芝麻粕植酸的超聲波輔助提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

錢森和，鄭 鵬，周 炎，胡劉秀，王 洲，薛正蓮

(1.安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000； 2.蕪湖張恒春藥業(yè)有限公司，安徽 蕪湖 241000)

植酸(Phytic acid)，又名環(huán)己醇六磷酸酯，是一種有機磷酸類化合物，是植物種子中磷的主要來源[1]。植酸廣泛存在于植物的種子、根和莖中，其中以豆科植物的種子、谷物的麩皮和胚芽中含量最高[2]。植酸呈無色或淡黃色，是一種無味稠狀液體，易溶于水、乙醇，不溶于醚等有機溶劑[3]。由于植酸無毒副作用、安全可靠，在食品抗氧化劑、穩(wěn)定劑、護(hù)色劑、保鮮劑等方面應(yīng)用廣泛；在醫(yī)藥工業(yè)中可用于治療糖尿病、腎結(jié)石等病癥；另外，植酸可以作為肌醇生產(chǎn)的重要原料[4]。

芝麻粕是芝麻制油的副產(chǎn)物，我國是芝麻生產(chǎn)大國，芝麻粕產(chǎn)量較大，而芝麻生產(chǎn)企業(yè)大多將芝麻粕作為廉價肥料或基質(zhì)出售，很大程度上降低了芝麻生產(chǎn)的附加值[5-6]。芝麻粕中不僅含有大量的蛋白質(zhì)、木脂素、纖維素和維生素類物質(zhì)，而且還含有豐富的植酸類物質(zhì)，是提取植酸的良好原料[7-8]。目前，芝麻粕中蛋白質(zhì)、活性肽、木脂素的提取及其功能研究較多，而芝麻粕中植酸提取的研究鮮有報道[9-10]。因此，本文以芝麻粕為材料，利用單因素試驗和響應(yīng)面試驗優(yōu)化植酸的超聲波輔助提取工藝，并對提取的植酸進(jìn)行還原力及DPPH自由基、羥自由基清除能力測定，以期為芝麻粕中植酸的開發(fā)利用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

芝麻粕，由水代法制油得到，取自蕪湖市同順和小磨麻油食品廠，其含水量為12.1%、粗灰分含量為12.2%(干基)、粗蛋白質(zhì)含量為37.8%(干基)、粗脂肪含量為4.1(干基)、植酸含量為3.8%(干基)，粉碎后過100目篩。三氯化鐵、三氯乙酸、磺基水楊酸、鐵氰化鉀、DPPH、鄰二氮菲、VC、醋酸，分析純。

TU-1800紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；FC104電子天平，上海精密科學(xué)儀器公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇金壇市億通電子有限公司；PHSJ-3F酸度計，上海雷磁儀器廠；TGL-16型離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 植酸的提取

稱取10 g粉碎過篩的芝麻粕于250 mL具塞三角瓶中，按一定的料液比加入一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的醋酸溶液，在不同的超聲波功率下超聲處理不同時間，然后在一定提取溫度條件下提取一定時間，隨后3 000 r/min離心10 min，測定提取液中植酸含量。不同處理試驗重復(fù)3次，下同。

1.2.2 提取液中植酸含量的測定

取植酸提取液25 mL，調(diào)節(jié)pH至1.8～2.5，在水浴上加熱至60℃，加10滴10%磺基水楊酸溶液，用0.02 mol/L三氯化鐵溶液滴定至紫紅色，按下式計算植酸質(zhì)量。

m=c×V×0.235 7

式中：m為植酸質(zhì)量，g；c為三氯化鐵溶液質(zhì)量濃度，mol/L；V為滴定耗去的三氯化鐵溶液量，mL；0.235 7為換算系數(shù)，由每摩爾植酸可絡(luò)合2.8 mol FeCl3換算得到。

植酸提取率=提取液中植酸質(zhì)量/(芝麻粕質(zhì)量×芝麻粕中植酸含量)×100%。

1.2.3 還原力的測定

取植酸提取液0.5 mL于試管中，加入pH為6.6的0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液和1.0%鐵氰化鉀溶液各2.5 mL，充分混勻后50℃保溫20 min，置于冰浴中冷卻，隨后加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液，混合后3 000 r/min離心10 min。取上清液2.5 mL，加入0.1%三氯化鐵溶液0.5 mL和蒸餾水2 mL，混勻后靜置10 min，測定其在700 nm處的吸光值[11]。

1.2.4 DPPH自由基清除率的測定

取1 mL樣品與4 mL 0.02 mmol/L DPPH-無水乙醇溶液混合，混勻后在室溫條件下避光放置30 min，混合液于3 000 r/min離心5 min，取上清液，測定517 nm處的吸光值，用體積比1∶1的無水乙醇與水混合液作為參比[12]。

C=[1-(A1-A2)/A0]×100%

式中：C為DPPH自由基清除率；A0為空白對照(DPPH-無水乙醇)的吸光值；A1為加入樣品時DPPH(樣品+DPPH-無水乙醇)的吸光值；A2為樣品(樣品+無水乙醇)的吸光值。

1.2.5 羥自由基清除率的測定

取7.5 mmol/L鄰二氮菲溶液0.2 mL、7.5 mmol/L FeSO4溶液0.2 mL、pH 7.4 PBS溶液2.0 mL、1.0%H2O20.4 mL、樣品溶液0.4 mL、蒸餾水0.8 mL于試管中并充分混勻，置于37℃的恒溫水浴60 min后，測定其在536 nm處的吸光值[13]。

COH=(A2-A0)/(A1-A0)×100%

式中：COH為羥自由基的清除率；A0為蒸餾水代替樣品測得的吸光值；A1為蒸餾水代替H2O2測得的吸光值；A2為加入樣品的吸光值。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和作圖，SAS 9.1統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計及其回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 超聲波功率對植酸提取的影響

在醋酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%、料液比1∶10、超聲波時間15 min、提取溫度50℃、提取時間60 min的條件下，考察超聲波功率對植酸提取的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 超聲波功率對芝麻粕植酸提取率的影響

由圖1可知，隨著超聲波功率的增大，植酸提取率逐漸升高，當(dāng)超聲波功率為270 W時，植酸提取率達(dá)到最大值，繼續(xù)增加超聲波功率，植酸提取率反而下降。超聲波產(chǎn)生的空化作用能夠有效地破壞細(xì)胞壁，從而有利于植酸的溶出，因此通過適當(dāng)功率的超聲波處理芝麻粕可以促進(jìn)植酸的提取。然而，超聲波功率過大，超聲波的空化作用增強，可能造成植酸的破壞，使得植酸的提取率降低[14]。因此，選擇超聲波功率為270 W較為適宜。

2.1.2 超聲波時間對植酸提取的影響

在醋酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%、料液比1∶10、超聲波功率270 W、提取溫度50℃、提取時間60 min條件下，考察超聲波時間對植酸提取的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 超聲波時間對芝麻粕植酸提取率的影響

由圖2可知，隨著超聲波時間的延長，植酸提取率逐漸升高，當(dāng)超聲波時間為20 min時，植酸提取率達(dá)最大值，而后隨著超聲波時間的繼續(xù)延長，植酸提取率反而下降。這是由于合適的超聲波時間，能夠有效地破碎細(xì)胞壁，使得溶出物增多，植酸提取率升高。而超聲波時間過長，可能會導(dǎo)致細(xì)胞壁纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)松散，從而使植酸進(jìn)入纖維素結(jié)構(gòu)中而不易溶出[15]。綜上，選擇超聲波功率270 W、超聲波時間20 min進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化試驗。

2.1.3 醋酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對植酸提取的影響

在超聲波功率270 W、超聲波時間20 min、料液比1∶10、提取溫度50℃、提取時間60 min條件下，考察醋酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對植酸提取的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，醋酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對植酸提取影響較大。隨著醋酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，植酸提取率逐漸增大，當(dāng)醋酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%時，植酸提取率達(dá)最大值。這可能是由于隨著醋酸濃度升高，植酸的絡(luò)合能力逐漸降低，溶出增多。但提取液的醋酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高，導(dǎo)致pH升高，使酸性多糖、蛋白質(zhì)等酸溶性成分游離出來，又重新與植酸結(jié)合成螯合狀態(tài)，從而使植酸的溶解度下降。因此，選擇醋酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%較為適宜。

圖3 醋酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對植酸提取率的影響

2.1.4 料液比對植酸提取的影響

在超聲波功率270 W、超聲波時間20 min、醋酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%、提取溫度50℃、提取時間60 min的條件下，考察料液比對植酸提取的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 料液比對植酸提取率的影響

由圖4可知，植酸提取率隨料液比的增加而增加。料液比較小，則芝麻粕不能被完全浸透，不能完全破壞植酸與其他物質(zhì)的結(jié)合，從而影響植酸的提取。若料液比過大，植酸提取率提高，但增加了后續(xù)濃縮工序，使得能耗增加。在料液比高于1∶15后，植酸提取率增加不明顯，因此選擇料液比1∶15較為適宜。

2.1.5 提取溫度對植酸提取的影響

在超聲波功率270 W、超聲波時間20 min、醋酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%、料液比1∶10、提取時間60 min的條件下，考察提取溫度對植酸提取的影響，結(jié)果見圖5。

由圖5可知：當(dāng)提取溫度低于50℃時，植酸提取率隨提取溫度的升高而升高，主要是因為分子動能的增大有利于植酸的提取；當(dāng)提取溫度高于50℃時，植酸提取率有所下降，可能是由于芝麻粕中蛋白質(zhì)等物質(zhì)的溶出，與具有6個磷酸根獨特結(jié)構(gòu)的植酸結(jié)合而沉淀，使得植酸提取率下降。因此，較適的提取溫度為50℃。

圖5 提取溫度對植酸提取率的影響

2.1.6 提取時間對植酸提取的影響

在超聲波功率270 W、超聲波時間20 min、醋酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%、料液比1∶10、提取溫度50℃的條件下，考察提取時間對植酸提取的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 提取時間對植酸提取率的影響

由圖6可知，在提取時間為15～90 min范圍內(nèi)，植酸提取率隨提取時間的延長而增加，當(dāng)提取時間長于90 min時，其提取率有所下降。這是由于芝麻粕中的植酸由固相遷移至提取液的過程是一個緩慢達(dá)到傳質(zhì)平衡的過程，因而隨著提取時間的延長，提取液中植酸含量增大。然而，在一個長時間低pH和較高反應(yīng)溫度條件下致使植酸在一定程度上發(fā)生氧化，從而導(dǎo)致提取率有所下降。因此，選擇最適提取時間為90 min。

2.2 響應(yīng)面試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken中心組合設(shè)計，對影響植酸提取過程中的醋酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)(X1)、料液比(X2)、提取溫度(X3)和提取時間(X4)4個因素設(shè)計四因素三水平中心組合試驗，響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表1，回歸模型分析見表2。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

從表2可以看出：響應(yīng)面模型P<0.05，說明該模型達(dá)到顯著水平；醋酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)、提取時間、料液比與提取時間的交互作用對植酸的提取具有顯著影響，醋酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的二次項、料液比的二次項對植酸的提取具有極顯著影響。提取時間對植酸提取率的影響最大，醋酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)次之，而提取溫度和料液比的影響較小。模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)(R2)為0.90，說明該回歸方程可以準(zhǔn)確地預(yù)測不同提取條件對植酸提取率的影響。

通過回歸分析，最優(yōu)點X1、X2、X3、X4對應(yīng)的代碼分別為0.084 471、0.224 161、0.298 996、0.805 674，其實際值為15.42%、1∶16.12、51.49℃、114.17 min，此時植酸提取率的最大理論擬合值為72.77%。在醋酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%、料液比1∶16、提取溫度51℃和提取時間115 min的條件下進(jìn)行驗證試驗，芝麻粕的植酸提取率為73.24%，與理論擬合值差別不大。

2.3 芝麻粕植酸抗氧化活性

2.3.1 植酸的還原力(見圖7)

圖7 芝麻粕植酸的還原力

由圖7可知，芝麻粕植酸的還原力略低于VC，但仍具有一定的還原力。隨著芝麻粕植酸質(zhì)量濃度的增加，其還原力逐漸增強；當(dāng)植酸質(zhì)量濃度達(dá)到80 μg/mL后，隨著其質(zhì)量濃度的進(jìn)一步增加，還原力變化不明顯。

2.3.2 植酸的DPPH自由基清除能力(見圖8)

圖8 芝麻粕植酸的DPPH自由基清除能力

由圖8可知，芝麻粕植酸的DPPH自由基清除能力略低于VC，當(dāng)質(zhì)量濃度為120 μg/mL時，VC的DPPH自由基清除率為89.1%，芝麻粕植酸的 DPPH 自由基清除率為68.2%，說明芝麻粕植酸仍具有一定的DPPH自由基清除能力。另外，隨著芝麻粕植酸質(zhì)量濃度的增加，其DPPH自由基清除率逐漸增加，當(dāng)植酸質(zhì)量濃度為100 μg/mL時，DPPH自由基清除率基本達(dá)到峰值。

2.3.3 植酸的羥自由基清除能力(見圖9)

圖9 植酸的羥自由基清除能力

由圖9可知，芝麻粕植酸的羥自由基清除能力與VC相當(dāng)，當(dāng)質(zhì)量濃度在20～100 μg/mL之間，其羥自由基清除率隨著質(zhì)量濃度的增加而增加，當(dāng)質(zhì)量濃度為120 μg/mL時，植酸和VC的羥自由基清除率分別為69.6%和67.8%。

3 結(jié) 論

采用超聲波輔助醋酸法提取芝麻粕植酸，采用單因素試驗和正交試驗對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對所提取植酸的抗氧化活性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，芝麻粕植酸的最佳提取工藝條件為超聲波功率270 W、超聲波時間20 min、醋酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%、料液比1∶16、提取溫度51℃、提取時間115 min，在此條件下芝麻粕植酸提取率為73.24%。芝麻粕植酸具有一定抗氧化活性，其最大還原力、DPPH自由基清除率和羥自由基清除率的植酸質(zhì)量濃度分別為80、100 μg/mL和120 μg/mL，其中當(dāng)植酸質(zhì)量濃度為120 μg/mL時，其羥自由基清除率與VC相當(dāng)。