超聲輔助酶法提取海帶巖藻黃素工藝條件研究

畢可海，張玉瑩，孫玉奉，張伶俐，聶小偉，張玉清

（1.威海海洋職業(yè)學(xué)院食品工程系，山東威海264300；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安271018）

巖藻黃素是一種天然的脂溶性色素，廣泛存在于海帶、硅藻等藻類(lèi)和浮游植物中，其中海帶中含量最高[1-2]。巖藻黃素因其結(jié)構(gòu)中含有共軛雙鍵、丙二稀和5，6-環(huán)氧烷結(jié)構(gòu)[3]，因而具有較強(qiáng)的抗氧化能力，抗癌活性[4-10]，在國(guó)內(nèi)外的醫(yī)療、保健行業(yè)被廣泛關(guān)注。

海帶是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高的褐藻。由于其富含碘、礦物質(zhì)等被認(rèn)為具有較高的食用和藥用價(jià)值[11]。我國(guó)是海帶生產(chǎn)大國(guó)，產(chǎn)量居世界首位[12]。海帶是許多食品加工的原材料，如海帶絲、海帶掛面和海帶復(fù)合調(diào)味素等[13-14]，但是我國(guó)關(guān)于海帶的深加工技術(shù)相對(duì)單一，對(duì)于海帶深加工主要集中在碘、褐藻膠以及甘露醇等附加值較低的產(chǎn)品[15]，而對(duì)于更富藥用和食用價(jià)值的巖藻黃素的研究相對(duì)較少，因此本試驗(yàn)以海帶為原料提取巖藻黃素。

目前關(guān)于巖藻黃素的提取方法較少，大多采用有機(jī)溶劑法，超聲波輔助提取等傳統(tǒng)工藝[16-17]，但是傳統(tǒng)工藝由于無(wú)法破解細(xì)胞壁，因而不能有效的提取巖藻黃素。本試驗(yàn)用超聲輔助生物酶對(duì)海帶進(jìn)行破壁處理，優(yōu)化提取條件，使巖藻黃素可充分溶出，提取效率高，并且反應(yīng)安全、無(wú)毒、可控。為海帶巖藻黃素的提取和應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海帶：市售；果膠酶（30 000 U/g）、纖維素酶（100 000 U/g）：上海研生生化試劑有限公司；石油醚、丙酮、甲醇、無(wú)水乙醇、氯仿等（均為分析純）：天津永大化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

T6型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；AR124CN電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；TG16-WS離心機(jī)：湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；KQ-500DE超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 不同溶劑對(duì)海帶巖藻黃素提取量的影響

分別稱(chēng)取海帶粉末10 g置于燒杯中，向每個(gè)燒杯中分別加入200 mL不同提取溶劑[甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、石油醚以及石油醚∶丙酮（1∶1，體積比）的混合溶劑]。將燒杯在50℃條件下水浴加熱并攪拌，提取50 min后，抽濾出提取液，再次提取濾渣，合并提取液。懸蒸濃縮至10 mL，離心，去除雜質(zhì)，取上清液。在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

1.3.2 酶種類(lèi)和超聲輔助提取對(duì)海帶巖藻黃素提取量的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取10 g經(jīng)粉碎磨粉后的海帶粉末置于燒杯中，加入少量的超純水，分別加入質(zhì)量不同的果膠酶、纖維素酶、復(fù)合酶A[果膠酶∶纖維素酶（1∶1，質(zhì)量比）]、復(fù)合酶 B[果膠酶 ∶纖維素酶（1 ∶2，質(zhì)量比）]、復(fù)合酶 C[果膠酶 ∶纖維素酶（2∶1，質(zhì)量比）]，另將盛有復(fù)合酶A的燒杯置于頻率為70 W的超聲中輔助酶解，在酶解pH值為6.0、溫度為50℃的條件下，酶解60min后，加入石油醚∶丙酮（1∶1，體積比）的混合溶劑攪拌均勻后水浴提取1 h，離心，取上清液測(cè)定其吸光度值，計(jì)算巖藻黃素提取量。

1.3.3 酶解pH值對(duì)海帶巖藻黃素提取量的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取海帶粉末置于燒杯中，分別調(diào)節(jié)pH值為 3.0、4.0、5.0、6.0，分別加入 4.0%的復(fù)合酶 A，在酶解溫度為50℃的超聲中酶解60 min后，加入石油醚∶丙酮（1∶1，體積比）的混合溶劑攪拌均勻后水浴提取1 h，離心，取上清液測(cè)定其吸光度值，計(jì)算巖藻黃素提取量。

1.3.4 酶解溫度對(duì)海帶巖藻黃素提取量的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取海帶粉末置于燒杯中，分別在酶解溫度為 15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 ℃，加入 4.0%的復(fù)合酶A，調(diào)節(jié)pH值為5.0，在超聲中酶解60 min后，加入石油醚∶丙酮（1∶1，體積比）的混合溶劑攪拌均勻后水浴提取1 h，離心，取上清液測(cè)定其吸光度值，計(jì)算巖藻黃素提取量。

1.3.5 酶解時(shí)間對(duì)海帶巖藻黃素提取量的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取海帶粉末置于燒杯中，分別調(diào)節(jié)酶解時(shí)間為 30、40、50、60、70、80、90 min，加入 4.0%的復(fù)合酶A，調(diào)節(jié)pH值為5.0，在溫度為55℃的超聲中酶解，加入石油醚∶丙酮（1∶1，體積比）的混合溶劑攪拌均勻后水浴提取1 h，離心，取上清液測(cè)定其吸光度值，計(jì)算巖藻黃素提取量。

1.3.6 響應(yīng)面分析

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，利用響應(yīng)面法中心組合設(shè)計(jì)（Box-Benhnken）進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)。以酶解pH值、酶解時(shí)間（min）、酶解溫度（℃）3個(gè)因素為研究對(duì)象，設(shè)計(jì)三因素三水平的試驗(yàn)，分析各因素對(duì)巖藻黃素提取量的影響，同時(shí)考慮各因素間的交互作用。經(jīng)響應(yīng)面分析后得到巖藻黃素的最大提取量和最優(yōu)提取條件，并進(jìn)行驗(yàn)證，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Coded and real levels of the independent variables used in the design

1.3.7 巖藻黃素含量的測(cè)定

巖藻黃素的提取量按下列公式[16]：

式中：A為449 nm下的吸光度值；V為樣品的總體積，mL；A1%1cm為濃度溶質(zhì)的理論吸收值（巖藻黃素為 1 600）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

響應(yīng)面試驗(yàn)的數(shù)據(jù)處理采用Design-Expert 8.05（b）軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶劑對(duì)海帶巖藻黃素提取量的影響

巖藻黃素是一種極性比較強(qiáng)的脂溶性色素，因此根據(jù)相似相容原理，巖藻黃素可能會(huì)易溶于極性較強(qiáng)的溶劑中，因此本試驗(yàn)選用甲醇、無(wú)水乙醇、氯仿、丙酮、石油醚以及石油醚和丙酮（1∶1，體積比）的混合溶劑等幾種不同的溶劑作為提取溶劑。提取溶劑對(duì)巖藻黃素提取量的影響見(jiàn)圖1。

圖1 提取溶劑對(duì)巖藻黃素提取量的影響Fig.1 The effects of extraction solvent on the extraction amount of fucoxanthin

由圖1可知，不同的提取溶劑對(duì)海帶中巖藻黃素的提取量不同。其中巖藻黃素在石油醚和丙酮（1∶1，體積比）的混合溶劑中的提取量明顯高于其他幾種溶劑，說(shuō)明石油醚和丙酮的混合溶劑更適合巖藻黃素的提取。因此選用石油醚和丙酮（1∶1，體積比）的混合溶劑作為巖藻黃素提取溶劑。

2.2 酶種類(lèi)和超聲輔助提取對(duì)海帶巖藻黃素提取量的影響

酶種類(lèi)和超聲輔助提取對(duì)巖藻黃素提取量的影響見(jiàn)圖2。

圖2 酶種類(lèi)和超聲輔助提取對(duì)巖藻黃素提取量的影響Fig.2 The effects of enzyme types and ultrasound-assisted extraction on the extraction of fucoxanthin

由圖2可知，在一定范圍內(nèi)，海帶中的巖藻黃素提取量隨著果膠酶和纖維素酶的添加而逐步提高，其中纖維素酶對(duì)巖藻黃素提取效果略微高于果膠酶的提取效果，之后增大酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，由于底物的質(zhì)量是一定的，因此不能使所有的酶與底物充分接觸，從而抑制了酶的提取效果，因此巖藻黃素的提取量略有降低。而果膠酶和纖維素酶的復(fù)合，可以明顯提高巖藻黃素的提取量，尤其是果膠酶和纖維素酶按質(zhì)量比1∶1復(fù)合后，提取量最大，可達(dá)0.634 1 mg/g，這可能是因?yàn)楹Ъ?xì)胞壁由果膠質(zhì)和纖維素共同構(gòu)成的[18]，使用復(fù)合酶后，對(duì)海帶細(xì)胞壁起到更好的破壁效果，促進(jìn)了巖藻黃素的溶出。而超聲輔助可以明顯提高巖藻黃素的提取效果，這可能是因?yàn)槌曒o助可以促進(jìn)巖藻黃素的溶出，因此本研究選用超聲輔助復(fù)合酶（果膠酶：纖維素酶的質(zhì)量比為1∶1）進(jìn)行后續(xù)研究，這一結(jié)果與秦云等的結(jié)果相似[19]。

2.3 酶解pH值對(duì)海帶巖藻黃素提取量的影響

酶解pH值對(duì)海帶巖藻黃素提取量的影響見(jiàn)圖3。

圖3 酶解pH值對(duì)海帶巖藻黃素提取量的影響Fig.3 The effects of enzymatic pH on the extraction amount of fucoxanthin

因果膠酶的作用pH值是在3.0～6.0之間，因此本試驗(yàn)選用酶解pH值為3.0～6.0。由圖3可知，pH值對(duì)巖藻黃素的提取量的影響很大，當(dāng)pH值為5.0時(shí)巖藻黃素提取量達(dá)到最大。這可能是因?yàn)閜H值對(duì)酶的活力和催化效果影響較大，當(dāng)pH值為5.0時(shí)，酶的活性得到充分發(fā)揮，催化效果最佳，細(xì)胞壁被充分破壞，使巖藻黃素可以充分溶出，因此提取量最大；而過(guò)高或過(guò)低的pH值，均會(huì)影響巖藻黃素的提取，這是因?yàn)樵诖藀H值條件下，酶的活性無(wú)法被充分發(fā)揮，催化效果受到影響，從而影響了巖藻黃素的提取。所以，選擇最佳酶解pH值為5.0。

2.4 酶解溫度對(duì)海帶巖藻黃素提取量的影響

酶解溫度對(duì)海帶巖藻黃素提取量的影響見(jiàn)圖4。

由圖4可知，在一定范圍內(nèi)，巖藻黃素的提取量隨著酶解溫度的上升而提高，當(dāng)酶解溫度達(dá)到55℃時(shí)，巖藻黃素的提取量達(dá)到最大，而隨著酶解溫度繼續(xù)升高時(shí)，巖藻黃素的提取量下降。這是由于酶解溫度過(guò)高會(huì)影響酶的活性，使酶的活性受到抑制，巖藻黃素的提取量降低。因此，本研究選用最佳的酶解溫度為55℃。

圖4 酶解溫度對(duì)海帶巖藻黃素提取量的影響Fig.4 The effects of enzymatic temperature on the extraction amount of fucoxanthin

2.5 酶解時(shí)間對(duì)海帶巖藻黃素提取量的影響

酶解時(shí)間對(duì)海帶巖藻黃素提取量的影響見(jiàn)圖5。

圖5 酶解時(shí)間對(duì)海帶巖藻黃素提取量的影響Fig.5 The effects of enzymatic time on the extraction amount of fucoxanthin

由圖5可知，在一定范圍內(nèi)巖藻黃素的提取量隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，在酶解時(shí)間為70 min時(shí)達(dá)到最大，提取量可達(dá)0.836 6 mg/g，繼續(xù)延長(zhǎng)酶解時(shí)間，巖藻黃素的提取量反而下降，這可能是因?yàn)椋瑤r藻黃素很容易被光照、空氣氧化，穩(wěn)定性較差[20-21]。試驗(yàn)中隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致巖藻黃素被氧化，因此導(dǎo)致巖藻黃素的提取量下降。因此，本研究選用70 min為最佳酶解時(shí)間。

2.6 響應(yīng)面分析

2.6.1 模型的建立與顯著性檢驗(yàn)

通過(guò)處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，建立響應(yīng)值（提取量）與3個(gè)因素間的回歸模型（其中Y—巖藻黃素提取量，A—酶解pH值，B—酶解時(shí)間，C—酶解溫度），得到的回歸方程如下：

Y=-3.290 89+0.248 02A+0.065 039B+0.041 88C-2.750 00×10-4AB+7.500 00×10-4AC-1.350 00×10-5BC-0.026 462A2-4.438 75×10-4B2-3.815 00×10-4C2

三因素三水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)及巖藻黃素的提取量見(jiàn)表2。

回歸模型變量方差分析見(jiàn)表3。

由表3可知，該模型的P值＜0.000 1，說(shuō)明該數(shù)學(xué)模型可靠性較高；而失擬值P＞0.05，不顯著，表明此模型上的數(shù)據(jù)充分?jǐn)M合，試驗(yàn)不易受某些其他干擾因素的影響，可以有效避免較大的誤差；巖藻黃素提取量的變異系數(shù)CV值為0.46，回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2為0.993 3，這表明預(yù)測(cè)誤差較小，結(jié)果可靠，模型有較好的相關(guān)度；也說(shuō)明回歸方程可以較好地描述響應(yīng)值與各因素間的關(guān)系，同時(shí)還可以預(yù)測(cè)實(shí)際的試驗(yàn)結(jié)果。

表2 三因素三水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)及巖藻黃素的提取量Table 2 Three factors and three levels esponse surface methods experimental and extraction amount of fucoxanthin

表3 回歸模型變量方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

2.6.2 響應(yīng)面的交互作用分析

響應(yīng)面曲線(xiàn)圖可以直觀地反映各因素對(duì)提取量的影響，同時(shí)為研究各因素間的交互作用及確定巖藻黃素最大提取量和最適提取條件提供理論依據(jù)。巖藻黃素提取量的響應(yīng)面圖見(jiàn)圖6。

圖6 巖藻黃素提取量的響應(yīng)面圖Fig.6 The response surface map of fucoxanthin extraction

圖6中可以直觀地反映出在溫度一定的條件下，酶解時(shí)間和酶解pH值對(duì)巖藻黃素提取量的影響。在一定范圍內(nèi)，巖藻黃素提取量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)和pH值的增大而增大，同時(shí)觀察等高線(xiàn)圖可知，酶解時(shí)間對(duì)巖藻黃素的提取量影響更顯著。而在時(shí)間一定的條件下，酶解溫度和酶解pH值對(duì)巖藻黃素提取量的影響也很顯著。隨著酶解溫度的升高和酶解pH值的增大，巖藻黃素的提取量也增大，且酶解溫度對(duì)提取量的影響更為顯著。在酶解pH值一定的條件下，酶解溫度對(duì)巖藻黃素的提取量的影響較酶解時(shí)間更為顯著。

綜合來(lái)看，在影響巖藻黃素提取量的影響因素中，酶解溫度對(duì)巖藻黃素提取量的影響最為顯著，酶解時(shí)間次之。

2.6.3 回歸模型驗(yàn)證

通過(guò)響應(yīng)面分析模型及其對(duì)巖藻黃素最大提取量的預(yù)測(cè)，分析得出在酶解pH 5.14，酶解時(shí)間70.8 min，酶解溫度為57.8℃，巖藻黃素提取量的預(yù)測(cè)值為0.838 2 mg/g。結(jié)合實(shí)際情況對(duì)預(yù)測(cè)條件和預(yù)測(cè)值進(jìn)行修正，將酶解工藝修改為酶解pH 5.0，酶解時(shí)間為71 min，酶解溫度為58℃。每組試驗(yàn)進(jìn)行3次平行，結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4可以看出，試驗(yàn)驗(yàn)證值與預(yù)測(cè)值的誤差較小，這說(shuō)明該數(shù)據(jù)是真實(shí)可靠的。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of the validation test

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用超聲輔助酶法對(duì)海帶中巖藻黃素進(jìn)行提取，并優(yōu)化不同酶種類(lèi)、酶解pH值、酶解溫度、酶解時(shí)間等提取條件。通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化條件，在酶解pH 5.0，酶解時(shí)間為71 min，酶解溫度為58℃的條件下，巖藻黃素的提取量可達(dá)0.837 5 mg/g。海帶是提取巖藻黃素的較為理想的原料，通過(guò)超聲輔助酶法可以有效的將巖藻黃素提取出來(lái)，同時(shí)提取過(guò)程安全、無(wú)毒、可控性強(qiáng)，本試驗(yàn)為日后研究巖藻黃素的應(yīng)用及功能開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)。