杜仲黑茶中氨基酸和礦物元素分析及對“三高癥”的影響

穆文碧，張建永，李明丹，曾宏亮，段燦燦，謝友旺

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 遵義 563099；2.湖南省藥物安全評價研究中心，湖南 長沙 410208；3.湖南省中醫(yī)研究院，湖南 長沙 410013；4.遵義醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099；5.張家界茶坤緣杜仲生物科技開發(fā)有限公司，湖南 張家界 427200)

隨著社會的發(fā)展，心腦血管病已成為我國重大衛(wèi)生問題，時刻威脅著人類健康，而“三高癥”是其發(fā)病的重大危險因素?！叭甙Y”即指高血壓、高血糖及高脂血癥，由現(xiàn)代社會派生的“富貴病”，被稱為人類致命的“頭號殺手”[1-2]。其中高血壓可引起腦出血和腦血管破裂，高血糖能引起糖尿病，高血脂會導(dǎo)致血管栓塞等，為減少心腦血管病的發(fā)生，積極防治高血壓、高血糖、高脂血癥已刻不容緩[3]。杜仲黑茶屬黑茶類，因采用傳統(tǒng)名貴滋補(bǔ)藥材杜仲樹的嫩葉做茶而得名，主料包括杜仲葉、絞股藍(lán)及黑茶茶葉，并輔以蜂蜜、甘草、紅棗、營養(yǎng)水和木糖醇制作而成[4]。作為主料的杜仲葉是杜仲科杜仲屬植物(Eucommiaulmoides)[5]的葉子，活性成分有黃酮類、環(huán)烯醚萜類、苯丙素類、木脂素類及多糖類等，主要藥理作用為降血壓、降血脂、降血糖、強(qiáng)筋健骨、抗衰老等[6]。杜仲葉對高血壓、高血糖及高脂血癥具有良好的治療作用，然由杜仲葉深加工而成的杜仲黑茶是否有相同藥理活性與作用效果尚不明確?；诖?，本文將分別建立高血壓、高血糖、高脂血癥的大鼠模型，觀察實(shí)驗(yàn)大鼠血壓、血糖和血脂的水平，探究杜仲黑茶輔助降低“三高癥”的功效。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 材料 杜仲黑茶(批號：20190401，張家界茶坤緣杜仲生物科技開發(fā)有限公司)，杜仲平壓片(批號：180101，湖南安邦制藥有限公司)。鹽酸二甲雙胍片(批號：11712225，浙江亞太藥業(yè)股份有限公司)，葡萄糖(批號：20180606，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，地塞米松磷酸鈉注射液(批號：180901，三名三獸藥有限公司)，注射用生理鹽水(批號：18012001D，湖南康源制藥有限公司)。辛伐他汀片(批號：180605，天津懷仁制藥有限公司)，脂降寧片(批號：180902，通化金愷威藥業(yè)有限公司)。

實(shí)驗(yàn)動物：128只4周齡的SPF級雄性SD大鼠(湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司)，體重190～220 g(生產(chǎn)許可證號：SCXK[湘]2016-0002，質(zhì)量合格證號：No.43004700058859)。

高脂飼料配方：每100 kg高脂飼料含維持鼠料粉料43.7 kg、蔗糖20.0 kg、豬油10.0 kg、酪蛋白(85%)12.5 kg、膽固醇1.2 kg、磷酸氫鈣1.3 kg、石粉0.5 kg、膽酸鈉0.2 kg。購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司(生產(chǎn)許可證號：SCXK[湘]2014-0002，合格證編號：No.43200600006 023)。

1.1.2 儀器 PL2002型電子天平(梅特勒-托利多儀器[上海]有限公司)；MS105DU型分析天平(湖南省藥物安全評價研究中心編號：362，梅特勒-托利多中國有限公司)；BP-6A型自動無創(chuàng)血壓測量系統(tǒng)(湖南省藥物安全評價研究中心編號：149，成都泰盟實(shí)驗(yàn)科技有限公司)；血糖測試儀(湖南省藥物安全評價研究中心編號：548，艾康生物技術(shù)[杭州]有限公司)；LABOSPECT003型自動生化分析儀(湖南省藥物安全評價研究中心編號：001，日本日立)。

1.2 杜仲黑茶水溶液的制備 稱取l kg杜仲黑茶，以10 L煮沸純化水浸泡提取30 min后過濾，提取2次，合并濾液，60 ℃濃縮至5 L(終濃度為0.2 g/mL)，混勻密封存于-80 ℃冰箱備用。

1.3 杜仲黑茶中氨基酸和礦物元素的檢測 取杜仲黑茶適量，參考GB5009.124-2016標(biāo)準(zhǔn)方法，檢測杜仲黑茶中的氨基酸含量；按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T5009.57-2003相關(guān)規(guī)定，檢測杜仲黑茶中礦物元素的種類和含量。

1.4 杜仲黑茶對“三高癥”的影響

1.4.1 杜仲黑茶對腎血管型高血壓大鼠的影響 參考文獻(xiàn)報道[7]，采用兩腎一夾法制備腎血管型高血壓(簡稱腎性高血壓)大鼠模型，將40只SPF級雄性大鼠(190～220 g)分為空白(8只)和模型組(32只)，空白組做假性手術(shù)，模型組選用內(nèi)徑為0.20～0.25 mm的銀夾置于左腎動脈盡量靠近主動脈處，30 d后采用BP-6A型自動無創(chuàng)血壓控制器測量大鼠尾動脈的收縮血壓，若收縮血壓≥21.3 kPa(160 mmHg)且較穩(wěn)定，或血壓較術(shù)前高4 kPa即表明模型建立成功[8]。再將32只模型大鼠分為模型、陽性對照以及杜仲黑茶高、低劑量共4組(n=8)。空白和模型組ig等體積蒸餾水，陽性對照組ig杜仲平壓片水溶液0.8 mg/(kg·d)，杜仲黑茶高、低劑量組ig杜仲黑茶水溶液2.0、0.5 g/(kg·d)，給藥時間為28 d。

1.4.2 杜仲黑茶對高血糖大鼠的影響 參照保健食品規(guī)范方法[9]，SPF級雄性大鼠(190～220 g)40只維持飼料適應(yīng)1周后，禁食4 h，取尾血測定給葡萄糖前(0 h)血糖值即空腹血糖，給予葡萄糖(2.5 g/kg)后測定30、120 min血糖值，作為該批動物基礎(chǔ)值。將大鼠隨機(jī)分為5組(n=8)，即空白、模型、陽性對照組以及杜仲高、低劑量組。空白組全程給予維持飼料；模型及給藥組給予維持飼料1周后換為高脂飼料，飼喂2周后在高脂飼喂基礎(chǔ)上聯(lián)合腹腔注射地塞米松磷酸鈉注射液10 mL/(kg·d)，連續(xù)10 d。其中空白和模型組大鼠ig等體積蒸餾水，陽性對照組ig鹽酸二甲雙胍片水溶液0.11 g/(kg·d)，杜仲黑茶高、低劑量組ig杜仲黑茶水溶液2.0、0.5 g/(kg·d)，連續(xù)給藥35 d。試驗(yàn)結(jié)束，各組動物禁食4 h，檢測空腹血糖及糖耐量水平。

空腹血糖、糖耐量實(shí)驗(yàn)：各組大鼠禁食4 h，測定給葡萄糖前(0 h)血糖值即空腹血糖；給藥組給予相應(yīng)藥物，模型組給予等體積蒸餾水，空白組不做處理，20 min后各組 ig葡萄糖(2.5 g/kg)，并測定30、120 min的血糖值。若模型組30 min血糖值≥10 mmol/L，或30、120 min任一時間點(diǎn)血糖值或血糖曲線下面積顯著性升高，可判定糖代謝紊亂模型成立，在此基礎(chǔ)上，觀察模型組與給藥組空腹血糖、給葡萄糖后(30、120 min)血糖及0、30、120 min血糖曲線下面積的變化。血糖曲線下面積AUC =1/2×(0 min血糖值+30 min血糖值)×0.5+1/2×(120 min血糖值+30 min血糖值)×1.5。以O(shè)GM-111型血糖測試儀對大鼠的血糖值進(jìn)行測定，正常大鼠降糖試驗(yàn)：給藥組空腹血糖對比空白組無統(tǒng)計學(xué)意義，即判定對正常大鼠血糖無影響。高血糖模型降糖試驗(yàn)：模型成立前提下，對比模型組，給藥組空腹血糖下降或血糖值下降有統(tǒng)計學(xué)意義，判定該藥物空腹血糖指標(biāo)結(jié)果陽性；糖耐量指標(biāo)：模型成立前提下，對比模型組，給藥組在給葡萄糖后30、120 min任一時間點(diǎn)血糖下降有統(tǒng)計學(xué)意義，或0、30、120 min血糖曲線下面積降低有統(tǒng)計學(xué)意義，判定該藥物糖耐量指標(biāo)結(jié)果陽性?？崭寡呛吞悄土慷?xiàng)指標(biāo)中一項(xiàng)指標(biāo)陽性，且對正常動物空腹血糖無影響，即可判定該受試樣品輔助降血糖功能動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性[8-9]。

1.4.3 杜仲黑茶對高脂血癥大鼠的影響 參照保健食品輔助降血脂動物試驗(yàn)混合型高血脂造模方法[10]，48只SPF級雄性大鼠(190～220 g)，先分為空白組(8只)和模型組(40只)，空白組大鼠給予維持飼料，模型組大鼠給予高脂飼料。飼喂10 d后，大鼠不禁食眼內(nèi)眥采血，按照相應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行操作，采用LABOSPECT003型自動生化分析儀測定血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平。對比空白組，模型組血清甘油三酯TG升高，血清總膽固醇TC或低密度脂蛋白膽固醇LDL-C升高，差異均有顯著性，即可判定模型成立[8,10]。根據(jù)血清TC水平將模型組大鼠分為模型、陽性對照1、陽性對照2以及杜仲黑茶高、低劑量共5組(n=8)?？瞻缀湍Ｐ徒Mig等體積蒸餾水，陽性對照組1 ig辛伐他汀片水溶液3.6 mg/(kg·d)，陽性對照2 ig脂降寧片水溶液0.81 mg/(kg·d)，杜仲黑茶高、低劑量組ig杜仲黑茶水溶液2.0、0.5 g/(kg·d)，給藥期間空白組給予維持飼料，模型及給藥組給予高脂飼料，藥程共30 d。

2 結(jié)果

2.1 杜仲黑茶中氨基酸及礦物元素分析 杜仲黑茶氨基酸檢測發(fā)現(xiàn)其含有16種氨基酸，其中包括甲硫氨酸、纈氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、色氨酸及蘇氨酸8種人體必需氨基酸(見表1)。礦物元素檢測可知杜仲黑茶僅含鐵、鉀等共19種礦物元素(見表2)。

表1 杜仲黑茶中氨基酸的檢測

表2 杜仲黑茶中礦物元素的檢測

2.2 杜仲黑茶輔助降血壓的結(jié)果 杜仲黑茶對腎性高血壓大鼠的影響：對比空白組，模型組大鼠血壓顯著升高(P=0.000)，提示高血壓大鼠模型建造成功；藥物干預(yù)后，對比模型組，陽性對照組的血壓明顯降低(P=0.000)，杜仲黑茶的高、低兩個劑量組的血壓顯著降低(P=0.002、P=0.032)，且作用效果與陽性藥相當(dāng)(見表3)。

表3 杜仲黑茶對腎性高血壓大鼠的影響

2.3 杜仲黑茶輔助降血糖的結(jié)果 杜仲黑茶對大鼠血糖的影響：給藥后，與空白組比較，模型組大鼠血糖值明顯升高，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.000)，且血糖曲線下面積AUC顯著增加(P=0.000)，提示高血糖模型成立；與模型組比較，陽性對照組血糖值及血糖曲線下面積顯著降低(P=0.004)，杜仲黑茶低劑量組大鼠在0、30、120 min血糖值具有明顯降低(P=0.047)，且杜仲黑茶高、低劑量組大鼠的血糖曲線下面積AUC明顯降低(P=0.042、P=0.036，見表4)。

表4 大鼠各時間點(diǎn)的血糖值

2.4 杜仲黑茶輔助降低高脂血癥的作用 杜仲黑茶對高血脂大鼠的作用：對比空白組，模型組TG、TC、LDL-C顯著升高(P=0.000、P=0.003、P=0.005)，表明高血脂大鼠模型建造成功；藥物干預(yù)后，對比模型組，辛伐他汀片組TG、LDL-C顯著降低(P=0.000、P=0.036)，脂降寧片組TG明顯降低(P=0.001)，杜仲黑茶低劑量組TG顯著下降(P=0.000)，杜仲黑茶高劑量組TG、TC均明顯降低(P=0.000、P=0.047)，杜仲黑茶2個劑量組對高血脂均有不同程度的改善，且作用不亞于其他2個陽性對照藥(見圖1)。

A-C：分別是藥物對大鼠總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白的影響；Control：空白組，Model：模型組，DZ-L：杜仲黑茶低劑量組，DZ-H：杜仲黑茶高劑量組，XFTD：辛伐他汀片，ZJN：脂降寧片；**：與空白組相比，P<0.01；#：與模型組相比，P<0.05；##：與模型組相比，P<0.01。

3 討論

杜仲黑茶屬黑茶類，因采用杜仲葉做茶而得名，其主要成分包括杜仲葉、絞股藍(lán)及黑茶茶葉。其中杜仲葉活性成分豐富，藥理作用突出，具有降血壓、降血脂、降血糖、抗氧化及抗疲勞等多種功效，《中國藥典》 2015版將其收錄[11]。然而由杜仲葉加工而成的杜仲黑茶是否具有相同的藥理作用尚不可知，因此，本研究對杜仲黑茶中營養(yǎng)成分進(jìn)行了初步分析并研究了其對三高癥的影響。

氨基酸成分測定結(jié)果顯示，杜仲黑茶中富含16種氨基酸，這些氨基酸具有維持機(jī)體生理功能作用，缺少任何一種都可能導(dǎo)致機(jī)體代謝紊亂、免疫力降低等[12]。同時還包括鋅、銅等19種微量元素，微量元素的攝入量及其平衡影響著人體的健康[13]。杜仲黑茶的谷氨酸、天冬氨酸精氨酸等氨基酸的含量比湖北名優(yōu)綠茶的高[14]；杜仲黑茶中鐵和錳元素的含量明顯高于梵凈山藤茶、紅茶、黑茶，然其鈣、鎂、鈉等元素含量卻不及梵凈山黑茶[15]。

杜仲黑茶對腎性高血壓大鼠影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，杜仲黑茶對腎性高血壓大鼠表現(xiàn)出明顯的降壓作用，且功效與降壓藥杜仲平壓片相當(dāng)。根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評價技術(shù)規(guī)范》(2003年版)[8]，可判定杜仲黑茶輔助降血壓功能的大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。此外，本研究結(jié)果與既往報道的杜仲葉提取物可顯著改善自發(fā)性高血壓和腎性高血壓模型大鼠的高血壓[16]一致，即提示杜仲黑茶具有輔助降血壓的功效。杜仲黑茶降低高血糖大鼠血糖值的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，杜仲黑茶對正常大鼠的血糖無明顯影響，但是能夠顯著改善高血糖大鼠的血糖值及血糖曲線下面積，按照《保健食品檢驗(yàn)與評價技術(shù)規(guī)范》(2003年版)[8]和國家食品藥品監(jiān)督管理局《關(guān)于印發(fā)抗氧化功能評價方法等9個保健功能評價方法的通知》(國食藥監(jiān)保化[2012]107號[9]，可判定杜仲黑茶輔助降低血糖功能的實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。同時，本研究與張紅霞等[17]發(fā)現(xiàn)杜仲葉醇提物通過抑制葡萄糖吸收降低血糖的結(jié)果一致；邢冬杰等[18]的研究表明糖尿病大鼠的血糖值可被杜仲葉黃酮顯著降低；高燕等[19]的研究也表明高血糖的綿羊可通過給予杜仲葉后，提高糖酵解、促進(jìn)肝糖原合成從而降低其血糖值，綜上可知杜仲黑茶具有一定的輔助降低高血壓的功效。杜仲黑茶對高脂血癥大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，杜仲黑茶對高脂血癥大鼠的血清總膽固醇、甘油三酯水平具有明顯的改善作用，且治療效果與辛伐他汀片和脂降寧片兩種降脂藥相當(dāng)，按照國家食品藥品監(jiān)督管理局《關(guān)于印發(fā)抗氧化功能評價方法等9個保健功能評價方法的通知》(國食藥監(jiān)保化[2012]107號)[10]及《保健食品檢驗(yàn)與評價技術(shù)規(guī)范》(2003年版)的要求進(jìn)行分析[8]，可判定杜仲黑茶輔助降低血脂功能大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。此外，雷燕妮等[20-21]、劉靜等[22]的研究結(jié)果均顯示杜仲葉具有降脂活性一致，由此可知杜仲黑茶具有一定的輔助降低高血脂的功效。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)杜仲黑茶富含16種氨基酸和19種礦物元素，如鋅、銅、鐵等微量元素，大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，杜仲黑茶有輔助降低血壓、血糖及血脂的功效。杜仲黑茶具有輔助降低高血壓、高血糖和高血脂的功效，有望為抑制和減少三高癥提供新的預(yù)防、保健和治療策略。但是杜仲黑茶降三高的作用機(jī)制還不清楚仍有待進(jìn)一步的研究。