改良保存液處理紅細(xì)胞對糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合的影響

衛(wèi)含偉，朱娜娜，王 歡，劉小倩，段立雙，周 循，郭建榮*

(1.皖南醫(yī)學(xué)院研究生院，安徽 蕪湖 241002； 2.海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬公利醫(yī)院 麻醉科，上海 200135)

在所有接受外科手術(shù)的患者中，有8%～10%為糖尿病患者[1]，傷口愈合不良作為糖尿病的主要并發(fā)癥之一，已成為糖尿病患者術(shù)后恢復(fù)的關(guān)注焦點(diǎn)。自體輸血已成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)關(guān)注的熱點(diǎn)和未來醫(yī)學(xué)發(fā)展的方向，自體輸血不僅可以避免異體輸血帶來的風(fēng)險(xiǎn)和并發(fā)癥，同時也可緩解血源短缺的現(xiàn)狀。有研究指出自體輸血(autologous blood transfusion)可作為傷口愈合的主要治療突破[2]；所以采用適當(dāng)方法處理和保存糖尿病患者的血液，保持紅細(xì)胞(red blood cell，RBC)離體后的正常形態(tài)及功能，避免因RBC貯存損傷而影響糖尿病患者的傷口愈合至關(guān)重要。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)是HIF-1轉(zhuǎn)錄因子的亞基，研究顯示HIF-1α在創(chuàng)面愈合過程中具有一定作用[3]，本研究主要模擬臨床自體輸血，觀察不同保存液處理后糖尿病小鼠RBC功能的改變，及其回輸后對糖尿病小鼠傷口愈合的影響，并初步探討其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物:SPF級雄性昆明小鼠30只，體質(zhì)量26～30 g (中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動物中心，SKD111001)。

1.1.2 主要試劑:ELISA試劑盒、山羊抗兔IgG抗體、兔血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、HIF-1α、Ⅰ抗、Ⅱ抗、β-肌動蛋白、MEK、p-MEK、 ERK1/2、 p-ERK1/2、PI3K、p-PI3K、 AKT 和p-AKT(Abcam公司)；ECL熒光檢測試劑盒(上海古朵生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病小鼠模型的建立:通過連續(xù)5 d腹腔注射50 mg/kg鏈脲佐菌素建立糖尿病小鼠模型。采用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為獻(xiàn)血組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組小鼠隨機(jī)分為標(biāo)準(zhǔn)組(standard)和改良組(improvement)。

1.2.2 血液的采集及保存:采集建模成功的獻(xiàn)血組小鼠全血[4]，分別用改良保存液和標(biāo)準(zhǔn)保存液放入4 ℃～6 ℃的冰箱內(nèi)進(jìn)行保存，保存液[5]配方主要成分有改良保存液和標(biāo)準(zhǔn)保存液。改良的血液保存液：2 mmol/L腺嘌呤、55.5 mmol/L糖、55 mmol/L甘露醇、26 mmol/L NaCl和12 mmol/L Na2HPO3，pH值為6.5。標(biāo)準(zhǔn)血液保存液：2.2 mmol/L腺嘌呤、110 mmol/L糖、70.1 mmol/L氯化鈉、20 mmol/L磷酸氫二鈉和12 mmol/L檸檬酸組成，pH值為5.8。

1.2.3 紅細(xì)胞功能的檢測:在血液保存的第7、14、21和28天，根據(jù)試劑盒的使用說明，用分光光度儀檢測微量游離血紅蛋白(free hemoglobin，fHb)，COBAS-B-123全自動血?dú)夥治鰞x及電解質(zhì)分析儀檢測血液樣品中P50、血pH值、RCD，ELISA檢測2,3-二磷酸甘油酸(2,3-diphosphoglycerate，2,3-DPG)含量。

1.2.4 傷口模型的建立及取材:血液保存的第7天，異氟烷麻醉，用剪刀將小鼠背部皮膚的毛發(fā)剃去、消毒，制作直徑為2 cm表皮開放傷口模型，分別輸注保存7 d的改良保存血和標(biāo)準(zhǔn)保存血，輸注后連續(xù)觀察和測量傷口，持續(xù)14 d。第14天異氟烷麻醉小鼠后，處死，收集小鼠創(chuàng)面皮膚組織進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 創(chuàng)口形態(tài)學(xué)的觀察:計(jì)算機(jī)分析數(shù)碼相機(jī)拍攝圖像，按公式計(jì)算創(chuàng)面愈合率。采用常規(guī)HE 染色，觀察創(chuàng)口的組織形態(tài)學(xué)變化。

1.2.6 免疫組織化學(xué)觀察:將切片脫蠟、水化后，滴加1%的H2O2，室溫孵育10 min，去除內(nèi)源性過氧化物酶，隨后微波法抗原修復(fù)。加入兔血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、表皮生長因子(EGF))或HIF-1α，室溫下孵育60 min，蒸餾水沖洗，置入PBS溶液中。生物標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(1∶3 000)37 ℃下孵育40 min，用蒸餾水沖洗，然后放置在PBS溶液中。應(yīng)用DAB顯色，蘇木精輕度復(fù)染，脫水、透明、封片。

1.2.7 Masson染色觀察:切片脫蠟、水化后，蘇木精染色10 min，充分水洗，用1%的鹽酸-乙醇進(jìn)行1～3 s的分化，然后用水沖洗15 min，切片放入促藍(lán)液中致切片變藍(lán)，清水沖洗，將切片放在立春紅酸性復(fù)紅液中浸泡10 min，用2%的冰醋酸溶液水洗片刻，1%的磷鉬酸溶液進(jìn)行3～5 min分化，苯胺藍(lán)染色5 min后浸泡在0.2%冰醋酸水溶液浸洗片刻，脫水、透明、封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察并獲得圖像。

1.2.8 Western blot檢測蛋白: 皮膚組織用PBS洗滌兩次，加入裂解緩沖液，在渦流混合器中搖動，在4 ℃下、12 000 r/min離心30 min，取上清液，用BCA法測定蛋白濃度。SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)膜。加入Ⅰ抗，室溫孵育2 h，洗滌后加入Ⅱ抗，室溫孵育1 h。使用電化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯示條帶， ECL熒光檢測試劑盒(BB-3501)，使用Bio-Rad圖像分析系統(tǒng)采集圖像，然后通過圖像J軟件進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

建模期間2只小鼠死亡，3只未建模成功。

2.1 儲存RBC功能

改良組血漿 fHb含量降低，P50、pH、2,3-DPG和RCD顯著升高(P<0.05)(圖1A～E)。

A.fHb content; B.P50 oxygen pressure; C.blood pH; D.level of 2, 3-DPG; E.RCD value; *P<0.05 compared with the standard group; #P< 0.05 compared with improvement (7 days)

2.2 糖尿病小鼠傷口愈合能力

與標(biāo)準(zhǔn)組比較，改良組小鼠術(shù)后第7和14天皮膚創(chuàng)面面積顯著下降(P<0.05)(圖2A,B)。改良組小鼠術(shù)后第14天皮膚組織和血管面積顯著增加(P<0.05)(圖2C～E)。與標(biāo)準(zhǔn)組比較，改良組小鼠皮膚膠原纖維的表達(dá)和纖維化程度在手術(shù)后14 d升高(圖2F)。

A.wound healing was observed on the 7th and 14th day after operation, with blood transfusion in which the bloods were preserved in different preservation solutions; B.quantification and statistical analysis of wound healing at 0, 1, 4, 7 and 14 days after operation; C.HE staining for wound healing of the skin tissues 14 days after operation(scale bar=25/50 μm); D.quantification and statistical analysis of wound healing granular tissue 14 days after operation; E.quantification and statistical analysis of angiosomes 14 days after operation; F.masson staining of wound healing tissues (bar = 50 μm); *P<0.05 compared with the standard group

A.in situ detection of HIF-1α by immunohistochemistry(scar bar=25 μm); B.quantification and statistical analysis of the HIF-1α expression in wound tissues; C.level of VEGF by immunohistochemistry; D.quantification and statistical analysis of level of VEGF; E.level of EGF by immunohistochemistry; F.quantification and statistical analysis of level of EGF; *P<0.05 compared with the standard group

2.3 糖尿病小鼠皮膚中HIF-1α、VEGF和EGF及HIF-1α相關(guān)蛋白的表達(dá)

與標(biāo)準(zhǔn)組比較，改良組小鼠皮膚組織中HIF-1α、VEGF和EGF水平顯著升高(P<0.05)(圖3A～F)。改良組小鼠皮膚組織中的PI3K/Akt和MEK/ERK表達(dá)增加，p-PI3K、p-AKT、p-MEK和p-ERK的蛋白表達(dá)水平均顯著高于標(biāo)準(zhǔn)組(P<0.05)(圖4)。

*P<0.05 compared with the standard group圖4 兩組糖尿病小鼠HIF-1α相關(guān)蛋白表達(dá)情況

3 討論

創(chuàng)傷愈合是多種細(xì)胞、細(xì)胞因子及細(xì)胞外基質(zhì)和可溶性介質(zhì)之間相互作用和高度協(xié)調(diào)的一種組織損傷的再生反應(yīng)過程，局部或全身使用促血管生成分子可以促進(jìn)血管生成和傷口愈合[6]。糖尿病傷口愈合的機(jī)制比較復(fù)雜，糖尿病患者的傷口愈合障礙可能與其RBC功能異常有關(guān)[7]。RBC功能異常導(dǎo)致局部組織缺血缺氧，其變形能力的降低，導(dǎo)致RBC對中性炎性細(xì)胞浸潤、細(xì)胞外基質(zhì)增生的病理生理學(xué)改變的抑制作用減弱，對糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生亦起到了推波助瀾的作用，由此可認(rèn)為改善糖尿病患者RBC形態(tài)功能，可能會促進(jìn)糖尿病患者傷口愈合。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，同標(biāo)準(zhǔn)液保存RBC比較，改良血液RBC與氧的親和力增加，fHb降低，RBC變形能力增強(qiáng)，而且通過觀察實(shí)驗(yàn)組小鼠14 d傷口愈合程度發(fā)現(xiàn)，輸注改良RBC小鼠傷口愈合顯著增強(qiáng)，證明功能改善后的RBC可促進(jìn)糖尿病小鼠傷口愈合。高血糖下皮膚成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中HIF-1α水平降低是慢性傷口愈合不良的標(biāo)志[8]，HIF-1α可通過激活Erk/MAPK 或PI3K/Akt 信號通路上調(diào)與傷口愈合密切相關(guān)蛋白的表達(dá)，其中包括與血管新生相關(guān)的VEGF 受體[9]，VEGF是血管生成的主要刺激因子，又可激活PI3K/Akt通路，結(jié)合VEGF受體介導(dǎo)血管生成[10]。高血糖能夠抑制HIF-1α的蛋白水平及其轉(zhuǎn)錄功能這一推斷已得到證實(shí)[11]，在高糖或糖尿病環(huán)境下，抑制HIF-1α的具體分子機(jī)制不清，糖尿病患者RBC的功能異常可降低HIF-1α 水平和活性[12]。本研究中，通過改良保存液保存的血液，其RBC功能顯著改善，改良組創(chuàng)口皮膚組織中HIF-1α、VEGF、EGF的表達(dá)水平顯著提高，HIF-1α通路有關(guān)的蛋白表達(dá)水平也顯著提高。因此可以認(rèn)為改良保存RBC可能通過改善RBC的功能，激活HIF-1α通路促進(jìn)傷口愈合，但是本實(shí)驗(yàn)只涉及到小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，且未對小鼠HIF-1α基因沉默對照進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，仍需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，改良保存液可顯著改善紅細(xì)胞的攜氧量及維持其變形性，進(jìn)而促進(jìn)糖尿病小鼠傷口的愈合，其機(jī)制可能與激活HIF-1α信號通路有關(guān)。