IL-33對大鼠顱腦創(chuàng)傷后認(rèn)知障礙的初步研究

羅 海，侯世科，涂 悅

(武警特色醫(yī)學(xué)中心 急診醫(yī)學(xué)科，天津 300162)

創(chuàng)傷后認(rèn)知功能障礙病理學(xué)的標(biāo)志包括β淀粉樣蛋白(Aβ)組成的細(xì)胞外淀粉樣蛋白斑塊沉積、纖維結(jié)節(jié)在腦神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)形成，以及突觸功能障礙[1]。研究表明白細(xì)胞介素-33(IL-33)在與受體ST2相結(jié)合后可以發(fā)揮減少 Aβ聚集、抑制細(xì)胞炎癥的雙重功能[2]。IL-33在出血性或缺血性損傷后可在動物海馬組織中大量表達(dá)[3-4]，通過調(diào)節(jié)特異性小膠質(zhì)細(xì)胞活性，抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，使急性顱腦損傷(Traumatic brain injury，TBI)大鼠的神經(jīng)功能得到改善，其主要機(jī)制是促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞的募集，并增加其吞噬活性來降低海馬組織 Aβ[5]。并且，遺傳學(xué)研究已經(jīng)確定IL-33基因中的3個單核苷酸的多態(tài)性與降低認(rèn)知功能障礙的風(fēng)險相關(guān)[4]。在腦和脊髓中，IL-33主要表達(dá)在少突膠質(zhì)細(xì)胞，可以使小膠質(zhì)細(xì)胞朝著具有增強(qiáng) Aβ吞噬能力和增強(qiáng)抗炎基因表達(dá)的替代活化狀態(tài)傾斜，從而降低腦中的促炎反應(yīng)[6-7]。然而，目前仍然不清楚體外補(bǔ)充IL-33是否可以緩解創(chuàng)傷后認(rèn)知功能障礙。本研究通過體外補(bǔ)充IL-33探索TBI后認(rèn)知功能。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要材料 48只SPF級雄性健康SD大鼠，6～8周齡，體重200～300 g，購自北京維通利華。IL-33試劑(美國，Biolegend公司)；兔抗鼠白細(xì)胞介素33(IL-33)一抗、兔抗鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)一抗、兔抗鼠白細(xì)胞介素1β(IL-1β)一抗(美國，Sigma公司)；兔抗鼠β淀粉樣蛋白1-42(Aβ1-42)一抗、兔抗鼠tau一抗、兔抗鼠β肌動蛋白(β-actin)一抗(美國，Abcam公司)；蛋白酶K(瑞士，Roche公司)；TUNEL熒光試劑盒(美國，Abbkine公司)。

1.2 TBI大鼠模型制備 大鼠術(shù)前6 h禁食禁飲，皮質(zhì)打擊法建立大鼠TBI模型[8]。5%水合氯醛7 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，備皮，局部消毒，鋪無菌洞巾。矢狀切開皮膚以露出頭骨，在囟點左后、右后3 mm分別鉆孔，直徑約5.0 mm，露出硬腦膜。調(diào)整eCCI使其與腦膜表面垂直，精確打擊右側(cè)大腦皮層以造成彌漫性損傷。實驗組的打擊參數(shù)為右后2.5 mm，深4 mm，打擊速率6 m/s。皮質(zhì)打擊后立即止血，縫合頭皮。所有動物均飼養(yǎng)于棗礦集團(tuán)中心醫(yī)院動物房，采用普食喂養(yǎng)，自由飲水。

1.3 大鼠分組及給藥 取48只健康雄性SD大鼠隨機(jī)均分為假手術(shù)組(sham組)、TBI組和TBI+IL-33組，每組16只。TBI組大鼠顱骨開骨窗后打擊皮質(zhì)，sham組僅開骨窗。TBI+IL-33組造模成功后立即給予IL-33尾靜脈注射200 ng/只/d，連續(xù)3 d，其余兩組分別注射等量晶體液[9]。實驗3 d后每組大鼠隨機(jī)取8只，安樂死后采用 Western blot法檢測海馬組織 IL-33、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的水平，熒光 TUNEL檢測細(xì)胞凋亡。實驗1個月后，采用Morris水迷宮評估另外8只大鼠的記憶能力，隨后將大鼠安樂死，取海馬組織檢測β淀粉樣蛋白(Aβ1-42)和tau蛋白水平。

1.4 Western blot檢測 取大鼠海馬組織，RIPA裂解液裂解，充分勻漿，于4 ℃離心15 min，取上清，采用BCA蛋白定量法進(jìn)行總蛋白定量。使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，半干轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜。用含有0.1%牛血清白蛋白的PBS在室溫下將膜封閉1 h，PBST洗滌后抗體溫育4 h：兔抗鼠Aβ1-42一抗(1∶1 000)，兔抗鼠tau一抗(1∶1 000)，兔抗鼠IL-33一抗(1∶1 000)，兔抗鼠IL-1β一抗(1∶1 000)，兔抗鼠TNF-α一抗(1∶1 000)和β-actin一抗(1∶1 000)。將膜用PBST清洗4次后與山羊抗兔二抗(1∶1 000)在室溫下孵育2 h。PBST清洗后采用ECL試劑盒檢測條帶的化學(xué)發(fā)光，使用ImageJ軟件分析圖像。

1.5 TUNEL檢測 將海馬組織進(jìn)行蛋白酶K抗原修復(fù)30 min，PBS洗滌3次。根據(jù)分析試劑盒使用說明書進(jìn)行溶液制備和染色。使用熒光顯微鏡在400倍率下觀察CA1區(qū)段細(xì)胞數(shù)量。細(xì)胞凋亡(%)等于熒光染色陽性細(xì)胞數(shù)/(陽性細(xì)胞+陰性細(xì)胞)×100%。

1.6 大鼠Morris水迷宮 實驗直徑120 cm高40 cm的水迷宮，放滿水，控制水溫約25 ℃。在第一象限水面下0.5 cm設(shè)置一個直徑10 cm高25 cm的逃生平臺。將自由活動的大鼠分別從4個象限隨機(jī)放入，讓其尋找隱藏在水中的平臺。攝像頭采集大鼠的活動并用Ethovision 3.0軟件進(jìn)行處理。實驗包括尋找水下平臺的定位航行和去除平臺后的空間探索兩部分，主要觀察指標(biāo)有:①逃避潛伏期：定位航行實驗大鼠從第31天開始連續(xù)6 d從各個象限找到平臺的時間，記錄為逃避潛伏期；②大鼠活動情況：空間探索實驗在第36天，拆掉平臺，將大鼠從第Ⅱ象限放入水中，記錄50 s內(nèi)大鼠穿越平臺位置的次數(shù)、目標(biāo)象限游泳的時間[10]。

2 結(jié)果

2.1 IL-33對大鼠海馬組織炎癥和細(xì)胞凋亡的影響 與sham組相比，TBI組大鼠海馬組織 IL-33、IL-1β、TNF-α水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，海馬組織細(xì)胞凋亡比率明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與TBI組相比，TBI+IL-33組大鼠海馬組織IL-1β、TNF-α水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，海馬組織細(xì)胞凋亡比率明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1和圖1。

表1 各組大鼠IL-33、IL-1β、TNF-α蛋白相對表達(dá)量和細(xì)胞凋亡率比較。

A：IL-33、IL-1β、TNF-α、β-actin免疫印跡條帶；B：IL-33相對含量；C：IL-1β相對含量；D：TNF-α相對含量；E：各組大鼠海馬組織TUNEIL熒光染色，比例尺=100 μm；F：各組大鼠海馬組織細(xì)胞凋亡比率。a：與sham組相比，P<0.05；b：與TBI組相比P<0.05。

2.2 IL-33治療對海馬組織 Aβ1-42、tau表達(dá)水平及記憶功能的影響 與sham組相比，TBI組大鼠海馬組織 Aβ1-42、tau水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，逃避潛伏期明顯延長，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，跨越隱匿平臺的次數(shù)、目標(biāo)象限內(nèi)游泳時間明顯減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與TBI組相比，TBI+IL-33組大鼠海馬組織 Aβ1-42、tau水平均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，逃避潛伏期明顯縮短，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，跨越隱匿平臺的次數(shù)、目標(biāo)象限內(nèi)游泳時間均明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2和圖2。

表2 各組大鼠記憶功能評估

A：Aβ1-42、tau、β-action免疫印跡條帶；B：Aβ1-42相對含量；C：tau相對含量；D：各組大鼠逃避潛伏期；E：各組大鼠目標(biāo)象限停留時間；F：各組大鼠穿越目標(biāo)象限次數(shù)。a：與sham組相比，P<0.05；b：與TBI組相比P<0.05。

3 討論

炎癥是運(yùn)動神經(jīng)元死亡的主要原因，TBI后的炎性改變是 TBI后認(rèn)知功能障礙的誘因，這種效應(yīng)歸因于炎癥反應(yīng)的失衡，急、慢性神經(jīng)炎癥刺激誘導(dǎo) Aβ累積[11]。在癡呆癥患者中，Aβ和tau蛋白在海馬組織中的異常沉積導(dǎo)致突觸功能異常，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元突觸的壞死[12-13]。而小膠質(zhì)細(xì)胞與Aβ結(jié)合可引起IL-1β和TNF-α的釋放，導(dǎo)致神經(jīng)炎癥損傷神經(jīng)組織，特別是慢性神經(jīng)炎癥，被認(rèn)為加速認(rèn)知功能障礙發(fā)展的重要因素[14]。在癡呆癥患者的海馬組織中IL-33表達(dá)降低，血清中sST2表達(dá)增加，這是由于 IL-33/ST2信號傳導(dǎo)受損導(dǎo)致的，IL-33/ST2信號傳導(dǎo)受損將會導(dǎo)致淀粉樣蛋白斑塊沉積、增加慢性神經(jīng)炎癥并加重認(rèn)知功能障礙的癥狀[15]。通過以上研究，很容易推測出提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)中IL-33的水平可能是預(yù)防認(rèn)知功能障礙的關(guān)鍵[16]。本研究結(jié)果顯示，體外補(bǔ)充IL-33可以明顯降低TBI大鼠腦組織tau及Aβ1-42水平，從蛋白水平證明IL-33可以改善TBI大鼠的認(rèn)知障礙。事實上，遺傳研究已經(jīng)將 IL-33/ST2的單核苷酸多態(tài)性與臨床認(rèn)知功能障礙聯(lián)系起來[11,17]。這些表明在動物認(rèn)知功能障礙模型中的觀察結(jié)果可以類推到人類身上。

最近研究發(fā)現(xiàn)IL-33可以動員先天免疫來預(yù)防和清除既定的Aβ積累，為認(rèn)知功能障礙的治療提出了新方向。IL-33在出血性或缺血性損傷后可在動物海馬組織中大量表達(dá)[3-4]，IL-33還可以通過調(diào)節(jié)特異性小膠質(zhì)細(xì)胞活性減輕腦水腫，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，改善急性腦損傷大鼠的神經(jīng)功能[5]，其主要機(jī)制是IL-33通過增強(qiáng)小膠質(zhì)細(xì)胞對 Aβ的吞噬和降解，將小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)換為另一種活化表型，以減少認(rèn)知功能障礙的促炎反應(yīng)[6]。激活的小膠質(zhì)細(xì)胞通過增強(qiáng)自身對Aβ的吞噬作用，清除和降解積累的Aβ。；然而Aβ在大腦中的持續(xù)產(chǎn)生和異常積累會導(dǎo)致Aβ受體的減少和炎癥介質(zhì)的增加，從而引起小膠質(zhì)細(xì)胞功能障礙[6]，因此激活小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬功能尤為重要。而在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，IL-33可以在少突膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，通過釋放作用于小膠質(zhì)細(xì)胞，使小膠質(zhì)細(xì)胞朝向具有增強(qiáng)的Aβ吞噬能力和增強(qiáng)的抗炎基因表達(dá)的活化狀態(tài)傾斜，從而降低海馬組織中的促炎反應(yīng)[7]。本研究結(jié)果顯示，體外補(bǔ)充IL-33可以明顯降低TBI大鼠腦組織IL-1β及TNF-α等炎癥介質(zhì)水平，證明IL-33可以抑制TBI大鼠腦組織炎癥水平。

綜上所述，IL-33治療能夠抑制大鼠大腦中的Aβ積累，降低TBI大鼠腦組織炎癥因子 IL-1β和 TNF-α的表達(dá)水平，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，使記憶功能得到改善，從細(xì)胞和分子水平上詮釋了IL-33可以改善TBI大鼠神經(jīng)功能。因此，IL-33可能成為治療人類TBI后認(rèn)知功能障礙新的研究方向。