桃紅四物湯加減方對(duì)小鼠黃褐斑的預(yù)防作用研究

劉世柱，張衛(wèi)華，蔡 琳，孫文澤，安小蘭，崔國(guó)禎

(1.杭州胡慶余堂國(guó)藥號(hào)有限公司，浙江 杭州 31009；2.國(guó)家中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心 保健食品分中心，廣東 珠海 519041；3.遵義醫(yī)科大學(xué) 珠海校區(qū)生物工程系，廣東 珠海 519041)

黃褐斑又稱(chēng)為“肝斑和蝴蝶斑”，是人類(lèi)面部常見(jiàn)的皮膚色素代謝障礙性疾病，女性患黃褐斑的概率遠(yuǎn)高于男性，對(duì)患者的生活質(zhì)量有一定的負(fù)面影響[1]。近幾年，黃褐斑的發(fā)病率呈不斷上升趨勢(shì)，其防治已引起醫(yī)學(xué)界的高度重視，研究人員在臨床和實(shí)驗(yàn)研究方面做了大量的研究工作。然而，多種防治方法，均存在易復(fù)發(fā)和安全隱患等問(wèn)題[2]。黃褐斑的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，目前的研究表明，引起黃褐斑的致病因素眾多。研究發(fā)現(xiàn)紫外線(xiàn)輻射、內(nèi)分泌失調(diào)、氧自由基、藥物和化妝品不正當(dāng)?shù)氖褂眉斑z傳等因素是引起黃褐斑的主要原因[3]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“無(wú)淤不成斑”，氣滯血淤導(dǎo)致面部黑色素沉著形成斑塊。人體在中醫(yī)學(xué)上被視為一個(gè)有機(jī)整體，肝、脾和腎這三個(gè)臟器的失調(diào)是黃褐斑發(fā)病的關(guān)鍵，中醫(yī)的防治理念主要是“疏肝理氣，活血化瘀”。基于以上中醫(yī)理論，以桃紅四物湯(由當(dāng)歸、生地、川芎、白芍、桃仁和紅花組成)為基礎(chǔ)方，結(jié)合中醫(yī)理論，對(duì)本方進(jìn)行調(diào)整。以當(dāng)歸、白芍、川芎、紅花、丹參和葡萄籽提取物按照一定的比例配制成防治黃褐斑的組方。從理論上講，該配方具有活血通脈、補(bǔ)血養(yǎng)顏和祛斑的功效。本研究以黃褐斑小鼠模型為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，觀察該復(fù)方對(duì)黃褐斑的預(yù)防作用，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種SPF級(jí)雌性小鼠40只(購(gòu)買(mǎi)于廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)體重35～40 g，飼養(yǎng)于遵義醫(yī)科大學(xué)珠海校區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，屏障環(huán)境動(dòng)物房(室溫22±1 ℃，12 h光照/12 h黑暗)，動(dòng)物許可證號(hào)為：[SCXK(粵)2013-0002]。

1.2 藥品與試劑 當(dāng)歸、白芍、川芎、紅花和丹參(廣州至信藥業(yè)股份有限公司)；葡萄籽提取物(原花青素含量為95%，天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開(kāi)發(fā)有限公司)；黃體酮注射液(浙江仙珺制藥股份有限公司)；超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；酪氨酸酶(Tyr)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)；抗黑色素瘤特異抗體(HMB45)(福建邁新生物有限公司)；DAB試劑盒(康為世紀(jì)生物科技有限公司)；8% Na2S水溶液(廣州化學(xué)試劑廠)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 波長(zhǎng)為320 nm，功率為15瓦的紫外線(xiàn)燈(深圳市冠雅光科技有限公司)；奧林巴斯生物顯微鏡(日本OLYMPS公司)；組織切片機(jī)(RM2235型，德國(guó)萊卡公司)；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(WLX800UV，美國(guó)寶特)；GZX-9070 MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)；生物組織自動(dòng)包埋機(jī)(TB-718E型)、智能程控生物組織自動(dòng)脫水機(jī)(TC-120型)(湖北泰維科技實(shí)業(yè)有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 將40只體重為35～40 g的昆明種SPF級(jí)雌性小鼠(購(gòu)買(mǎi)于廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、桃紅四物湯加減方低劑量組和高劑量組，每組各10只，分別對(duì)各組稱(chēng)重并標(biāo)記，分籠飼養(yǎng)。

1.4.2 模型制備 參照文獻(xiàn)報(bào)道的方法[4]，采用注射黃體酮配合紫外線(xiàn)照射法進(jìn)行造模。用電動(dòng)剃須刀配合8%Na2S水溶液將小鼠背部的毛剃干凈，使面積約3 cm×3 cm的背部皮膚充分暴露出來(lái)，每3天處理1次。對(duì)照組注射生理鹽水，其余3組每日按劑量20 mg/kg注射黃體酮，注射部位為小鼠后肢根部肌肉，兩側(cè)輪替注射。同時(shí)，采用黃褐斑動(dòng)物模型構(gòu)建用的紫外線(xiàn)照射裝置[5]，以波長(zhǎng)為320 nm的中波紫外線(xiàn)每日照射小鼠30 min，連續(xù)照射30 d。

1.4.3 給藥方式 復(fù)方由當(dāng)歸、白芍、川芎、紅花、丹參經(jīng)水提后加入葡萄籽提取物混合而得。中藥比例為，當(dāng)歸∶白芍∶川芎∶紅花∶丹參比例為1.5∶2∶1∶1∶1.5。水提物干重占原藥材干重約為39.8%。葡萄籽提取物每日用量相當(dāng)于原花青素0.19 g。在造模的同時(shí)均對(duì)各組進(jìn)行灌胃給藥，對(duì)照組和模型組給予等量蒸餾水，藥物處理組按照桃紅四物湯加減方的低劑量組(0.94 g/kg)和高劑量組(2.82 g/kg)每日給藥1次，連續(xù)30 d。

1.4.4 小鼠血清各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè) 最后1次給藥結(jié)束后，禁食12 h，用8%Na2S水溶液配合電動(dòng)剃須刀將小鼠背部毛剃干凈后，使用10%水合氯醛麻醉小鼠。待小鼠進(jìn)入麻醉安樂(lè)死后，隨后摘除眼球取血于抗凝采血管中，放置于4 ℃冰箱中過(guò)夜，4 ℃，1 000 g離心10 min，取上清液部分，按照試劑盒的說(shuō)明書(shū)操作，進(jìn)行小鼠血清SOD活性和MDA及Tyr含量的檢測(cè)。

1.4.5 小鼠肝臟各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè) 將取完血的實(shí)驗(yàn)小鼠安樂(lè)死后，取約0.1 g的肝臟組織放入玻璃勻漿器中，加入0.9 mL生理鹽水進(jìn)行勻漿，將溶液裝入1.5 mL EP管中，在轉(zhuǎn)速為10 000 g的4 ℃離心機(jī)中離心10 min，取上清部分，于-20 ℃保存?zhèn)溆?，按照試劑盒的說(shuō)明書(shū)，進(jìn)行肝臟SOD活性和MDA及Tyr含量的檢測(cè)。

1.4.6 HE染色 取面積約1 cm×1 cm的小鼠背部皮膚置于4%多聚甲醛(PFA)的EP管中進(jìn)行固定，于4 ℃冰箱中放置12 h，用常規(guī)石蠟包埋切片，按照?qǐng)?bào)道的方法[6]，進(jìn)行HE染色，用顯微鏡觀察小鼠皮膚中病理形態(tài)學(xué)變化。

1.4.7 免疫組織化學(xué) 分別取各組小鼠背部去毛皮膚1塊(1 cm×1 cm)，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，再經(jīng)烤片、脫蠟水化和抗原修復(fù)液(枸櫞酸鹽溶液)修復(fù)，按照試劑盒說(shuō)明，用HMB45抗體孵育后，然后孵育二抗，接著用DAB顯色液進(jìn)行顯色。同時(shí)，用PBS替代一抗，設(shè)立陰性對(duì)照組。皮膚組織切片有明確棕黃色著色或褐色為陽(yáng)性表達(dá)。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行拍照。然后用圖像分析軟件IPP 6.0(Image-Pro Plus 6.0)對(duì)全圖進(jìn)行光密度分析，分析每張圖片的積分光密度(IOD)值，用于觀察皮膚中黑色素沉著變化。隨后用蘇木素對(duì)切片進(jìn)行復(fù)染，拍照。

2 結(jié)果

2.1 桃紅四物湯加減方對(duì)小鼠血清和肝臟的SOD活性及Tyr和MDA含量的影響 由表1可見(jiàn)，與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清中的SOD活性明顯降低，Tyr和MDA含量顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，桃紅四物湯加減方低、高劑量處理組血清中SOD活性升高，其中高劑量組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；低、高劑量組的血清中Tyr含量均有降低，其中高劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；桃紅四物湯加減方處理組的低劑量組MDA活性降低，其中低劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

表1 桃紅四物湯加減方對(duì)黃褐斑模型小鼠血清SOD活性及Tyr和MDA含量的影響

由表2可見(jiàn)，與對(duì)照組對(duì)比，模型組小鼠肝臟中的SOD活性顯著降低，Tyr和MDA含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，桃紅四物湯加減方組的低、高劑量組小鼠肝臟中SOD活性均升高，但與模型組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；桃紅四物湯加減方的低、高劑量組肝臟中Tyr和MDA含量均降低且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 桃紅四物湯加減方對(duì)黃褐斑模型小鼠肝臟的SOD活性及Tyr和MDA含量的影響

2.2 桃紅四物湯加減方對(duì)小鼠黃褐斑部位皮膚病理學(xué)的影響 由圖1可知，對(duì)照組小鼠皮膚的表皮層的上皮細(xì)胞排列整齊、無(wú)明顯增生。模型組小鼠皮膚表皮的上皮層細(xì)胞增生明顯，細(xì)胞核變圓且排列紊亂。與模型組相比，桃紅四物湯加減方的低和高劑量組小鼠皮膚上皮層細(xì)胞病變有所改善，上皮細(xì)胞增生少，細(xì)胞核排列規(guī)則。

A:對(duì)照組；B:模型組；C：低劑量組；D：高劑量組。

2.3 小鼠皮膚HMB45表達(dá)情況 抗黑色素瘤抗體HMB45可鑒別含黑色素的病變組織，用該抗體檢測(cè)桃紅四物湯加減方對(duì)皮膚黑色素的干預(yù)作用。免疫組織化學(xué)結(jié)果(見(jiàn)圖2和表3)顯示，模型組所有的小鼠基底細(xì)胞及棘細(xì)胞層中出現(xiàn)大量棕黃色物質(zhì)(如箭頭所示)，呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)。與對(duì)照組比較，IOD值增大，著色變深，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，而皮膚中黑色素細(xì)胞顯著增多是黃褐斑模型的直接證據(jù)[4]，表明黃褐斑小鼠模型建立成功。相比之下，桃紅四物湯加減方的低劑量組，基底細(xì)胞及棘細(xì)胞層中可見(jiàn)少數(shù)棕黃色物質(zhì)，較模型組有一定減少，與模型組比較，IOD值減小且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；桃紅四物湯加減方的高劑量組：基底細(xì)胞及棘細(xì)胞層中可見(jiàn)少量棕黃色物質(zhì)，較模型組減少很多，接近于對(duì)照組，與模型組比較，IOD值明顯減小，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。以上結(jié)果提示，該桃紅四物湯加減方能有效減少黑色素細(xì)胞的形成，對(duì)黃褐斑模型小鼠有一定的預(yù)防作用。

A:對(duì)照組；B:模型組；C：低劑量組；D：高劑量組。

表3 小鼠皮膚HMB45免疫組化染色的積分光密度變化

3 討論

黃褐斑為兩頰和額等面部色素過(guò)度沉著形成的一種皮膚病，嚴(yán)重影響患者的容貌。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，桃紅四物湯加減方低、高劑量組的SOD活性均升高，MDA和Tyr含量均降低，皮膚中黑色素減少。表明該方水提物對(duì)小鼠的黃褐斑模型具有一定的防治作用，可能與降低Tyr的含量，提高SOD活性，減少M(fèi)DA的產(chǎn)生，進(jìn)而減少黑色素細(xì)胞數(shù)量有關(guān)，為防治黃褐斑提供科學(xué)依據(jù)。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為黃褐斑的發(fā)生與人體內(nèi)肝、脾、腎的代謝失調(diào)，導(dǎo)致的氣血不順，血瘀阻塞有關(guān)[7]。中藥治黃褐斑的理論是調(diào)節(jié)臟器代謝，祛除血瘀，疏通經(jīng)脈，具有一定的優(yōu)勢(shì)。最近的系統(tǒng)綜述分析表明，中藥通過(guò)調(diào)節(jié)與黑色素生成相關(guān)的基因或信號(hào)通路，對(duì)黑色素的生成具有多層次的抑制作用，對(duì)于防治皮膚色素異常具有重要的臨床價(jià)值[8]。目前，已有多種復(fù)方中藥用于黃褐斑的防治且取得良好療效的報(bào)道。古代經(jīng)典名方桃紅四物湯始見(jiàn)于《醫(yī)宗金鑒》，具有活血化瘀和養(yǎng)血消斑等功能，對(duì)黃褐斑有一定的治療效果[9]。然而，桃紅四物湯在防治黃褐斑方面，由于其療效和安全性尚有不足，有待于進(jìn)一步的改進(jìn)。本研究所用的中藥組方，以桃紅四物湯的配方為基礎(chǔ)，將生地?fù)Q為丹參，桃仁換為葡萄籽，保留當(dāng)歸、川芎、白芍和紅花。以此六種藥合用，具有活血祛瘀、疏肝益氣之功效，從中醫(yī)理論思考，對(duì)黃褐斑有整體的預(yù)防作用。

黃褐斑的具體確切發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，但是研究者們發(fā)現(xiàn)其發(fā)生與多種因素有關(guān)。首先，黑色素的含量及其活性對(duì)黃褐斑的嚴(yán)重程度有顯著影響[10]。在酪氨酸酶的作用下，以酪氨酸為底物，生成多巴，多巴進(jìn)一步被氧化生成多巴醌，并最終通過(guò)絡(luò)氨酸酶氧化成黑色素[11]。其次，酪氨酸酶是產(chǎn)生黑色素的速度限制酶，其含量升高，黑色素生成增加。然后，這一系列的氧化反應(yīng)會(huì)破壞體內(nèi)氧化和抗氧化反應(yīng)的平衡，產(chǎn)生過(guò)量的氧自由基，造成SOD等抗氧化酶活性的下降，導(dǎo)致膜脂質(zhì)過(guò)氧化，分解生成醛類(lèi)，即丙二醛含量增加。此外，紫外線(xiàn)能提高酪氨酸酶活性和黑色素含量，而雌激素則可以提高黑色素細(xì)胞增殖率、酪氨酸酶活性及黑色素細(xì)胞含量[12]，因此我們選擇小鼠后腿根部肌肉注射黃體酮聯(lián)合紫外線(xiàn)照射制造黃褐斑小鼠模型，在一定程度上能模擬人體的發(fā)病與病理變化。本實(shí)驗(yàn)采用該小鼠黃褐斑模型，發(fā)現(xiàn)桃紅四物湯加減方能顯著升高血清和肝臟中的SOD活性，降低Tyr含量，減少皮膚酪氨酸酶的表達(dá)，可能是預(yù)防黃褐斑發(fā)生的作用機(jī)制之一。

綜上所述，本研究以中醫(yī)藥傳承和創(chuàng)新的研究思路為指導(dǎo)，對(duì)桃紅四物湯的組方進(jìn)行調(diào)整，發(fā)現(xiàn)其對(duì)注射黃體酮聯(lián)合紫外致黃褐斑小鼠模型具有較好的預(yù)防效果，其機(jī)制可能與降低酪氨酸酶含量，提高超氧化物酶活性，維持體內(nèi)氧化反應(yīng)平衡，減少黑色素的形成有關(guān)。其次，組方的原料均屬于國(guó)家衛(wèi)計(jì)委公布的中藥范圍，可用于一般食品和保健食品，安全隱患較小。鑒于該組方具有安全有效的特點(diǎn)，值得在臨床上推廣應(yīng)用。同時(shí)，本研究還拓展了中藥防治黃褐斑的配方，為臨床預(yù)防黃褐斑提供科學(xué)依據(jù)。