響應(yīng)面法優(yōu)化小鼠急性衰老模型

劉詩(shī)音 尹鵬

(1長(zhǎng)春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，吉林 長(zhǎng)春 130031；2吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院)

建立科學(xué)的并能夠用于臨床研究衰老過(guò)程的動(dòng)物模型，對(duì)于現(xiàn)階段研究老年性相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制及致病原因十分重要。衰老動(dòng)物模型的建立，也是當(dāng)今醫(yī)藥企業(yè)研發(fā)抗衰老藥物、藥品的安全性檢查實(shí)驗(yàn)及藥品有效性檢定所必需的前提。自然衰老鼠模型具有最符合人類衰老特點(diǎn)的優(yōu)點(diǎn)，但這一模型存在一些不足：如老年鼠飼養(yǎng)條件及時(shí)間不統(tǒng)一、采購(gòu)價(jià)格昂貴、健康狀況參差不齊，實(shí)驗(yàn)過(guò)程死亡率高，在個(gè)體對(duì)藥物的吸收、代謝、分布上的變異性大。因此，鼠的人工衰老模型被廣泛使用并通過(guò)各種方法研究其制備工藝。人工衰老鼠模型是指通過(guò)人為因素致衰老，構(gòu)建符合實(shí)驗(yàn)要求的鼠模型〔1〕，主要方法包括D-半乳糖給藥法〔2〕、β淀粉樣蛋白注射法〔3〕、快速老化小鼠〔4〕、γ射線照射法〔5〕等。本文選擇γ射線照射法構(gòu)建衰老模型，此法是根據(jù)細(xì)胞衰老過(guò)程中的自由基理論，通過(guò)照射γ射線〔6〕，使小鼠體內(nèi)的丙二醛(MDA)含量持續(xù)在一個(gè)高水平，MDA指標(biāo)可以有效反映出氧化損傷的程度。隨著機(jī)體年齡的增大，MDA的含量呈明顯的上升趨勢(shì)，所以MDA的含量與機(jī)體衰老狀況顯著相關(guān)。

1 材料與方法

1.1材料 二級(jí)小鼠，由長(zhǎng)春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校食品藥品學(xué)院提供。

1.2方法

1.2.1小鼠急性衰老模型的制作〔7～10〕體重為(18±2)g的雄性二級(jí)小鼠 45只，根據(jù)隨機(jī)分組要求分為3組，每組各15 只。A 組為空白對(duì)照組，正常喂養(yǎng)；B組給予每只小鼠3.5 Gy 的全身照射(照射面積：25 cm×25 cm，照射源距動(dòng)物的高度：100 cm，每次照射時(shí)間：90 s)，每10 d 照射1次，共5次，總計(jì) 17.5 Gy； C 組給予每只小鼠6 Gy 的全身照射(照射面積：25 cm×25 cm，照射源距動(dòng)物的高度：80 cm，每次照射時(shí)間：90 s)，每15 d照射1次，共3次，總計(jì)18 Gy；所有小鼠普通飼料喂養(yǎng)，自由飲食，測(cè)量體重變化。飼養(yǎng)80 d后斷頭處死，取肝，并記錄重量。

1.2.2MDA的檢測(cè)〔11,12〕

1.2.2.1樣品的制作 取樣品20 μl，加入0.04 mol/L硫酸4.0 ml，加入10%磷烏酸500 μl，搖勻放置5 min后，3 000 r/min離心10 min，棄上清。加入0.04 mol/L硫酸2.0 ml，加入10%磷烏酸300 μl，搖勻放置5 min后，2 000 r/min離心10 min，棄上清。加雙蒸水1 ml，0.67%硫代巴比妥酸1 ml，混勻，水浴煮沸1 h后冷卻至室溫，加入正丁醇4.0 ml，震蕩抽提1 min，3 000 r/min離心10 min，取上清3.0 ml，測(cè)定熒光強(qiáng)度。

1.2.2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 分別取1 μmol/L MDA 標(biāo)準(zhǔn)品 1.000 00 ml、0.500 00 ml、0.250 00 ml、0.125 00 ml、0.062 50 ml、0.031 25 ml，不足1.000 00 ml的，用三蒸水補(bǔ)足至1.000 00 ml。

1.2.2.3空白溶液的制備 取三蒸水1 ml，加入硫代巴比妥酸1 ml，50℃水浴保存至測(cè)定。

1.2.3影響小鼠肝臟MDA含量的單因素實(shí)驗(yàn)〔13〕

1.2.3.1輻照吸收劑量對(duì)小鼠肝臟MDA含量的影響 照射面積：25 cm×25 cm，照射源距動(dòng)物的高度：80 cm，每次照射時(shí)間：90 s，每10 d 照射1次，共5次，輻照吸收劑量1.0 Gy、3.5 Gy、6.0 Gy時(shí)MDA的含量。

1.2.3.2輻照源距動(dòng)物高度對(duì)小鼠肝臟MDA含量的影響 3.5 Gy 全身輻照，照射面積：25 cm×25 cm，每次照射時(shí)間90 s，每10 d照射1次，共5次，照射源距動(dòng)物的高度為60 cm、80 cm、100 cm條件下MDA的含量。

1.2.3.3連續(xù)輻照時(shí)間對(duì)小鼠肝臟MDA含量的影響 3.5Gy全身輻照，照射面積：25 cm×25 cm，照射源距動(dòng)物的高度：80 cm，每次照射時(shí)間90 s，每5 d、10 d、15 d照射1次共5次照射時(shí)MDA的含量。

1.2.4響應(yīng)面優(yōu)化〔14，15〕在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取輻照吸收劑量、輻照源距動(dòng)物高度、連續(xù)輻照時(shí)間作為自變量，MDA含量為因變量。通過(guò)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化建立小鼠衰老模型的最佳條件。見表1。

表1 試驗(yàn)因素及水平表

1.2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析〔16，17〕采用Design-Expert8.0軟件處理數(shù)據(jù)，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果選取輻照吸收劑量、輻照源距動(dòng)物高度、連續(xù)輻照時(shí)間3個(gè)因素作試驗(yàn)因素，以MDA的含量為響應(yīng)值進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)做3次平行。通過(guò)考察F值(P<0.05)及每個(gè)具有顯著性的因素，通過(guò)回歸方程和響應(yīng)面分析每個(gè)因素之間的交互作用是否具有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠一般情況 A組小鼠的體重有所增加，B組和C組的小鼠體重增長(zhǎng)緩慢，并表現(xiàn)出行動(dòng)遲緩、狀態(tài)萎靡等現(xiàn)象；3只C組小鼠死亡。

2.2MDA含量變化 B組〔(12.78±1.21)mmol/mg〕、C組〔(12.31±1.77)mmol/mg〕的肝MDA含量均顯著高于A組〔(9.57±1.13)mmol/mg,P<0.05〕。

2.3單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1輻照吸收劑量對(duì)小鼠肝臟MDA含量的影響 輻照吸收劑量為1.0、3.5、6.0 Gy時(shí)的MDA含量分別為(10.3±0.71)mmol/mg、(13.8±0.98)mmol/mg、(13.3±0.83)mmol/mg；在輻照吸收劑量大于1 Gy時(shí)，MDA含量隨著輻照吸收劑量的增加強(qiáng)度不斷增加，大于3.5 Gy MDA含量逐漸降低。因此在其他的反應(yīng)條件確定時(shí)最佳輻照吸收劑量為3.5 Gy。

2.3.2輻照源距動(dòng)物高度對(duì)小鼠肝臟MDA含量的影響 照射源距動(dòng)物高度為60、80、100 cm時(shí)，MDA含量分別為(10.4±0.69)mmol/mg、(13.8±1.01)mmol/mg、(12.3±0.95)mmol/mg；輻照源距動(dòng)物高度為80 cm時(shí)，MDA含量達(dá)到最高值。然而輻照源距動(dòng)物高度過(guò)高或過(guò)低，MDA含量降低。所以在其他的反應(yīng)條件確定時(shí)MDA含量的最佳輻照源距動(dòng)物高度為80 cm。

2.3.3連續(xù)輻照時(shí)間對(duì)小鼠肝臟MDA含量的影響 連續(xù)照射時(shí)間5、10、15 d時(shí)，MDA含量分別為(12.7±0.84)mmol/mg、(14.0±1.18)mmol/mg、(12.5±0.83)mmol/mg；連續(xù)輻照時(shí)間為10 d時(shí)MDA最高。所以在其他的反應(yīng)條件確定時(shí)MDA含量的最佳連續(xù)輻照時(shí)間為10 d。

2.4二次響應(yīng)面回歸模型的建立及顯著性檢驗(yàn) 根據(jù)表2的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，對(duì)自變量編碼輻照吸收劑量(X1)、輻照源距動(dòng)物高度(X2)和連續(xù)輻照時(shí)間(X3)進(jìn)行回歸分析，并由Design-Expert8.0.5.0擬算出二次多項(xiàng)回歸方程。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

根據(jù)表3方差分析可得出，因素X1、X2、X3、X2X3、X12、X22及X32對(duì)MDA含量的影響極其顯著(P<0.01)；因素X1X3對(duì)MDA含量的影響顯著(P<0.05)；因素X1X2、X2對(duì)MDA 含量的影響不顯著(P>0.05)。

表3 回歸模型的ANOVA分析

影響MDA含量的因素，可根據(jù)二次多項(xiàng)回歸方程一次項(xiàng)系數(shù)的大小判斷依次為：輻射吸收度、連續(xù)照射時(shí)間和輻射源高度。通過(guò)以上判斷可以說(shuō)明，連續(xù)照射時(shí)間對(duì)MDA 含量的影響最顯著。方差分析結(jié)果如表3，失擬項(xiàng)的P值>0.05，差異不顯著，模型的F檢驗(yàn)值為404.98，P值<0.000 1，差異性極顯著，說(shuō)明該模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合較好，可用于對(duì)MDA 含量的理論預(yù)測(cè)。

通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化出在輻照吸收劑量3.5 Gy，輻照面積25 cm×25 cm，輻照源距動(dòng)物高度為80 cm，每次輻照90 s，連續(xù)輻照時(shí)間10 d， MDA含量達(dá)到最大值， MDA含量達(dá)到14 mol/mg。

2.5兩因素交互作用分析

2.5.1輻照吸收劑量與輻照源距動(dòng)物高度的交互作用 根據(jù)圖4可知，當(dāng)輻照吸收劑量與輻照源距動(dòng)物高度發(fā)生變化時(shí)，MDA含量也隨之發(fā)生變化。當(dāng)輻照吸收劑量達(dá)到3.5 Gy，輻照源距動(dòng)物高度約為80 cm時(shí)，MDA含量也相對(duì)最高。超過(guò)此范圍，得率則下降。說(shuō)明輻照吸收劑量與輻照源距動(dòng)物高度過(guò)大都不會(huì)使MDA含量的增強(qiáng)，故本試驗(yàn)中輻照吸收劑量與輻照源距動(dòng)物高度交互作用不顯著。

圖4 輻照吸收劑量與輻照源距動(dòng)物高度的交互作用對(duì)MDA含量的響應(yīng)面圖

2.5.2輻照吸收劑量與連續(xù)照射時(shí)間的交互作用 由圖5可知，當(dāng)連續(xù)照射時(shí)間一定的條件下，MDA含量隨輻照吸收劑量增大或減小而呈現(xiàn)明顯增大或減小趨勢(shì)。而在輻照吸收劑量一定的條件下MDA含量隨連續(xù)照射時(shí)間變化略有不同。故本試驗(yàn)中輻照吸收劑量與連續(xù)照射時(shí)間交互作用顯著。

圖5 輻照吸收劑量與連續(xù)照射時(shí)間的交互作用對(duì)MDA含量的響應(yīng)面圖

2.5.3輻照源距動(dòng)物高度與連續(xù)照射時(shí)間的交互作用 由圖6可知，當(dāng)輻照源距動(dòng)物高度一定的條件下，MDA含量隨連續(xù)照射時(shí)間長(zhǎng)短而呈現(xiàn)明顯的增大或減小趨勢(shì)。而在連續(xù)照射時(shí)間一定的條件下MDA含量隨輻照源距動(dòng)物高度的變化而變化。故本試驗(yàn)中輻照源距動(dòng)物高度與連續(xù)照射時(shí)間交互作用極為顯著。

圖6 輻照源距動(dòng)物高度與連續(xù)照射時(shí)間的交互作用對(duì)MDA含量的響應(yīng)面圖

3 討 論

本文利用γ射線照射的方法，確定小鼠衰老模型的建立條件為：輻照吸收劑量3.5 Gy，輻照面積25 cm×25 cm，輻照源距動(dòng)物高度為80 cm，每次輻照90 s，連續(xù)輻照時(shí)間10 d，小鼠肝臟中MDA含量達(dá)到最大值。利用響應(yīng)面法設(shè)計(jì)建模，可以有效減少試驗(yàn)次數(shù)。利用 Design-Export 軟件進(jìn)行響應(yīng)面法設(shè)計(jì)試驗(yàn)，可深入分析小鼠衰老模型的適應(yīng)性、系數(shù)之間的顯著性。在提出優(yōu)化試驗(yàn)方案的同時(shí)，更好地解決了響應(yīng)面法在設(shè)計(jì)與優(yōu)化試驗(yàn)過(guò)程中遇到的諸多問(wèn)題。MDA與游離氨基結(jié)合生成脂褐素是目前比較廣泛的衰老生物學(xué)標(biāo)志物?，F(xiàn)在研究階段較為常用的致衰老模型為D—半乳糖給藥法，這種方法在制備衰老模型時(shí)能夠有較好的效果。但D-半乳糖給藥法在實(shí)際操作中會(huì)出現(xiàn)工作量較大的問(wèn)題，而且在注射給藥時(shí)，因操作不當(dāng)會(huì)導(dǎo)致小鼠感染或死亡。根據(jù)衰老過(guò)程中細(xì)胞衰老的自由基理論，通過(guò)γ射線長(zhǎng)期照射小鼠，使小鼠體內(nèi)產(chǎn)生大量自由基，引起生物膜的損傷，造成衰老。γ射線照射法可利用器具將小鼠準(zhǔn)確固定在照射范圍，對(duì)于照射劑量、輻射源高度等條件均能確定，實(shí)驗(yàn)過(guò)程可控性較高于D—半乳糖給藥法。但實(shí)驗(yàn)用時(shí)較長(zhǎng)及γ射線的安全性需要多加考慮。在數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)過(guò)程中， SPSS統(tǒng)計(jì)軟件無(wú)法很好地分析小鼠衰老模型的適應(yīng)性、系數(shù)之間的顯著性。而響應(yīng)面法除了可以深入分析之外，還能優(yōu)化出最佳的試驗(yàn)方案，所以響應(yīng)面法可以在今后的實(shí)驗(yàn)中廣泛使用。