非洲豬瘟診斷方法的研究進展

1 ASF病原學檢測

1.1 紅細胞吸附（HAD）試驗紅細胞吸附現(xiàn)象最早發(fā)現(xiàn)于1969年，是在病毒感染巨噬細胞過程中的出現(xiàn)的一種自然現(xiàn)象。感染了非洲豬瘟病毒的巨噬細胞會吸附在豬的紅細胞表面，呈現(xiàn)出典型的“玫瑰花環(huán)”的形狀。這種技術手段的靈敏度和特異性都很好，但是操作繁瑣、對技術水平要求較高。目前已經(jīng)有研究表明，有一些ASFV毒株不具有紅細胞的吸附特性，對于這類毒株，用紅細胞吸附試驗就無法進行檢測。

1.2 PCR技術目前，PCR技術是檢測ASFV最為常用的檢測手段，也是世界動物衛(wèi)生組織指定的ASFV的檢測方法。該技術是一種操作便捷、檢測效率較高的分子生物學方法，只需要針對不同的基因片段設計相應的特異性引物，就可以快速檢測出目的基因。具有快速檢測、特異性強、靈敏度高的特點，并且對樣品的純度、血液樣品及組織的保存方式要求較低。

ASFV是雙鏈線性的DNA病毒，其基因組全長為170～190kb，利用ASFV VP73基因的高保守片段序列設計出特異性引物，在通過優(yōu)化PCR反應的條件，組裝了非洲豬瘟病毒的PCR檢測試劑盒，該試劑盒的檢測靈敏度高達0.1fg，利用雙重PCR技術建立了檢測非洲豬瘟和豬瘟的方法，最低檢出量均可達到100pg。

1.3 熒光定量PCR技術實時熒光定量PCR技術是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號實時在線檢測整個PCR反應進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的一種核酸定量檢測技術。該技術與常規(guī)PCR相比，具有特異性強，自動化程度高，并且可以有效解決常規(guī)PCR污染等問題。

自2009年以來，我國多人陸續(xù)建立了多種熒光PCR法檢測非洲豬瘟病毒。2010年，基于ASFV的VP73基因的保守區(qū)域，設計了特異性引物和Taqman探針，建立了非洲豬瘟熒光PCR檢測方法，該方法的最低檢測限為10個拷貝數(shù)/μL，與OIE推薦的熒光PCR檢測方法靈敏度和特異性均相當。

利用ASFVCP530R基因的高保守序列，設計1對特異性引物和探針，建立了檢測ASFV的TaqMan-MGB探針實時熒光PCR方法，該檢測方法最低檢測限為61個拷貝數(shù)/μL，利用該方法進行重復性檢測，4次檢測的變異系數(shù)均小于2.0%。通過對38份豬肉標本和126份進口豬的血液標本進行ASFV檢測，結果均為陰性。

2 ASF血清學檢測

2.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）ELISA技術作為目前國內(nèi)外應用最為廣泛的血清學診斷方法，具有快速靈敏、準確性高的優(yōu)點，并且可以用于大規(guī)模樣品的排查和疫病的監(jiān)測。但是該方法具有一定的局限性，沒有辦法檢測出早期的ASFV感染。依據(jù)Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)，表達出ASFV P54蛋白，經(jīng)過各反應條件的優(yōu)化，建立了檢測ASFV血清抗體的間接ELISA方法，該方法檢測ASFV的靈敏度可達1∶320，并且具有操作簡單、特異性強的特點。

2.2 膠體金免疫層析(GICA)法膠體金免疫層析(GICA)法的原理是將膠體金作為示蹤標志物，應用于抗原抗體檢測的一種新型的免疫標記技術。該技術具有較高的靈敏度，并且易于操作，適合在大規(guī)模排查中使用。通過利用 ASFV的p54蛋白抗原，成功建立了P54抗體膠體金檢測法，制備了P54快速檢測膠體金試紙條，該試紙條具有特異性強、靈敏度高的優(yōu)點，非常適合用于基層疫病防控中。

綜上所述，非洲豬瘟是一種傳染性很強的出血性病毒傳染病，目前還未研制出有效疫苗。該種疫病一旦在我國發(fā)展蔓延，會對我國的生豬養(yǎng)殖業(yè)及相關產(chǎn)業(yè)造成重大的沖擊。隨著我國畜牧業(yè)快速發(fā)展，防疫人員的數(shù)量和專業(yè)素質無法滿足日益嚴重的防疫工作，一定程度上制約我國畜牧業(yè)持續(xù)健康發(fā)展。因此，快速靈敏的ASFV檢測技術在我國基層的疫病檢測中發(fā)展前景良好。隨著我國對非洲豬瘟疫情的嚴防嚴控力度的不斷加強，ASFV檢測技術也將會不斷發(fā)展和完善，為我國進一步開展ASFV的監(jiān)測和防控奠定技術基礎。