miR-702-3p對(duì)心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷后凋亡的影響

宮能靜,姜玉玉,李小雨,高嬌嬌,程向陽

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院麻醉科,蚌埠 233030;*通訊作者,E-mail:yxhyhr@163.com)

急性心肌梗死是世界范圍內(nèi)常見的心血管疾病[1]。梗死后血流量的恢復(fù)加重了組織和器官的損傷,稱為缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷[2]。體內(nèi)和體外的研究顯示,I/R損傷的潛在機(jī)制包括氧化應(yīng)激、線粒體功能受損,自由基產(chǎn)生過多,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[3-5]。到目前為止,尚無有效的預(yù)防心肌I/R損傷的治療方法。因此,充分理解I/R損傷的復(fù)雜分子機(jī)制,尋找有效的克服I/R損傷后細(xì)胞凋亡的方法仍需要很大的努力。

miRNAs是一類高度保守的非編碼RNA,通過在轉(zhuǎn)錄后水平抑制基因的表達(dá),參與了幾乎所有細(xì)胞過程[6]。越來越多的證據(jù)表明,miRNA表達(dá)失調(diào)與多種人類心血管疾病有關(guān),包括心肌I/R損傷[7]。例如,miR-873通過Egln3而抑制H/R心肌細(xì)胞凋亡[8];過表達(dá)miR-124-3p可下調(diào)RIPK1表達(dá),減輕心肌細(xì)胞H/R損傷,從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用[9]。這些miRNA可能成為缺血性心臟病治療的潛在靶點(diǎn)。有研究表明,在肺動(dòng)脈高壓大鼠的左右心室組織中,miR-702-3p表達(dá)升高[10],然而miR-702-3p在心肌梗死中的作用卻未見報(bào)道。

乙醛脫氫酶2(aldehyde dehydrogenase 2,ALDH2)是線粒體中重要的ALDH家族成員,其對(duì)心臟的保護(hù)作用已在各種模型中得到證實(shí),包括心肌急性缺血/再灌注損傷[11,12]。通過靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站Targetscan,預(yù)測(cè)ALDH2可能是miR-702-3p的靶基因。前期的研究表明,心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-702-3p inhibitor后ALDH2蛋白的表達(dá)升高,然而,miR-702-3p是否通過ALDH2調(diào)控心肌梗死后細(xì)胞凋亡仍不清楚。在本研究通過構(gòu)建缺氧/復(fù)氧(H/R)心肌細(xì)胞體外模型研究miR-702-3p在心肌I/R損傷過程中的抗凋亡作用,并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑

1-3日齡雄性SD大鼠乳鼠,SPF級(jí),購于蚌埠醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,合格證號(hào):20180004002485。Ⅱ型膠原酶購自北京solarbio公司;Lipofectamin 2000轉(zhuǎn)染試劑、Trizol試劑購自美國(guó)Invitrogen公司;聚偏二氟乙烯膜(PVDF)購自美國(guó)Milipore公司;miR-702-3p抑制物(inhibitor),miR-702-3p引物購自上海吉瑪公司;RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量試劑盒均購自廣州GeneCopoeia公司;雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒載體購自美國(guó)Promega公司;Annexin Ⅴ-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自碧云天生物公司;兔多克隆抗ALDH2抗體購自美國(guó)Abcam公司;兔多克隆抗Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3、GAPDH抗體購自美國(guó)Affinity公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗購自Biosharp公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將1-3日齡乳鼠置于75%酒精浸泡消毒2 min,無菌取心尖組織,以預(yù)冷PBS清洗3次,剪成約1 mm3大小的碎塊,經(jīng)含0.08%胰蛋白酶和1%Ⅱ型膠原酶的混合酶37 ℃消化5 min,輕輕吹打后收集細(xì)胞懸液;同法反復(fù)消化4-5次,取各次的細(xì)胞懸液與等體積含20%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基混勻終止消化,以900 r/min離心5 min,棄掉上清,將沉淀與含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基混合,用200目濾網(wǎng)過濾后將懸液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶,于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)90 min進(jìn)行差速貼壁后,吸取細(xì)胞懸液,以密度為5×105接種于6孔板,同時(shí)加入0.1 mmol/L Brdu(抑制心肌成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)),置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔24 h換液,待細(xì)胞密度達(dá)到70%時(shí),進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型的建立

待細(xì)胞密度為70%左右時(shí),建立缺氧/復(fù)氧模型。吸棄6孔板中的培養(yǎng)基,PBS沖洗2次,換無糖DMEM培養(yǎng)基,置入含1%O2和5%CO2的缺氧培養(yǎng)箱,在37 ℃條件下缺氧3 h,然后將6孔板取出,置換DMEM/F12完全培養(yǎng)液,并于5% CO2,37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h進(jìn)行復(fù)氧處理[13]。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期心肌細(xì)胞,將細(xì)胞隨機(jī)分為正常對(duì)照組(CON)、缺氧復(fù)氧組(H/R)、H/R+miR-702-3p inhibitor NC轉(zhuǎn)染組(H/R+inhibitor NC)、H/R+miR-702-3p inhibitor轉(zhuǎn)染組(H/R+inhibitor)。參照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說明書向心肌細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-702-3pinhibitor NC及miR-702-3pinhibitor,轉(zhuǎn)染6 h后將培養(yǎng)基更換為含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h進(jìn)行H/R處理。H/R處理完成后即可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)心肌細(xì)胞活力

將原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞用胰蛋白酶消化并重懸,將細(xì)胞以5×103個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板,放入5% CO2,37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。各組進(jìn)行轉(zhuǎn)染及H/R處理后,每孔加入10 μl CCK-8溶液,37 ℃避光孵育2 h,酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處吸光度(OD)值。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

轉(zhuǎn)染及建立缺氧/復(fù)氧損傷模型后,收集各組心肌細(xì)胞,加入195 μl Annexin Ⅴ-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度(1×106個(gè)/ml),吸取1 ml細(xì)胞懸液加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC,混勻后加入10 μl碘化丙啶染色液,輕輕混勻,20-25 ℃避光孵育20 min,流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率。

1.7 qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-702-3p表達(dá)水平

轉(zhuǎn)染及建立缺氧/復(fù)氧損傷模型后,收集各組心肌細(xì)胞,利用Trizol提取細(xì)胞總RNA,定量后吸取1 μg總RNA產(chǎn)物,按照廣州GeneCopoeia公司miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板,按照廣州GeneCopoeia公司miRNA qPCR kit說明書進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng),反應(yīng)體系共20 μl,反應(yīng)條件如下:95 ℃預(yù)熱10 min(循環(huán)1次);95 ℃變性10 s,59 ℃退火20 s,72 ℃延伸10 s(循環(huán)40次)。以U6為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-702-3p的相對(duì)表達(dá)水平。

引物序列如下:miR-702-3p Forward:GCCGAGTGCCCACCCTTAC,Reverse:CTCAACTGGTGTCGTGGA;U6 Forward:GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT,Reverse:CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT。

1.8 Western blot檢測(cè)ALDH2、Bcl-2、Bax,cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá)

轉(zhuǎn)染及H/R造模后,收集各組心肌細(xì)胞,加入RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度。取30 μg總蛋白SDS-PAGE分離、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶封閉,孵育一抗,包括兔源ALDH2(1 ∶1 000)、兔源Bcl-2(1 ∶1 000)、兔源Bax(1 ∶1 000)和兔源GAPDH(1 ∶3 000),4 ℃孵育過夜,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1 ∶10 000)孵育1 h。ECL顯影,放入Western blot成像系統(tǒng)曝光,顯影。Image J軟件用來分析蛋白的相對(duì)表達(dá)水平,GAPDH作為內(nèi)參。

1.9 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

利用Targetscan分析miR-702-3p與ALDH2的3′UTR可能的結(jié)合位點(diǎn),將含有miR-702-3p結(jié)合位點(diǎn)野生型(wild type,WT)和突變型(mutant type,MUT)的ALDH2 3′UTR基因序列插入pGL3熒光素酶報(bào)告基因載體,分別構(gòu)建野生型(WT-ALDH2)與突變型(MUT-ALDH2)的ALDH2 3′UTR熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒載體,將WT-ALDH2、MUT-ALDH2分別與miR-702-3p mimics、miR-NC共轉(zhuǎn)染48 h收集細(xì)胞,采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間比較采用t檢驗(yàn),兩組以上比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H/R處理對(duì)心肌細(xì)胞中miR-702-3p表達(dá)的影響

采用qRT-PCR檢測(cè)miR-702-3p在H/R處理后的表達(dá)情況。與對(duì)照組相比,H/R組miR-702-3p的表達(dá)水平顯著升高(P<0.01,見圖1)。

與對(duì)照組相比,* * P <0.01圖1 H/R處理后心肌細(xì)胞中miR-702-3p的相對(duì)表達(dá)Figure 1 Relative expression of miR-702-3p in cardiomyocytes after H/R treatment

2.2 miR-702-3p對(duì)心肌細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡的影響

為了確定miR-702-3p在細(xì)胞活力和凋亡中的作用,通過轉(zhuǎn)染miR-702-3p inhibitor,使miR-702-3p表達(dá)下調(diào)。結(jié)果顯示,miR-702-3p inhibitor轉(zhuǎn)染顯著降低了心肌細(xì)胞中miR-702-3p的表達(dá)水平(P<0.01,見圖2A)。CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-702-3p下調(diào)對(duì)細(xì)胞活力的影響,結(jié)果表明,miR-702-3p下調(diào)可以顯著減輕H/R處理對(duì)細(xì)胞活力的影響(P<0.05,見圖2B),而轉(zhuǎn)染miR-702-3p NC對(duì)H/R處理心肌細(xì)胞的生存能力并沒有影響。此外,利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)miR-702-3p下調(diào)后心肌細(xì)胞的凋亡率,結(jié)果表明,缺氧顯著升高了心肌細(xì)胞的凋亡,而轉(zhuǎn)染miR-702-3p inhibitor后,心肌細(xì)胞凋亡率顯著下降;轉(zhuǎn)染miR-702-3p NC對(duì)細(xì)胞凋亡并沒有影響(見圖3)。

圖2 miR-702-3p對(duì)心肌細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡的影響Figure 2 The effect of miR-702-3p on cardiomyocyte viability and apoptosis

圖3 miR-702-3p inhibitor對(duì)H/R處理心肌細(xì)胞凋亡的影響Figure 3 Effect of miR-702-3p inhibitor on apoptosis of cardiomyocytes after H/R treatment

2.3 miR-702-3p對(duì)心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白和ALDH2蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示,心肌細(xì)胞在H/R處理后,Bax和cleaved Caspase-3表達(dá)升高,Bcl-2表達(dá)下降,ALDH2表達(dá)降低。在H/R刺激的心肌細(xì)胞中,miR-702-3p inhibitor轉(zhuǎn)染顯著逆轉(zhuǎn)了H/R刺激引起的變化(見圖4)。

圖4 Western blot檢測(cè)心肌細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白和ALDH2蛋白的表達(dá)Figure 4 Expression of apoptosis-related proteins and ALDH2 in cardiomyocytes after different treatment by Western blot

2.4 miR-702-3p與ALDH2 3′UTR的作用關(guān)系

通過TargetScan預(yù)測(cè)ALDH2為miR-702-3p的靶基因(見圖5A)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示,共轉(zhuǎn)染miR-702-3p mimics、WT-ALDH2組的熒光素酶活性明顯降低(P<0.01);而共轉(zhuǎn)染miR-702-3p、MUT-ALDH2組的熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05,見圖5B)。

圖5 ALDH2是miR-702-3p的靶基因Figure 5 ALDH2 is a target gene of miR-702-3p

3 討論

心肌缺血后血流量的恢復(fù)加重了組織和器官的損傷,稱為心肌缺血再灌注(I/R)損傷[2]。凋亡被認(rèn)為是心肌I/R損傷的主要病理生理機(jī)制之一,并被認(rèn)為是導(dǎo)致心肌I/R損傷后細(xì)胞死亡的主要因素[14]。調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是一種很有前途的心血管疾病治療策略。心肌細(xì)胞為終末分化細(xì)胞,其凋亡后導(dǎo)致的心肌損傷是不可逆的。本研究證實(shí)了在H/R條件下,細(xì)胞凋亡明顯增加。

miRNA已經(jīng)成為多種心血管疾病過程中的重要介質(zhì),可能成為心血管疾病的治療靶點(diǎn)[15]。許多miRNA,如miR-26a-5p[16]和miR-30b-5p[17]都與心肌I/R損傷有關(guān)。據(jù)報(bào)道,miR-702-3p在丙泊酚麻醉的腦組織以及在肺動(dòng)脈高壓的大鼠心肌組織中表達(dá)升高[10,18]。因此,我們推測(cè)miR-702-3p可能在心肌I/R損傷中發(fā)揮作用。本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)研究了H/R條件下miR-702-3p在心肌細(xì)胞中的作用。將心肌細(xì)胞進(jìn)行H/R處理模擬心肌I/R損傷,結(jié)果顯示,在H/R條件下miR-702-3p表達(dá)顯著升高。下調(diào)miR-702-3p可以減輕缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷,細(xì)胞活力增加,凋亡率降低,提示下調(diào)miR-702-3p在H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中具有保護(hù)作用。

識(shí)別靶基因?qū)沂緈iR-702-3p功能的分子機(jī)制具有重要意義。本研究表明,下調(diào)miR-702-3p后ALDH2蛋白表達(dá)相應(yīng)升高。ALDH2是一種抗凋亡酶[11],據(jù)報(bào)道,ALDH2廣泛表達(dá)于心臟,對(duì)心肌I/R損傷具有心臟保護(hù)作用[11,19]。在本研究中,H/R處理的心肌細(xì)胞ALDH2表達(dá)下降,與先前的結(jié)果一致。降低miR-702-3p表達(dá)時(shí)ALDH2表達(dá)升高,并且可以顯著減弱H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡,提高細(xì)胞活力。此外,雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示,ALDH2是miR-702-3p的靶基因。這更證實(shí)了我們的想法。然而,本實(shí)驗(yàn)的缺陷在于,需要進(jìn)一步進(jìn)行回復(fù)實(shí)驗(yàn),來驗(yàn)證miR-702-3p降表達(dá)后同時(shí)降表達(dá)ALDH2,能否逆轉(zhuǎn)miR-702-3p的心肌保護(hù)作用。我們將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行驗(yàn)證。

總之,本研究表明,ALDH2是miR-702-3p的靶基因,降低miR-702-3p后ALDH2表達(dá)升高,心肌細(xì)胞凋亡率降低。因此,調(diào)控miR-702-3p表達(dá)可以在一定程度上為缺血再灌注損傷提供治療策略。