黃毛草莓編碼NB-ARC結構域的FnCN基因和啟動子克隆及FnCN基因表達分析

胡玉慈， 姚立萍， 張 童， 何淑敏， 唐鑫彪， 陳清西，①， 文志豐，①

(1. 福建農(nóng)林大學園藝學院， 福建 福州 350002； 2. 福州市農(nóng)業(yè)科學研究所， 福建 福州 350018；>3. 中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所， 北京 100081)

植物抗性(resistance，R)基因可介導植物對各種病原體的防御反應，如細菌、真菌和病毒，甚至是一些昆蟲和線蟲等[1]，大多數(shù)R基因可編碼NB-ARC類抗病蛋白[2]，該類抗病蛋白根據(jù)N端結構域的不同進一步分為含有TIR(toll/interleukin-1 receptor)的TNL(TIR-NB-ARC-LRR)蛋白、含有CC(coiled-coil)的CNL(CC-NB-ARC-LRR)蛋白以及含有RPW8(resistance to powdery mildew 8)的RNL(RPW8-NB-ARC-LRR)蛋白[3-4]。植物基因組內編碼NB-ARC結構域的抗病基因在其抵御病原菌侵染時起重要作用[1-2]。Jia等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在植物基因組中，約有0.2%～1.6%基因被預測為NB-ARC編碼基因。迄今為止，已從蘋果(MaluspumilaMill.)[6]、山葡萄(VitisamurensisRupr.)[7]、陸地棉(GossypiumhirsutumLinn.)[8]、草莓(Fragaria×ananassaDuch.)[9]、番茄(LycopersiconesculentumMill.)[10]和花生(ArachishypogaeaLinn.)[11]等植物中克隆到NB-ARC類抗病基因，大多數(shù)NB-ARC類抗病基因能響應病原菌的侵染，并通過水楊酸(salicylic acid，SA)、茉莉酸(jasmonie acid，JA)和脫落酸(abscisic acid，ABA)等信號途徑來調控植物對病原菌的防御反應。此外，有研究發(fā)現(xiàn)草莓FaNBS編碼基因可進一步融合WRKY、Pkinase、MBY和RPW8等結構域發(fā)揮其抗病作用[12]。

草莓隸屬于薔薇科(Rosaceae)草莓屬(FragariaLinn.)，為多年生草本植物，其栽培面積和產(chǎn)量居世界小漿果生產(chǎn)的首位[13]。由炭疽菌(Colletotrichumspp.)引發(fā)的草莓炭疽病是對草莓破壞性極大的病害之一，可造成80%以上的草莓幼苗死亡，損失50%以上的產(chǎn)量[14]。目前，對草莓炭疽病的防治仍然采用噴施農(nóng)藥的化學防治，而化學防治易造成果實殘毒和環(huán)境污染，降低了草莓鮮食及加工產(chǎn)品的品質，因此，培育草莓抗病品種是最經(jīng)濟且有效控制病害的方法[15-16]。黃毛草莓(FragarianilgerrensisSchlecht. ex Gay)對葉斑病、炭疽病和蚜蟲等病蟲害具有較強的抗性，有重要的育種價值[17]。黃毛草莓主要分布在亞洲東南部，在中國分布于湖南、湖北、云南、貴州、四川、陜西和臺灣等地[18]。馬鴻翔等[19]研究發(fā)現(xiàn)，黃毛草莓葉斑病和炭疽病的田間自然發(fā)病率較低，且與部分栽培種雜交后其抗病性能遺傳。黃金鳳[20]通過田間自然發(fā)病和接種評價方法，發(fā)現(xiàn)黃毛草莓對炭疽病有較強抗性。從黃毛草莓中克隆相關抗病基因并明確其抗病機制，對深入了解黃毛草莓抗病機制及培育抗炭疽病草莓品種具有重要意義。

黃毛草莓對外界不良環(huán)境抗性強、適應性好，對草莓品種改良具有重大意義。預實驗結果顯示：黃毛草莓離體葉片接種膠孢炭疽菌〔Colletotrichumgloeosporioides(Penz.) Sacc.〕后，發(fā)病率僅27.78%，病情指數(shù)為16.92，說明黃毛草莓對草莓炭疽病具有較強抗性，但目前國內外對黃毛草莓抗炭疽病方面的研究較少。作者所在課題組前期對黃毛草莓接種膠孢炭疽菌，利用轉錄組測序技術從黃毛草莓中篩選到1個受膠孢炭疽菌誘導表達的序列。本研究利用同源克隆技術從黃毛草莓中獲得CN基因及其啟動子序列，對該基因編碼的氨基酸序列進行生物信息學分析，同時構建了該基因的植物過表達載體和病毒誘導基因沉默(virus induced gene silencing，VIGS)載體，并利用實時熒光定量PCR技術對接種膠孢炭疽菌后的黃毛草莓葉片中CN基因的轉錄水平進行了檢測，以期為明確黃毛草莓CN基因的抗病功能提供初步依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試黃毛草莓由北京市農(nóng)林科學院張運濤課題組提供，栽培于福建農(nóng)林大學園藝學院果樹抗病與遺傳育種實驗室，膠孢炭疽菌菌株Lch-1911由湖北省農(nóng)業(yè)科學院韓永超副研究員饋贈。

大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α感受態(tài)細胞、植物過表達載體pCAMBIA1301-HA和煙草脆裂病毒載體pTRV2由福建農(nóng)林大學園藝學院果樹抗病與遺傳育種實驗室保存。氨芐青霉素(ampicillin，Amp)和卡那霉素(kanamycin，Kana)購自生工生物工程(上海)股份有限公司；PCR Master Mix、RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒、DNA Secure Plant Kit植物基因組DNA提取試劑盒、Universal DNA Purification Kit DNA純化回收試劑盒和TIANprep Mini Plasmid Kit質粒小提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；BamHⅠ、KpnⅠ和XbaⅠ限制性內切酶，DNA Marker，pMD20-T載體，Solution Ⅰ，PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄試劑盒，PrimeScript?RT reagent Kit反轉錄試劑盒以及RR820A SYBR Premix ExTaqⅡ熒光定量試劑盒購自日本Takara公司。

1.2 方法

1.2.1 處理方法 參照韓永超等[21]的方法制備膠孢炭疽菌分生孢子懸浮液，將膠孢炭疽菌接種至新鮮PDA培養(yǎng)基上，于溫度28 ℃、避光條件下活化3～5 d，再從活化后的菌落邊緣取菌絲塊轉接到含體積分數(shù)0.05%酵母提取液的PDA培養(yǎng)基上，于溫度28 ℃、避光條件下培養(yǎng)至平板上長出橘紅色分生孢子，用滅菌槍頭或牙簽將菌絲輕輕刮下，無菌水沖洗、重懸，通過4層紗布濾去菌絲和培養(yǎng)基雜質，使用血球計數(shù)板和DMi8倒置熒光顯微鏡(德國Leica公司)，用無菌水稀釋為孢子濃度1×106mL-1的孢子懸浮液，置于4 ℃條件下備用。

參照Zhang等[22]的方法，處理組將膠孢炭疽菌分生孢子懸浮液接種到活體黃毛草莓葉片上，對照組接種無菌水，每組分別從15株生長健康的黃毛草莓植株上取由上至下第3至第6位葉片，共接種50枚葉片，然后放置在人工氣候室培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度25 ℃、空氣相對濕度70%、光照時間12 h·d-1及光照強度125 μmol·m-2·s-1。接種后0、3、6、12、24、48和72 h每組在同一時間隨機采集2～3枚葉片置于液氮中速凍，然后置于-80 ℃冰箱中保存、備用，每組3次重復。

1.2.2 黃毛草莓CN基因和啟動子克隆 用無菌剪刀剪取無病蟲害、生長勢良好的5枚新葉，裝入無菌自封袋后迅速放入冰盒中，備用。將葉片置于液氮中研磨成粉末狀，以RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取的RNA為模板反轉錄合成cDNA第1鏈，再利用DNA Secure Plant Kit植物基因組DNA提取試劑盒提取DNA。采用Primer 5.0軟件設計擴增黃毛草莓CN基因完整開放閱讀框(ORF)的正向和反向引物，F(xiàn)nCN-F序列為5′-ATGGAGTTTGCCGCCATCATTGCT-3′，F(xiàn)nCN-R序列為5′-AAGTCTGTTATGTGTGGGATAA-3′。設計黃毛草莓CN基因起始密碼子上游啟動子序列的正向和反向引物，P-FnCN-F序列為5′-ATCCTCCCTGCCAATGAAAAGACG-3′，P-FnCN-R序列為5′-GAAGAGAGAAAGAGAGGTTTTATG-3′。分別以cDNA第1鏈和葉片DNA為模板進行PCR擴增，擴增體系總體積為25.0L，包括2×TaqPCR Master Mix 12.5L、正向和反向引物各1.0L、模板1.0L和無菌水9.5L。擴增程序為：94 ℃預變性90 s；94 ℃變性30 s、57 ℃退火30 s、72 ℃延伸90 s，38個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR反應產(chǎn)物經(jīng)質量體積分數(shù)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后用Universal DNA Purification Kit DNA純化回收試劑盒回收目的片段，將回收產(chǎn)物連接到pMD20-T載體上，然后轉化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，菌液涂布于含100 mg·L-1Amp的LB平板上進行篩選，挑取陽性單菌落進行PCR檢測，將條帶正確的5個陽性克隆菌株送至鉑尚生物技術(福州)有限公司測序。

1.2.3 生物信息學分析 利用ORF Finder(http：∥www.bioinformatics.org/sms2/orf_find.html)預測黃毛草莓CN基因編碼的氨基酸序列；利用NCBI網(wǎng)站中BLAST程序(https：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)預測其保守結構域和尋找同源性較高的氨基酸序列；使用DNAMAN 7.0軟件進行不同種類間同源基因編碼氨基酸序列的相似性比較；使用MEGA 6.0軟件中的鄰接(NJ)法構建系統(tǒng)進化樹；利用Expasy-ProParam (https：∥web.expasy.org/protparam/)預測黃毛草莓CN基因編碼氨基酸序列的理化性質；通過在線網(wǎng)站SignalP 4.1(http：∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/?tdsourcetag=s_pctim_aiomsg)進行信號肽預測；使用TMHMM軟件(http：∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進行跨膜預測；利用在線工具PSORT Prediction(http：∥psort.hgc.jp/form2.html)進行亞細胞定位預測；利用SOPMA(https：∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預測黃毛草莓CN蛋白的二級結構；利用PlantCARE數(shù)據(jù)庫(http：∥bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對啟動子序列進行順式作用元件預測。

1.2.4 植物過表達載體和病毒誘導基因沉默載體構建 根據(jù)上述測序結果設計帶有BamHⅠ和KpnⅠ酶切位點的植物過表達載體引物，F(xiàn)nCN-over-F序列為5′-CGGGATCCCGATGGAGTTTGCCGCCATCATTGCT-3′，F(xiàn)nCN-over-R序列為5′-GGGGTACCCCTTCTCCCACACATAACAGACTTTT-3′，進行PCR擴增，擴增體系和程序同1.2.2。用BamHⅠ和KpnⅠ對FnCN-over質粒和植物過表達載體pCAMBIA1301-HA質粒進行雙酶切，回收目的基因小片段和植物過表達載體大片段。根據(jù)黃毛草莓CN基因的沉默區(qū)間設計帶BamHⅠ和XbaⅠ酶切位點的病毒誘導基因沉默載體引物，TRV2-FnCN-F序列為5′-GCTCTAGAGCCCAACAACCATGGGCGTGTCAAAG-3′，TRV2-FnCN-R序列為5′-CGGGATCCCGGTTTTCTGAGACACATACCCACAT-3′，進行PCR擴增，擴增體系和程序同1.2.2。用BamHⅠ和XbaⅠ對TRV2-FnCN質粒和病毒載體pTRV2進行雙酶切，獲得目的基因小片段和病毒載體大片段。用Solution Ⅰ連接雙酶切基因小片段和載體大片段，轉化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，用含100 mg·L-1Kana的LB培養(yǎng)基進行篩選，挑取單菌落進行PCR檢測，培養(yǎng)陽性菌株提取質粒進行酶切驗證，選取5個條帶正確的陽性菌株送至鉑尚生物技術(福州)有限公司測序。

1.2.5 黃毛草莓CN基因實時熒光定量PCR(RT-qPCR)分析 采用RT-qPCR檢測黃毛草莓葉片在接種膠孢炭疽菌后0、3、6、12、24、48和72 h黃毛草莓CN基因的相對表達量，以草莓Actin基因(GenBank登錄號AB116565)為內參基因。使用PrimeScript?RT reagent Kit反轉錄試劑盒反轉錄合成cDNA用于RT-qPCR定量分析，RT-qPCR擴增引物Real-FnCN-F序列為5′-CGCCATCATTGCTGAGAACA-3′，Real-FnCN-R序列為5′-GCGTACCTGTCCTTTGACAC-3′。內參基因擴增引物Real-FnActin-F序列為5′-GCCAGAAAGATGCTTATGTCGGTG-3′，Real-FnActin-R序列為5′-TGGGGCAACACGAAGCTCAT-3′。擴增體系總體積為12.50L，包括SYBR Premix ExTaqTM6.25L、正向和反向引物各0.50L、cDNA模板1.00L和無菌水4.25L。擴增程序為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s，40個循環(huán)。每個樣品均設置3次生物學重復和技術重復，采用2-ΔΔCT法[23]分析黃毛草莓CN基因的相對表達量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用EXCEL 2010和SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用單因素方差分析和Duncan’s多重比較方法進行差異顯著性分析。

2 結果和分析

2.1 黃毛草莓FnCN基因和啟動子克隆及序列分析結果

2.1.1 黃毛草莓FnCN基因克隆及序列分析 根據(jù)獲得的黃毛草莓轉錄組數(shù)據(jù)與野草莓(FragariavescaLinn.)相同的unigene，通過Primer 5.0軟件設計，利用引物FnCN-F和FnCN-R，以黃毛草莓葉片cDNA為模板進行PCR擴增，得到1個長度約1 000 bp的條帶(圖1)。然后進行連接轉化、菌液PCR檢測陽性克隆及測序，結果顯示：黃毛草莓FnCN基因的開放閱讀框長度為933 bp(GenBank登錄號MN240290)，共編碼310個氨基酸殘基。通過生物信息學分析，F(xiàn)nCN基因編碼的氨基酸序列的N端包含1個Rx-CC結構域，C端包含1個保守的NB-ARC結構域(圖2)。上述結果表明：FnCN基因屬于NB-ARC類基因家族。

M： DL2000 DNA marker； 1： FnCN基因FnCN gene.圖1 黃毛草莓FnCN基因的PCR擴增結果Fig. 1 PCR amplification result of FnCN gene from Fragaria nilgerrensis Schlecht. ex Gay

首尾方框分別示起始密碼子和終止密碼子The boxes in the beginning and end represent start codon and stop codon， respectively； Rx-CC，NB-ARC： 結構域Domain.圖2 黃毛草莓FnCN基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列Fig. 2 Nucleotide sequence of FnCN gene from Fragaria nilgerrensis Schlecht. ex Gay and its encoding amino acid sequence

2.1.2 啟動子克隆及序列分析 利用引物P-FnCN-F和P-FnCN-R從黃毛草莓基因組DNA中擴增得到1個長度約900 bp的啟動子條帶(圖3)。測序結果顯示，該啟動子序列的長度為910 bp，命名為pFnCN(GenBank登錄號MN240291)。利用PlantCARE數(shù)據(jù)庫對該序列進行順式作用元件預測，結果(圖4)表明：該啟動子不僅含有TATA-box(核心啟動子元件)和CAAT-box(啟動子和增強子區(qū)的順式作用元件)等基本順式作用元件，還存在TGACG-motif(茉莉酸甲酯響應元件)、ABRE(脫落酸響應元件)、MBS(干旱誘導MYB結合位點)、G-box(光響應元件)、GT1-motif(光響應元件)和ARE(厭氧誘導順式作用元件)等。說明黃毛草莓FnCN基因能響應多種植物激素的誘導，在黃毛草莓受到逆境脅迫時可能發(fā)揮重要作用。

M： DL2000 DNA marker； 1： FnCN基因啟動子FnCN gene promoter.圖3 黃毛草莓FnCN基因啟動子的PCR擴增結果Fig. 3 PCR amplification result of FnCN gene promoter from Fragaria nilgerrensis Schlecht. ex Gay

CAAT-box： 啟動子和增強子區(qū)的順式作用元件Cis-acting element in promoter and enhancer regions； ABRE： 脫落酸響應元件Abscisic acid responsive element； TATA-box： 核心啟動子元件Core promoter element； MBS： 干旱誘導MYB結合位點MYB binding site in drought induction； ARE： 厭氧誘導順式作用元件Cis-acting element in anaerobic induction； GT1-motif，G-box： 光響應元件Light responsive element； TGACG-motif： 茉莉酸甲酯響應元件Methyl jasmonate responsive element.圖4 黃毛草莓FnCN基因啟動子序列及其順式作用元件Fig. 4 Sequence of FnCN gene promoter and its cis-acting element from Fragaria nilgerrensis Schlecht. ex Gay

2.2 黃毛草莓FnCN基因編碼氨基酸序列的理化性質及同源性分析

2.2.1 理化性質分析 Expasy-ProParam預測結果表明：黃毛草莓FnCN基因編碼氨基酸序列的分子式為C1567H2524N432O475S9，理論相對分子質量為35 304.43，理論等電點為pΙ 5.43，不穩(wěn)定系數(shù)為29.57，脂肪系數(shù)為104.00，總平均親水性(GRAVY)為-0.279，推測FnCN蛋白為穩(wěn)定的親脂親水性蛋白。SignalP 4.1預測結果表明：FnCN基因編碼的氨基酸序列無信號肽，說明FnCN蛋白不是分泌蛋白。TMHMM預測結果表明：FnCN基因編碼氨基酸序列中第1至第310位的氨基酸殘基均在膜外，表明其不存在跨膜區(qū)。PSORT Prediction預測結果表明：FnCN蛋白在細胞質中的可能性較大，推測FnCN蛋白位于細胞質中。SOPMA預測結果表明：FnCN蛋白二級結構中包含63.55%的α-螺旋(α-helix)、22.26%的無規(guī)則卷曲(random coil)、11.61%的延伸鏈(extended strand)以及2.58%的β-轉角(β-turn)。

2.2.2 同源序列比對和進化樹分析 BLAST分析結果顯示：黃毛草莓FnCN基因與GenBank上已經(jīng)公布的野草莓(GenBank登錄號XP_004306372.1)、月季花(RosachinensisJacq.，GenBank登錄號XP_024155851.1)和白梨(PyrusbretschneideriRehd.，GenBank登錄號XP_009334476.1)的CN基因編碼的氨基酸序列的相似性分別為95.16%、77.42%和55.77%。氨基酸序列同源性比較結果(圖5)表明：黃毛草莓FnCN基因與野草莓CN基因編碼氨基酸序列的同源性最高，其次為月季花和白梨。

系統(tǒng)進化樹(圖6)顯示：黃毛草莓和野草莓首先聚在一起，然后再與月季花聚為一個分支，三者均為薔薇亞科(Subfam. Rosoideae Focke)植物，說明這3個種類的進化關系較近，加之其同源性也較高，推測其蛋白質功能也相近。山荊子〔Malusbaccata(Linn.) Borkh.，GenBank登錄號TQE08476.1〕、白梨、梅(ArmeniacamumeSieb.，GenBank登錄號XP_008238997.1)、桃(AmygdaluspersicaLinn.，GenBank登錄號XP_020420253.1)、蘋果(MaluspumilaMill.，GenBank登錄號XP_008361183.2)、歐洲甜櫻桃〔Cerasusavium(Linn.) Moench，GenBank登錄號XP_021802074.1〕和扁桃(AmygdaluscommunisLinn.，GenBank登錄號BBH04143.1)聚為另一個分支，與黃毛草莓的親緣關系較遠。

Fn： 黃毛草莓Fragaria nilgerrensis Schlecht. ex Gay； Fv： 野草莓Fragaria vesca Linn.； Rc： 月季花Rosa chinensis Jacq.； Pb： 白梨Pyrus bretschneideri Rehd. EDVID，P-loop，RNBS-A，WalkerB： 基序Motif； Rx-CC，NB-ARC： 結構域Domain.圖5 黃毛草莓FnCN基因與其他種類CN基因編碼氨基酸序列的同源性比較結果Fig. 5 Homology comparison result of amino acid sequences encoded by FnCN gene from Fragaria nilgerrensis Schlecht. ex Gay and by CN gene from other species

遺傳距離 Genetic distance分支上數(shù)據(jù)為置信度Datums in the branches are confidence. Mb： 山荊子Malus baccata (Linn.) Borkh.； Pb： 白梨Pyrus bretschneideri Rehd.； Am： 梅Armeniaca mume Sieb.； Ap： 桃Amygdalus persica Linn.； Mp： 蘋果Malus pumila Mill.； Ca： 歐洲甜櫻桃Cerasus avium (Linn.) Moench； Ac： 扁桃Amygdalus communis Linn.； Rc： 月季花Rosa chinensis Jacq.； Fn： 黃毛草莓Fragaria nilgerrensis Schlecht. ex Gay； Fv： 野草莓Fragaria vesca Linn.圖6 黃毛草莓FnCN基因與其他種類CN基因編碼氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹Fig. 6 Phylogenetic tree of amino acid sequences encoded by FnCN gene from Fragaria nilgerrensis Schlecht. ex Gay and by CN gene from other species

2.3 植物過表達載體和病毒誘導基因沉默載體的構建

根據(jù)序列信息設計帶有酶切位點BamHⅠ和KpnⅠ的植物過表達載體引物FnCN-over-F和FnCN-over-R以及BamHⅠ和XbaⅠ酶切位點的病毒誘導基因沉默載體引物TRV2-FnCN-F和TRV2-FnCN-R分別進行PCR擴增，分別獲得長度933和445 bp的目的基因片段(圖7-A，D)。篩選單菌落進行PCR檢測(圖7-B，E)，提取陽性菌株質粒進行雙酶切驗證，電泳結果顯示2個條帶(圖7-C，F(xiàn))，對陽性菌株的測序結果與預期構建序列一致，說明成功構建出植物過表達載體pCAMBIA1301-HA-FnCN和病毒誘導基因沉默載體pTRV2-FnCN。

2.4 接種膠孢炭疽菌后FnCN基因的表達分析

實時熒光定量PCR檢測結果(圖8)顯示：對照(接種無菌水)組黃毛草莓葉片F(xiàn)nCN基因的相對表達量變化不大。接種膠孢炭疽菌后，隨著時間的推移，F(xiàn)nCN基因的相對表達量呈“降低—升高—降低”的變化趨勢，其中，接種后3 hFnCN基因的相對表達量最低；接種后48 hFnCN基因的相對表達量最高，為接種后0 h的3.3倍；接種后24和72 hFnCN基因的相對表達量也顯著高于接種后0 h，分別為接種后0 h的2.7和2.6倍。

M1： DL2000 DNA marker； M2： DL5000 DNA marker； 1： FnCN基因過表達區(qū)PCR擴增結果PCR amplification result of FnCN gene overexpression region； 2，3： FnCN-over陽性菌株鑒定Positive strain identification of FnCN-over； 4： BamH Ⅰ and Kpn Ⅰ酶切驗證pCAMBIA1301-HA-FnCN重組質粒BamH Ⅰ and Kpn Ⅰ digested the recombinant plasmid pCAMBIA1301-HA-FnCN； 5： FnCN基因沉默區(qū)PCR擴增結果 PCR amplification result of FnCN gene silencing region； 6-8： pTRV2-FnCN陽性菌株鑒定Positive strain identification of pTRV2-FnCN； 9： BamH Ⅰ和Xba Ⅰ酶切驗證pTRV2-FnCN重組質粒BamH Ⅰ and Xba Ⅰ digested the recombinant plasmid pTRV2-FnCN.圖7 黃毛草莓FnCN基因植物過表達載體和病毒誘導基因沉默載體的構建Fig. 7 Construction of plant over-expression vector and virus induced gene silencing vector of FnCN gene from Fragaria nilgerrensis Schlecht. ex Gay

： 對照(接種無菌水)The control (inoculated with aseptic water)； ： 接種膠孢炭疽菌Inoculated with Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc.同一處理不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著 Different lowercases indicate the significant difference at 0.05 level in the same treatment.圖8 接種膠孢炭疽菌后黃毛草莓葉片F(xiàn)nCN基因相對表達量的變化Fig. 8 Change in relative expression of FnCN gene from leaf of Fragaria nilgerrensis Schlecht. ex Gay after inoculated with Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc.

3 討論和結論

植物在生長過程中為抵抗外界不良環(huán)境逐漸進化出2個層次的防御機制，一是細胞受體識別病原相關分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMP)觸發(fā)的免疫反應(PAMP triggered immunity，PTI)，二是抗性(resistance，R)蛋白特異性識別病原分泌的效應因子(毒性因子)觸發(fā)的免疫反應(effectors triggered immunity，ETI)。ETI能進一步引起植物超敏反應(hypersensitive response，HR)，較PTI能更加迅速和有效抑制病原菌的侵入[24]。而NB-ARC類抗病蛋白是目前植物中數(shù)量最多的一類R蛋白，在不同植物中克隆出的抗病基因中，NB-ARC類抗病基因占80%[25]，已成為植物抗病機制研究和抗病育種的研究熱點。NB-ARC類抗病蛋白中包含1個或多個結構域，其中，NB-ARC結構域在進化過程中具有較高的保守性，其通過轉導核苷酸結合狀態(tài)ATP/GTP信號，從而調節(jié)NB-ARC類抗病蛋白的活性[26]。Rx-CC結構域則缺乏保守性，郝煒[27]發(fā)現(xiàn)，Rx-CC結構域的EDVID基序起連接Rx-CC結構域和NB-ARC結構域的橋梁作用，介導二者間的分子相互作用，有利于傳遞病原效應蛋白的識別信號。本研究利用同源克隆技術從黃毛草莓中克隆到1個NB-ARC類抗病基因FnCN，其編碼氨基酸序列中包含1個Rx-CC結構域和1個NB-ARC結構域，表明NB-ARC類抗病基因在進化過程中為了適應多變的環(huán)境將具有重要功能的結構域保留下來。

啟動子是轉錄水平上調控基因表達的順式作用元件，具有轉錄起始的特異性和表達的高效性[28]，Marone等[29]指出，NB-ARC類抗病基因的表達受順式和反式作用元件的精細調控，因此，對其啟動子的結構進行分析對于了解植物的防御機制有重要意義。已有研究結果表明：NB-ARC類抗病基因能響應外源激素脅迫，如‘久香’草莓(Fragaria×ananassa‘Jiuxiang’)葉片經(jīng)外源茉莉酸甲酯和脫落酸處理后，F(xiàn)aNBS1基因的轉錄水平發(fā)生明顯變化，其中，茉莉酸甲酯顯著抑制FaNBS1基因的表達[30]。本研究克隆的黃毛草莓FnCN基因上游長度為910 bp的啟動子序列中含有植物激素響應元件，如茉莉酸甲酯響應元件TGACG-motif和脫落酸響應元件ABRE等，由此推測FnCN基因的表達受多種激素和環(huán)境信號的調控，可能參與了黃毛草莓抵御病害的信號調控。

已有研究結果[31]表明：植物R基因在沒有病原體侵染的狀態(tài)下表達水平相對較低，當植株受到病原體侵染時，R基因表達水平提高，從而增強植株抗性。Wen等[32]研究發(fā)現(xiàn)，中國野生華東葡萄(VitispseudoreticulataW. T. Wang)株系白河-35-1(Baihe-35-1)接種白粉菌〔Erysiphenecator(Schw.)〕后，VpCN基因的轉錄水平是接種前的4.2倍，將該基因進行異源表達，結果表明轉基因擬南芥〔Arabidopsisthaliana(Linn.) Heynh.〕對白粉病的抗性增強。本研究中，接種膠孢炭疽菌后，黃毛草莓葉片F(xiàn)nCN基因的相對表達量先降低，接種后24～72 h其相對表達量顯著高于接種后0 h，表明黃毛草莓FnCN基因在病原菌侵染后先被抑制表達，然后被誘導表達。前人研究發(fā)現(xiàn)，SA信號途徑主要作用于植物遭受細菌和真菌等病原物侵染，而JA信號途徑主要作用于植物受到機械損傷和蟲害等創(chuàng)傷，二者在信號轉導過程中存在一定的相互拮抗和協(xié)同作用[33-34]。張慶雨等[35]研究發(fā)現(xiàn)，草莓中FaNBS20基因在外源SA和病原菌的誘導下顯著表達，表明FaNBS20基因可能通過SA信號途徑參與草莓對炭疽病的防御反應。因此，初步判斷FnCN基因可能屬于JA信號轉導途徑上的調控因子，前期黃毛草莓植株通過SA信號途徑參與膠孢炭疽菌侵染的防御反應，F(xiàn)nCN基因被抑制表達，隨后膠孢炭疽菌侵染信號進一步通過JA信號途徑轉導，F(xiàn)nCN基因相對表達量顯著提高，與SA和JA信號途徑上的相關基因共同參與病原菌的抵抗反應。此外，F(xiàn)nCN基因在病原菌侵染前期表達下調的原因可能是FnCN基因在參與識別病原菌侵染信號的過程中，受到上游其他抗病蛋白的調控，所以在侵染前期基因相對表達量呈現(xiàn)降低趨勢，在后續(xù)研究中將通過酵母單雜交尋找上游調控蛋白。雖然本研究表明FnCN基因可能在黃毛草莓對炭疽病的防御反應中發(fā)揮一定作用，但其在黃毛草莓抗炭疽病過程中的具體作用途徑尚未明確，在今后的研究中，將利用遺傳轉化等生物技術對黃毛草莓FnCN基因進行深入研究，進一步明確該基因在黃毛草莓抗炭疽病方面的分子防御功能。