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    肝細(xì)胞癌患者腸道菌群的影響因素分析

    2020-08-11 06:55:46周凱妃王繼龍滕艷娟陳似霞莫新少
    中國普通外科雜志 2020年7期
    關(guān)鍵詞:雙歧菌群糞便

    周凱妃,王繼龍,滕艷娟,陳似霞,莫新少

    (廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 肝膽外科,廣西 南寧 530021)

    肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常見的原發(fā)性肝癌[1],也是全球第五大常見惡性腫瘤[2-3]。此外,由于各種危險(xiǎn)因素,HCC的發(fā)病率也有所增加[4],但目前仍缺乏理想的防治方法。人體腸道菌群存在一定的動(dòng)態(tài)平衡,在維持人體健康方面具有重要的作用。若腸道菌群的平衡受到各種不良因素的影響,就會(huì)形成腸道菌群失調(diào)(intestinal dysbacteriosis,ID),導(dǎo)致或促進(jìn)各種疾病的發(fā)生發(fā)展[5]。因此,腸道菌群在生理和病理過程中起著至關(guān)重要的作用[6]。近年來,隨著對(duì)肝-腸軸認(rèn)識(shí)的逐漸深入,腸道菌群與HCC之間的重要聯(lián)系越來越受到重視[7-8]。一方面,研究顯示ID促進(jìn)HCC[9];另一方面,HCC的發(fā)生影響腸道菌群,導(dǎo)致ID的發(fā)生[8,10],這是一個(gè)惡性循環(huán)的過程。因此,肝臟與腸道通過肝-腸軸相關(guān)聯(lián)的特征提示,除了治療肝臟原發(fā)病變外,腸道微生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)也應(yīng)作為HCC治療的重要靶點(diǎn)[3,11]。了解HCC患者腸道菌群的影響因素,有助于找到腸道菌群調(diào)節(jié)的潛在靶點(diǎn)。然而,目前大多數(shù)關(guān)于腸道菌群與HCC相關(guān)性的研究都是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。哪些因素是HCC患者腸道菌群的主要影響因素?根據(jù)HCC的特點(diǎn),綜合考慮各種因素,探討HCC患者腸道菌群的主要影響因素鮮有報(bào)道。因此,本研究的目的是探討HCC患者腸道菌群的主要影響因素。這些因素與腸道菌群之間的相關(guān)性有助于為HCC患者腸道菌群的調(diào)控提供潛在靶點(diǎn)以及腸道菌群干預(yù)治療HCC提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 研究對(duì)象和數(shù)據(jù)收集

    選取2018年11月—2019年7月廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科符合條件的121例HCC患者為研究對(duì)象。所有患者均自愿參與本研究,并簽署書面知情同意書。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn):⑴年齡為18~65歲;⑵ 術(shù)后病理確診為HCC;⑶ 首次進(jìn)行HCC肝切除術(shù);⑷ HCC合并乙肝;⑸ 自愿參加本次研究,并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):⑴ 有復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或合并其他惡性腫瘤;⑵ HCC破裂急診手術(shù);⑶ 入院前1個(gè)月內(nèi)使用抗生素或益生菌制劑;⑷ 術(shù)前未能收集糞便標(biāo)本。

    所有數(shù)據(jù)均由研究人員收集。除腸道菌群的檢測(cè)和焦慮的評(píng)估外,其他數(shù)據(jù)均在醫(yī)院系統(tǒng)收集,包括性別;年齡;肝功能指標(biāo):總膽紅素(total bilirubin,TBIL)、白蛋白(albumin,ALB)、總膽汁酸(total bile acid,TBA)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase,AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)、Child-Pugh評(píng)分、ISHAK炎癥評(píng)分、ISHAK纖維化評(píng)分;免疫炎性指標(biāo):超敏C反應(yīng)蛋白(hypersensitive c-reactive protein,hs-CRP)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)(white blood cell,WBC)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(neutrophil,NEU)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)(lymphocyte,LYM)、單核細(xì)胞計(jì)數(shù)(monocyte,MONO),空腹血糖(fasting blood glucose,GLU);血脂、肥胖指標(biāo):高密度脂蛋白膽固醇/低密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol/low-density liporprotein cholesterol,HDL-C/LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇/總膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol/total cholesterol,HDL-C/T-CHO)、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI);HCC分期:巴塞羅那臨床肝癌(Barcelona Clinical Liver Cancer,BCLC)分期、中國分期(Chinese Stage,CS)。其中,使用術(shù)前的糞便標(biāo)本檢測(cè)腸道菌群;入院第2天的外周血檢測(cè)TBIL、ALB、TBA、AST、ALT、hs-CRP、WBC、NEU、LYM、MONO、GLU、HDL-C/LDL-C、HDL-C/T-CHO;術(shù)后的病理標(biāo)本評(píng)估ISHAK炎癥、纖維化評(píng)分。

    1.2 腸道菌群失調(diào)診斷

    雙歧桿菌/腸桿菌(Bifidobacterium/Enterobacteriaceae,B/E)值>1表示腸道菌群的組成正常,B/E值<1表示ID,而且B/E值越低,提示ID越嚴(yán)重[12]。

    1.3 焦慮評(píng)估和糞便標(biāo)本收集

    研究人員使用狀態(tài)焦慮評(píng)估量表評(píng)估HCC患者術(shù)前的焦慮水平。并在術(shù)前使用糞便標(biāo)本采集管留取中段糞便作為標(biāo)本,避免尿液污染,留取標(biāo)本后放入裝有冰袋的泡沫盒中。研究人員盡快將糞便樣本送往實(shí)驗(yàn)室,分裝成0.2 g/管后放入-80 ℃的冰箱中保存。

    1.4 腸道菌群檢測(cè)

    使用糞便基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)(北京天根,DP328-02)提取糞便標(biāo)本的總DNA,具體步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。本研究使用的引物[13-14]見表1,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。雙歧桿菌(126 bp)正向:5'-GCG TGC TTA ACA CAT GCA AG TC-3',反向:5'-CAC CCG TTT CCA GGA GCT ATT-3';腸桿菌(195 bp)正向:5'-CAT TGA CGT TAC CCG CAG AAG AAG C-3',反向:5'-CTC TAC GAG ACT CAA GCT TGC-3'。

    使用TB GreenTMPremix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)(北京TaKaRa,RR820A)在Applied Biosystems 7500(美國)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增的菌群包括雙歧桿菌和腸桿菌。在冰上配置PCR反應(yīng)液,每1份PCR反應(yīng)液 (20 μL)包括TB GreenPremix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2×)10 μL、PCR Forward Primer(10 μmol/L)1 μL、PCR Reverse Primer(10 μmol/L)1 μL、ROX Reference Dye II 0.4 μL、DNA模板2 μL、滅菌水5.6 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性95 ℃(30 s),變性95 ℃(5 s),退火延伸[雙歧桿菌:60 ℃(34 s),腸桿菌:59 ℃(34 s)],40個(gè)循環(huán),融解曲線步驟為儀器默認(rèn)。引物的特異性通過擴(kuò)增產(chǎn)物的融解曲線來確定。在每1次PCR擴(kuò)增中均構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線并設(shè)置陰、陽性對(duì)照。

    1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建

    雙歧桿菌和腸桿菌的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。先檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度,計(jì)算其DNA拷貝數(shù),然后將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品5倍比8個(gè)梯度稀釋后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR,以DNA拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo),PCR擴(kuò)增的結(jié)果CT值為縱坐標(biāo)來構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。最后,糞便樣本中雙歧桿菌和腸桿菌的拷貝數(shù)通過其標(biāo)準(zhǔn)曲線來定量。

    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。采用配對(duì)t檢驗(yàn)比較菌群的豐度。使用Pearson相關(guān)、Spearman秩相關(guān)或兩樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行單因素分析,然后將單因素分析結(jié)果為P<0.1的變量納入多重線性回歸(逐步回歸法)。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

    雙歧桿菌、腸桿菌質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率、決定系數(shù)和擴(kuò)增效率分別為-2.46、0.99、92%和-2.55、0.99、88%,均達(dá)到定量的標(biāo)準(zhǔn)(圖1)。

    2.2 腸道菌群的定量分析

    HCC患者腸桿菌的豐度明顯高于雙歧桿菌[Log5(6.24±1.30)/g vs.Log5(7.59±1.11)/g,P=0.000]。ID(B/E<1)的發(fā)生率為77.69%(94/121)。

    2.3 單因素分析結(jié)果

    單因素分析顯示,雙歧桿菌中,性別、TBA、WBC、NEU、MONO、HDL-C/LDL-C、HDL-C/T-CHO的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。對(duì)于腸桿菌,TBIL、性別、GLU的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。對(duì)于B/E值,MONO差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

    圖1 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Standard curves of plasmid DNA standards

    表1 單因素分析腸道菌群的影響因素Table 1 Univariate analysis of the influencing factors for gut microbiota

    2.4 多重線性回歸分析結(jié)果

    多重線性回歸顯示,MONO是雙歧桿菌(P<0.000)和ID(P=0.008)的主要影響因素;TBIL(P=0.011)、性別(P=0.027)、GLU(P=0.038)是腸桿菌的主要影響因素(表2)。

    表2 多重線性回歸分析腸道菌群的影響因素Table 2 Multiple linear regression analysis of the influencing factors for gut microbiota

    3 討 論

    健康人的腸道菌群主要由專性厭氧有益菌組成,如雙歧桿菌,維持腸道菌群的平衡。本研究發(fā)現(xiàn)HCC患者中雙歧桿菌的豐度顯著低于腸桿菌,與健康人菌群的組成相反,這與之前的報(bào)道是一致的[15]。B/E值包括主要的有益菌雙歧桿菌和主要的條件致病菌腸桿菌,構(gòu)成腸道的定植抗性。因此,B/E值可以用來代表ID。B/E<1表示ID,而且B/E越低,表示ID越嚴(yán)重[12]。本研究還發(fā)現(xiàn),HCC患者ID的發(fā)生率為77.69%。以往研究報(bào)道,HCC患者腸道細(xì)菌過度生長的發(fā)生率為71.8%,明顯高于肝硬化患者的發(fā)生率(41.1%)[16]。

    本研究中,TBIL與腸桿菌呈正相關(guān),是腸桿菌的主要影響因素之一;MONO與雙歧桿菌和ID呈負(fù)相關(guān),是雙歧桿菌和ID的主要影響因素。其分子機(jī)制為:趨化因子CC家族(C-C motif chemokine ligand,CCL)如CCL3、CCL4、CCL5等,由肝腫瘤細(xì)胞分泌并參與MONO的激活[17-19]。作為肝功能的重要指標(biāo),TBIL升高提示肝功能異常。肝臟功能障礙降低了肝臟清除內(nèi)毒素的能力,其主要活性成分脂多糖進(jìn)入體循環(huán)。當(dāng)脂多糖與MONO表面的相應(yīng)受體結(jié)合時(shí),一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可誘導(dǎo)大量的炎癥介質(zhì),導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)的發(fā)生[20-21]。一方面,SIRS導(dǎo)致組織內(nèi)高代謝狀態(tài),組織內(nèi)氧需求量增加,腸上皮細(xì)胞氧分壓降低。另一方面,由于SIRS灌注量低,腎素-血管緊張素的激活引起小動(dòng)脈收縮,而小腸缺血又進(jìn)一步加劇了小動(dòng)脈的收縮[22]。此外,在動(dòng)物研究中發(fā)現(xiàn)大量的炎癥介質(zhì)使腸道黏膜的通透性增加[23]。腸黏膜屏障因缺氧、缺血和腸黏膜通透性增加遭到破壞,導(dǎo)致腸道菌群的改變。Li等[24]的研究表明,TBIL與內(nèi)毒素呈正相關(guān),而血漿內(nèi)毒素水平與慢性重型肝炎患者糞腸桿菌數(shù)量呈正相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)HCC患者伴隨著雙歧桿菌的減少,腸桿菌的增加,循環(huán)MONO的激活[14]。此外,Chen等[25]的研究證實(shí)了腸道菌群與MONO亞群之間的密切聯(lián)系。這些結(jié)果與本研究結(jié)果一致。本研究證明了肝功能、炎癥指標(biāo)與腸道菌群的相關(guān)性,提示肝功能損傷和炎癥的治療有利于促進(jìn)腸道菌群的平衡,也為腸道菌群干預(yù)作為HCC的治療靶點(diǎn)提供了理論依據(jù)。

    性別與腸道菌群具有相關(guān)性,女性和男性的腸道菌群存在明顯的差異[26]。Huang等[27]發(fā)現(xiàn),兼性厭氧細(xì)菌相對(duì)豐度的增加和厭氧細(xì)菌相對(duì)豐度的降低可以作為女性HCC的風(fēng)險(xiǎn)指標(biāo),但對(duì)于男性HCC無效,因?yàn)榇菩缘哪c道菌群比雄性對(duì)肝損傷更敏感。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象,即兼性厭氧菌腸桿菌在女性HCC中比在男性HCC中更為豐富。男性和女性腸道菌群的差異不僅有利于建立不同的HCC預(yù)警模型,也為腸道菌群的調(diào)節(jié)提供了不同的針對(duì)性干預(yù)措施。

    此外,本研究結(jié)果還提示GLU是HCC患者腸桿菌的主要影響因素之一,兩者呈正相關(guān)。HCC的發(fā)生伴隨著代謝功能的改變,從而引起血糖的改變。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT2直接參與高血糖對(duì)腸上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄重編,改變腸上皮細(xì)胞緊密連接和黏附連接的完整性,增加了腸道屏障的通透性,引起腸道菌群的改變[28]。還有研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群與個(gè)體化血糖控制相關(guān)[29]。以往研究[30]和本研究都證實(shí)了血糖與腸道菌群的相關(guān)性。這意味著良好的血糖控制有助于個(gè)人保持腸道菌群的平衡。

    綜上所述,MONO、TBiL、性別和GLU被證實(shí)影響HCC患者的腸道菌群,從而導(dǎo)致ID。這些因素與腸道菌群的相關(guān)性可能為HCC患者腸道菌群的調(diào)節(jié)提供潛在靶點(diǎn),同時(shí)也為腸道菌群干預(yù)治療HCC提供理論依據(jù)。

    (本文編輯 姜暉)

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