿的定量限，以信噪比為3∶1計算鉤藤堿的檢測限。結果，鉤藤堿的定量限為0.92 μg/mL，檢測限為0.18 μg/mL。

2.3.6 精密度試驗 精密量取“2.3.2”項下對照品溶液，配制成濃度為11.04 μg/mL的鉤藤堿對照品溶液，在上述色譜條件下重復測定6次，以峰面積的RSD值表示精密度。結果，鉤藤堿峰面積的RSD值為0.20%，表明儀器精密度良好。

2.3.7 重復性試驗 取復方鉤藤口服液(批號：20170805)6份，按上述供試品溶液的制備方法制備樣品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件分別進樣測定，以鉤藤堿含量的RSD值表示方法的重復性。結果，鉤藤堿含量的RSD值為2.73%，表明該方法重復性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗 取已知含量的復方鉤藤口服液9份(批號：20170805)，每份5.0 mL，分別加入高、中、低三種濃度的鉤藤堿對照品溶液適量，加甲醇定容至10 mL，按上述供試品溶液的制備方法制備樣品溶液，分別按“2.3.1”項下色譜條件進樣分析，計算加樣回收率，結果見表1。

2.3.9 穩(wěn)定性試驗 精密量取復方鉤藤口服液(批號：20170805)，按上述供試品溶液的制備方法制備樣品溶液，于室溫放置0、2、4、6、8、10、12、24 h時，分別在上述色譜條件下進樣分析。結果，鉤藤堿峰面積的RSD值為1.85%，表明復方鉤藤口服液中鉤藤堿在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.10 樣品中鉤藤堿含量測定 取3批復方鉤藤口服液，按上述方法測定口服液中鉤藤堿的含量，結果見表2，可知3批復方鉤藤口服液中鉤藤堿的平均含量為13.69μg/mL。

2.4 復方鉤藤口服液中天麻素含量的測定

2.4.1 色譜條件 色譜柱為Agilent ZORBAX SB-Aq(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動相為乙腈∶水(3∶97)；流速1.0 mL/min；檢測波長220 nm；柱溫25 ℃；進樣量20 μL。

2.4.2 溶液的配制 ①對照品溶液的配制：取天麻素對照品適量，精密稱定，用蒸餾水溶解并定容至10 mL，制成濃度為2.65 mg/mL的對照品溶液；②供試品溶液的配制：精密量取1.0 mL復方鉤藤口服液，用蒸餾水稀釋10倍后，經(jīng)微孔濾膜(0.22 μm)過濾，置于4 ℃條件下儲藏待用；③陰性對照溶液的配制：按復方鉤藤口服液的處方除去天麻后，按其制備工藝制成缺天麻的陰性樣品溶液，精密量取1.0 mL用蒸餾水稀釋10倍后，經(jīng)微孔濾膜(0.22 μm)過濾，即得。

2.4.3 系統(tǒng)適應性試驗 取“2.4.2”項下各溶液，按“2.4.1”項下色譜條件分別進樣分析，色譜圖見圖6。結果顯示，天麻素保留時間為8.7 min，理論塔板數(shù)按天麻素峰計不低于3 000，分離度大于1.5，陰性對照溶液在天麻素對照品相同保留時間處無色譜峰出現(xiàn)，表明樣品中其它成分不干擾天麻素的測定。

A：天麻素對照品；B：復方鉤藤口服液；C：缺天麻陰性樣品；b：天麻素。

2.4.4 線性關系考察 精密量取天麻素對照品溶液適量，用蒸餾水稀釋成質(zhì)量濃度分別為13.25、53.00、106.00、159.00、212.00、265.00 μg/mL 的對照品系列溶液，按“2.4.1”項下色譜條件分別進樣分析，記錄色譜峰峰面積，以對照品溶液濃度C(μg/mL)為橫坐標，對照品的峰面積 A為縱坐標進行線性回歸,線性方程為A=35.17×C-8.39(r= 0.999 8)，結果表明天麻素在13.25 μg/mL～265.00 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關系良好。

2.4.5 定量限和檢測限的考察 精密量取天麻素對照品溶液，用甲醇稀釋定容配制成濃度為13.25 μg/mL 的溶液，逐級稀釋，稀釋后溶液分別在“2.4.1”項色譜條件下進樣分析測定，記錄峰面積，以信噪比為10∶1計算天麻素的定量限，以信噪比為3∶1計算天麻素的檢測限。結果，天麻素的定量限為1.33μg/mL，檢測限為0.26μg/mL。

2.4.6 精密度試驗 精密量取“2.4.2”項下天麻素對照品溶液，配制成濃度為159.00μg/mL的天麻素對照品溶液，在上述色譜條件下重復進樣6次，以峰面積的RSD值表示精密度。結果，天麻素峰面積的RSD值為0.30%，表明儀器精密度良好。

2.4.7 重復性試驗 取復方鉤藤口服液(批號：20170805)6份，按上述供試品溶液的制備方法制備樣品溶液，在“2.4.1”項色譜條件下進樣分析測定，以天麻素含量的RSD值表示方法的重復性。結果，天麻素含量的RSD值為0.60%，表明方法重復性良好。

2.4.8 加樣回收率試驗 取已知含量的復方鉤藤口服液9份(批號：20170805)，每份5.0 mL，分別加入高、中、低三種濃度的天麻素對照品溶液適量，加蒸餾水定容至10 mL，按上述供試品溶液的制備方法制備樣品溶液，在“2.4.1”項色譜條件下進樣分析測定，計算加樣回收率，結果(見表1)。

表1 加樣回收率測定結果(n=9)

2.4.9 穩(wěn)定性試驗 精密量取量取復方鉤藤口服液(批號：20170805)，按上述供試品溶液的制備方法制備樣品溶液，于室溫放置0、2、4、6、8、10、12、24 h時，分別在“2.4.1”項色譜條件下進樣分析測定，天麻素峰面積的RSD值為0.99%，結果表明復方鉤藤口服液中天麻素在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.10 樣品中天麻素含量測定 取3批口服液，按上述方法測定口服液中天麻素的含量，結果見表2，可知3批復方鉤藤口服液中天麻素的平均含量為1294.6 μg/mL。

表2 樣品含量測定結果(n=3)

3 討論

鉤藤堿、異鉤藤堿均是鉤藤中的主要藥效成分，二者為同分異構體，在煎煮過程中易相互轉換[16]，中國藥典中對于鉤藤藥材的定性鑒別僅采用了以異鉤藤堿為檢測指標[15]，為全面控制鉤藤藥材的質(zhì)量，在本試驗中同時定性鑒別了鉤藤堿和異鉤藤堿，采用紫外燈光觀察，結果表明兩個成分分離完全，斑點清晰。在鉤藤堿的含量測定方法中，比較了文獻中[17-19]的流動相，如甲醇-0.02%三乙胺、甲醇-水(含0.01 mol/L三乙胺，冰醋酸調(diào) pH值至 7.5)、甲醇-水等均不能使口服液中的鉤藤堿與其他組分完全分離，后采用在0.05%的冰醋酸溶液中加入0.07%的氨水，再加三乙胺調(diào)節(jié)pH為7.5，鉤藤堿與口服液中其他組分得以分離完全。同時在檢測中發(fā)現(xiàn)異鉤藤堿的含量遠低于鉤藤堿，故選擇鉤藤堿作為該口服液中含量測定的指標之一。在天麻素的含量測定方法中，由于天麻素極性較大，所用流動相的極性也較大，對常規(guī)色譜柱有損害，而選擇專用適合極性化合物分離的色譜柱Agilent ZORBAX SB-Aq較好地解決了這一問題，且基線平穩(wěn)，色譜峰峰型良好。

綜上所述，本試驗建立了復方鉤藤口服液中鉤藤堿、天麻素、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B的薄層色譜鑒別法；建立了復方鉤藤口服液中鉤藤堿、天麻素含量測定的高效液相色譜法，含量限度以-20%為下限[20]，再綜合考慮藥材來源的差異，確定口服液中鉤藤堿的含量不得低于10.0 μg/mL，天麻素的含量不得低于1 000.0 μg/mL。所建立的方法準確可靠，可用于復方鉤藤口服液的質(zhì)量控制。