氫化物-原子吸收光譜法測(cè)定人凝血酶原復(fù)合物中銻的含量

吳勰乾,韓 楊,霍建富,連建科,任 飛

(1 山西康寶生物制品股份有限公司技術(shù)中心,長(zhǎng)治 046000;2 長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室;*通訊作者,E-mail:renfei@czmc.edu.cn)

人凝血酶原復(fù)合物(human prothrombin complex)系由健康人血漿經(jīng)低溫乙醇蛋白分離法或經(jīng)批準(zhǔn)的其他分離法分離純化,并經(jīng)病毒去除和滅活處理、凍干制成[1]。臨床上廣泛應(yīng)用于治療乙型血友病、FⅡ、FⅦ及FⅩ先天性缺乏、產(chǎn)生FⅧ抑制物的甲型血友病和因肝疾患引起的凝血功能異常以及由維生素K缺乏而繼發(fā)的Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ因子低下所致的出血癥[2,3]。

人凝血酶原復(fù)合物使用的藥包材為中性硼硅玻璃模制注射劑瓶和注射用冷凍干燥用鹵化丁基橡膠塞,注射劑瓶中常加入三氧化二銻作為澄清劑[4],對(duì)人體具有慢性毒性與致癌性[5]。為保證藥品質(zhì)量,我們針對(duì)人凝血酶原復(fù)合物進(jìn)行了銻含量的研究。

根據(jù)《藥用玻璃鉛、鎘、砷、銻浸出量限度》[6]和《砷、銻、鉛、鎘浸出量測(cè)定法》[7]可知YBB標(biāo)準(zhǔn)中銻含量的常用測(cè)定方法為孔雀石綠-分光光度法,但該法測(cè)定前處理操作繁瑣,所用試劑如甲苯、孔雀綠均對(duì)人體毒性較大,方法靈敏度低。因此我們購(gòu)置了銻陰極燈,并參考文獻(xiàn)[4]和《中國(guó)藥典》2015年版四部通則2321“鉛、鎘、砷、汞、銅測(cè)定法”[8]中砷含量的測(cè)定方法,建立了更簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、對(duì)人體毒性小的氫化物-原子吸收光譜法測(cè)定人凝血酶原復(fù)合物中銻含量的測(cè)定方法,進(jìn)行了方法學(xué)研究。

1 試劑與儀器

1.1 試劑

人凝血酶原復(fù)合物(山西康寶生物制品股份有限公司,批號(hào):20170905-1、20170905-2、20170905-3);銻單元素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(以下簡(jiǎn)稱銻標(biāo)準(zhǔn)溶液,含量:100 μg/ml,中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院,批號(hào):GBW(E)080545-16094);硝酸(優(yōu)級(jí)純,上海阿拉丁公司,批號(hào):H160105);硼氫化鈉(分析純,山東西亞化學(xué)股份有限公司,批號(hào):Q9812);氫氧化鈉(分析純,天津市富起化工有限公司,批號(hào):160418);濃鹽酸(藥用級(jí),成都華邑藥用輔料制造有限公司,批號(hào):20170404);碘化鉀(分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào):20121128);抗壞血酸(分析純,上海阿拉丁公司,批號(hào):1325051);注射用水(山西康寶生物制品股份有限公司)。

1.2 儀器

AA-6300C型原子吸收分光光度計(jì)(日本島津公司);WHG-630A型流動(dòng)注射氫化物發(fā)生器(北京浩天暉科貿(mào)有限公司);銻空心陰極燈(日本島津公司);MD20H型微波消解儀(奧普樂儀器有限公司);加熱板(北京中興偉業(yè)儀器有限公司);HH-4型水浴鍋(常州市金壇科興儀器廠)。

實(shí)驗(yàn)中所有使用到的玻璃器皿均需浸泡在10% HNO3溶液中24 h以上,使用前先用自來水沖洗干凈,再用注射用水沖洗干凈。

2 方法與結(jié)果

2.1 測(cè)定條件

采用流動(dòng)注射氫化物發(fā)生器,以含1%硼氫化鈉和0.3%氫氧化鈉溶液(臨用前配制)作為還原劑,鹽酸溶液(1→100)為載液,氮?dú)鉃檩d氣,檢測(cè)波長(zhǎng)為217.6 nm,光源燈電流13 mA,狹縫0.7 nm。

2.2 試液配制

2.2.1 銻標(biāo)準(zhǔn)貯備液的制備 精密量取銻標(biāo)準(zhǔn)溶液適量,用2%硝酸溶液稀釋,制成每1 ml含銻100 ng的溶液。

2.2.2 2%硝酸溶液 量取硝酸適量,用水稀釋制成2%的溶液。

2.2.3 含1%硼氫化鈉和0.3%氫氧化鈉溶液 稱取氫氧化鈉0.3 g,硼氫化鈉1.0 g,用水溶解后,加水至100 ml,搖勻(臨用前配制)。

2.2.4 鹽酸溶液(1→100) 量取濃鹽酸1 ml,用水稀釋至100 ml。

2.2.5 25%碘化鉀溶液 稱取碘化鉀25 g,用水溶解后,加水至100 ml,搖勻(臨用前配制)。

2.2.6 10%抗壞血酸溶液 稱取抗壞血酸10 g,用水溶解后,加水至100 ml,搖勻(臨用前配制)。

2.2.7 鹽酸溶液(20→100) 量取濃鹽酸20 ml,用水稀釋至100 ml。

2.3 測(cè)定方法

標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)定:每次測(cè)定前需先進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)定,操作方法詳見2.4.1。

供試品溶液的制備:取供試品,加10 ml注射用水,輕輕搖動(dòng)至完全溶解。精密量取5 ml置消解罐內(nèi),加濃硝酸5 ml,在設(shè)定好的消解程序(第一步5 min升溫至120 ℃保持3 min,第二步5 min由120 ℃升溫至150 ℃保持3 min,第三步由150 ℃升溫至180 ℃保持15 min)中進(jìn)行微波消解。消解完全后置電熱板上緩緩加熱至紅棕色蒸汽揮盡,放冷,轉(zhuǎn)入10 ml量瓶中,用少量2%硝酸洗滌消解罐,洗液一并入量瓶中,用2%硝酸定容至刻度,搖勻。精密量取10 ml,置25 ml量瓶中,加25%碘化鉀溶液(臨用前配制)1 ml,搖勻,加10%抗壞血酸溶液(臨用前配制)1 ml,搖勻,用鹽酸溶液(20→100)稀釋至刻度,搖勻,密塞,置80 ℃水浴中加熱3 min,取出,放冷,作為供試品溶液,同法同時(shí)制備供試品空白溶液。

測(cè)定法:取適量,吸入流動(dòng)注射氫化物發(fā)生器,測(cè)定吸光度。將供試品吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算供試品溶液中銻的含量。

2.4 方法學(xué)研究

2.4.1 線性關(guān)系與范圍的考察 分別精密量取銻標(biāo)準(zhǔn)貯備液適量,用2%硝酸溶液稀釋制成每1 ml分別含銻0,5.0,10.0,15.0,20.0,25.0 ng的溶液,再精密吸取10 ml,置25 ml量瓶中,加25%碘化鉀溶液(臨用前配制)1 ml,搖勻,加10%抗壞血酸溶液(臨用前配制)1 ml,搖勻,用鹽酸溶液(20→100)稀釋至刻度,搖勻,密塞,置80 ℃水浴中加熱3 min,取出,放冷,同法同時(shí)制備對(duì)照品空白溶液。取適量,吸入流動(dòng)注射氫化物發(fā)生器,測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo),回歸計(jì)算?；貧w方程:y=0.008 3x+0.008 5,r=0.997 1。式中:y為吸光度值;x為銻濃度,單位為ng/ml。銻濃度對(duì)吸光度的線性關(guān)系結(jié)果見表1。結(jié)果表明:銻含量在0-25.0 ng/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 線性關(guān)系試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of the linear relationship

2.4.2 檢出限和定量限的測(cè)定 取試劑空白溶液(2%硝酸溶液)連續(xù)測(cè)量11次,記錄吸光度值,求出標(biāo)準(zhǔn)差,結(jié)果見表2。

表2 試劑空白溶液吸光度值 (n=11)Table 2 Absorbance of the blank solution (n=11)

按2.4.1方法,以每1 ml分別含銻0,5.0,10.0,15.0,20.0,25.0 ng的對(duì)照溶液,測(cè)定吸光度,做線性回歸方程,得標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。檢出限=3×空白標(biāo)準(zhǔn)差/標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率;定量限=10×空白標(biāo)準(zhǔn)差/標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。結(jié)果檢出限為0.553 3 ng/ml;定量限為1.844 ng/ml。

2.4.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)測(cè)定的精密度試驗(yàn) 取銻標(biāo)準(zhǔn)溶液(10.0 ng/ml),連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄吸光度值,計(jì)算平均吸光度和RSD值,結(jié)果見表3。結(jié)果顯示:RSD值為4.36%,說明該方法精密度良好。

2.4.4 加樣回收率試驗(yàn) 取人凝血酶原復(fù)合物(批號(hào):20170905-1),加10 ml注射用水,輕輕搖動(dòng)至完全溶解。精密量取5 ml置消解罐內(nèi),加濃硝酸5 ml,在設(shè)定好的消解程序(第一步5 min升溫至120 ℃保持3 min,第二步5 min由120 ℃升溫至150 ℃保持3 min,第三步由150 ℃升溫至180 ℃保持15 min)中進(jìn)行微波消解。消解完全后置電熱板上緩緩加熱至紅棕色蒸汽揮盡,放冷,轉(zhuǎn)入10 ml量瓶中,用少量2%硝酸洗滌消解罐,洗液一并入量瓶中,用2%硝酸定容,搖勻。

回收率樣品溶液制備:精密量取供試品消解后溶液5 ml,置25 ml量瓶中,共9份樣品,分別加入銻標(biāo)準(zhǔn)貯備液(100 ng/ml)1.0,1.5,2.0 ml,再各加入2%硝酸溶液4.0,3.5,3.0 ml,制成低、中、高濃度的回收率樣品溶液各3份。各樣品再加25%碘化鉀溶液(臨用前配制)1 ml,搖勻,加10%抗壞血酸溶液(臨用前配制)1 ml,搖勻,用鹽酸溶液(20→100)稀釋至刻度,搖勻,密塞,置80 ℃水浴中加熱3 min,取出,放冷,作為回收率樣品溶液。取適量,吸入流動(dòng)注射氫化物發(fā)生器,測(cè)定吸光度。將回收率樣品溶液吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出銻的含量,計(jì)算回收率,結(jié)果見表4。

表4 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=9)Table 4 Results of sample recovery test (n=9)

經(jīng)檢測(cè),供試品溶液吸光度為負(fù)值,所以銻含量為未檢出。若供試品銻含量按0計(jì),則平均回收率105.24%,RSD為7.71%?；厥章试?5.93%-118.62%之間,結(jié)果良好。

2.4.5 樣品檢測(cè) 分別取3批人凝血酶原復(fù)合物(批號(hào):20170905-1,20170905-2,20170905-3)樣品,按銻含量測(cè)定法檢測(cè),結(jié)果顯示:3批樣品溶液吸光度均為負(fù)值,未檢出銻含量(見表5)。

表5 3批人凝血酶原復(fù)合物樣品檢測(cè)結(jié)果Table 5 Determination results in 3 batches of samples

3 討論

硼氫化鈉是一種強(qiáng)還原劑,其濃度在氫化物反應(yīng)中對(duì)吸光度影響顯著。硼氫化鈉濃度過低時(shí)還原能力弱影響氫化物的生成效率;硼氫化鈉濃度過高時(shí)會(huì)產(chǎn)生過多氫氣稀釋亞氫焰使靈敏度下降。經(jīng)考察,含1%硼氫化鈉和0.3%氫氧化鈉溶液作為還原體系時(shí)多余氫氣產(chǎn)生較少。

此外,對(duì)比《氫化物發(fā)生-原子吸收法測(cè)定藥用玻璃容器中砷和銻的浸出量》[4],使用微波消解大大提高了反應(yīng)速率,縮短了樣品制備時(shí)間,證明消解程序設(shè)置合理、有效。

綜上,通過對(duì)銻含量氫化物-原子吸收光譜測(cè)定法方法學(xué)研究,結(jié)果表明:該方法精密度好、回收率符合要求。與傳統(tǒng)方法相比較,具有操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn),更適合作為人凝血酶原復(fù)合物中銻含量的測(cè)定方法。