遠紅外陶瓷粉對精油與BSA相互作用的影響

黃 芳，劉明學，2*，熊 杰，陳律奇，高竹欣，陳慧明，王丹妮

1. 西南科技大學生命科學與工程學院，四川 綿陽 621010 2. 核廢物與環(huán)境安全省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，四川 綿陽 621010

引 言

遠紅外是一種電磁輻射，因人體的紅外吸收能量處于遠紅外波長范圍之內(nèi)，遠紅外材料能夠?qū)θ梭w細胞產(chǎn)生較強的共振作用。遠紅外材料，作為廣泛可用的功能材料，在醫(yī)療保健上受到關(guān)注。研究表明遠紅外輻射能增加生物活性，利用此性能可以進行理療(如熱桑拿)或制作各種保健產(chǎn)品(如遠紅外熱燈、 紅外保健織物、 熱敷袋等)，可增強相關(guān)功效[1-2]。

精油因具有抗炎和抗氧化等多種生物活性而被越來越多地用于醫(yī)療保健、 美容等領(lǐng)域，被譽為“液體黃金”。利用精油的揮發(fā)性，通過嗅吸和皮膚滲透[3]而產(chǎn)生明顯的心理、 生理反應(yīng)，從而達到醫(yī)療保健、 美容的目的。

遠紅外材料結(jié)合精油的醫(yī)療保健方式受到廣泛的關(guān)注。在李云平等[4]的研究中，利用遠紅外線照射結(jié)合精油按摩的方式可提高療效。另外，市面上也有將精油添加到遠紅外材料制品中制成的各種理療貼如遠紅外磁療貼、 遠紅外艾灸貼等。但未見遠紅外材料對精油與牛血清蛋白(bovine serum albumin, BSA)相互作用影響的報道。研究遠紅外材料對具有生物活性的精油小分子與生物大分子的相互作用，闡述兩者相互作用在醫(yī)療保健上的作用機制，具有一定的理論與應(yīng)用價值。

小分子與大分子相互作用的研究除了光譜法，有些還會結(jié)合各種色譜、 電化學以及分子對接等方法探究其機理，但用紅外熱成像技術(shù)研究小分子與BSA大分子作用的文章還鮮有報道。利用此技術(shù)，可以全面、 整體、 動態(tài)地采集和分析物體的溫度信息，評價能量輻射的狀況[5]。如文建等[6]利用紅外熱成像觀察光子貼的療效，發(fā)現(xiàn)紅外熱成像對光子理療貼聯(lián)合法治療慢性膝痛的療效評價具有很好的臨床應(yīng)用價值。

目前，國內(nèi)外對于精油小分子或納米材料作用于BSA的研究有相關(guān)報道[7-8]，但兩者結(jié)合以及使用具有遠紅外射線輻射效應(yīng)的納米材料的研究未見報道。鑒于此，選用常見的遠紅外輻射材料——遠紅外陶瓷粉(far-infrared ceramic powder, cFIR)，利用光譜法及紅外熱成像技術(shù)研究cFIR對玫瑰精油(rose essential oil, REO)與BSA相互作用的影響及其作用機制，為遠紅外材料結(jié)合精油的理療研究及應(yīng)用提供相關(guān)的科學基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

熒光分光光度計(F-7000，日本日立公司)；鈉燈(上海亞明照明有限公司)；紅外成像儀(TiS20，福祿克公司)；傅里葉變換紅外吸收光譜儀(Nicolet5700，美國熱電儀器公司)；紫外分光光度計(U-3900H，天美科學儀器有限公司)。

玫瑰護理精油(廣州美頌生物科技有限公司)；普通陶瓷粉(common ceramic powder，CCP)、 遠紅外陶瓷粉(茂川礦業(yè))；BSA(阿拉丁試劑股份有限公司)，純度>98%；其余所用試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；實驗用水為去離子水。

1.2 溶液的配制

準確稱取10.0 mg遠紅外陶瓷粉，溶解在10.0 mL無水乙醇中，使用封口膜密封后超聲1 h后，用0.5 mol·L-1pH為7.4的Tris-HCl緩沖液配制成0.1 mg·mL-1的cFIR懸濁液；CCP懸濁液的配制方法同cFIR；準確稱取0.5 g玫瑰精油，用丙二醇定容至10.0 mL，配制成0.05 g·mL-1的精油懸濁液；準確稱取165.4 mg BSA，用Tris-HCl定容至50.0 mL，配制成5.0×10-5mol·L-1的BSA儲備液，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 方法

1.3.1 熒光光譜、 同步光譜的測定

準確移取濃度為5.0×10-6mol·L-1的BSA溶液3.0 mL于比色管中，逐次加入5.0 μL的REO懸濁液，即為BSA-REO二元體系，依次測定熒光光譜。在另一組實驗中，先逐次加入5.0 μL的cFIR懸濁液，依次測定；之后，向二元體系中逐次加入5.0 μL的Oil懸濁液，即為(BSA-cFIR)-REO三元體系，依次測定。在測試CCP對REO與BSA相互作用影響的熒光光譜時，只需將cFIR換成CCP即可，其余相同。

在熒光分光光譜的掃描中，參數(shù)設(shè)置為：激發(fā)波長λex為280 nm，掃描范圍為200～550 nm，掃描速度為240 nm·min-1，狹縫寬度為5 nm。

同步熒光光譜的掃描中，Δλ=15 nm與Δλ=60 nm對應(yīng)的起始發(fā)射波長分別為255和300 nm，激發(fā)波長范圍均為240～340 nm。

1.3.2 三維熒光光譜的測定

在熒光分光光度計中測試常溫條件下cFIR和REO與BSA相互作用時的三維光譜；參數(shù)設(shè)置為：激發(fā)波長λex為200～450 nm，發(fā)射波長200～500 nm，掃描速度1 200 nm·min-1，掃描間距為5 nm，狹縫寬度為5 nm。在BSA體系中逐次加入5.0 μL REO和5.0 μL cFIR，共5次。

1.3.3 紅外光譜的測定

室溫下測定不同體系的傅里葉變換紅外光譜(FTIR)，分辨率為4 cm-1，掃描范圍為4 000～400 cm-1；將樣品均勻地鋪滿KBr晶片，掃描樣品光譜；用Omnic和Peakfit軟件進行處理。

1.3.4 紅外成像的測定

用面膜模擬人的皮膚來測試紅外響應(yīng)溫度變化。將面膜剪成大小近似的小塊，晾干；然后將面膜放在不同的體系的離心管中，一段時間后取出來，晾干。在10 cm附近設(shè)鈉燈照射，用紅外成像儀測定在鈉燈照射下不同面膜的響應(yīng)溫度。將紅外成像儀設(shè)為自動模式，每5 s捕捉一張，一次設(shè)置捕捉30張，在不同時間段重復(fù)實驗，得到180組數(shù)據(jù)，用單因素方差分析的方法對數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同體系的熒光光譜分析

圖1給出了陶瓷粉和精油對BSA猝滅曲線。熒光猝滅是由于猝滅劑與生色基團的相互接觸而引起的熒光量子產(chǎn)率下降[9]。猝滅劑對蛋白質(zhì)的熒光猝滅分為靜態(tài)猝滅、 動態(tài)猝滅。動態(tài)猝滅主要是由分子擴散引起，靜態(tài)猝滅主要是由于分子間相互作用形成復(fù)合物引起。由圖1可知，在激發(fā)波長為280 nm的條件下，BSA最大熒光峰出現(xiàn)在340 nm左右。REO和cFIR與BSA作用的體系中，隨著猝滅劑的不斷加入，熒光強度逐漸下降，峰形也出現(xiàn)了略微的藍移；表明陶瓷粉和精油與BSA間發(fā)生了相互作用與能量轉(zhuǎn)移，使BSA的內(nèi)源性熒光發(fā)生了猝滅。而CCP-REO與BSA作用的體系，熒光強度也下降，說明與BSA也發(fā)生了相互作用，但并無規(guī)律。因此，在后續(xù)的研究中主要對cFIR-REO進行探討。

圖1 不同體系與BSA作用的熒光猝滅曲線Fig.1 Fluorescent quenching curves of BSA in different systems(a): (BSA-cFIR)-REO; (b): BSA-REO; (c): (BSA-CCP)-REO;(0—14): c(BSA)=5×10-6 mol·L-1; c(cFIR/CCP)(0—7): (0，0.19，0.38，0.57，0.76，0.95，1.14，1.33)×10-5 mol·L-1 (8—14): c(RE0)=(0.19，0.38，0.57，0.76，0.95，1.14，1.33)×10-4 mol·L-1 (15—22): c(BSA)=5×10-6 mol·L-1; c(RE0) (15—22): (0，0.19，0.38，0.57，0.76，0.95，1.14，1.33)×10-4 mol·L-1

假設(shè)遠紅外陶瓷粉和/或精油與BSA作用的機制為動態(tài)猝滅，利用Stern-Volmer方程(1)對不同體系的猝滅情況進行計算，將結(jié)果列于表1中。

表1 二元/三元體系的Stern-Volmer常數(shù)Table 1 Stern-Volmer constants in binary/ternary systems

(1)

在式(1)中，F(xiàn)0和F分別代表未加入猝滅劑和加入猝滅劑時蛋白質(zhì)的熒光強度，KSV為Stern-Volmer熒光猝滅常數(shù)；Kq為動態(tài)猝滅速率常數(shù)；[Q]為所加猝滅劑的濃度；τ0為不存在猝滅劑的情況下大分子物質(zhì)生物體內(nèi)的內(nèi)源熒光壽命(τ0≈10-8s)。

據(jù)報道，各類熒光猝滅劑對生物大分子的最大動態(tài)猝滅速率常數(shù)為2.0×1010L·mol-1·s-1[7]；由表1可知，兩個體系的動態(tài)猝滅常數(shù)均大于最大值，故判斷cFIR-REO與REO對BSA的猝滅機制均為靜態(tài)猝滅。其中REO的猝滅機制與Leila等[8]研究的百里香酚相似；另外，Sekar等[10]證明揮發(fā)油納米乳共軛物、 Riaz等[11]證明蓖麻油聚氨酯納米復(fù)合材料對蛋白質(zhì)的猝滅機制為靜態(tài)猝滅。

2.2 結(jié)合位點數(shù)n與表觀結(jié)合常數(shù)Ka

對于靜態(tài)猝滅方式，不同體系的結(jié)合位點數(shù)n與結(jié)合常數(shù)都可由靜態(tài)猝滅雙對數(shù)式(2)計算。將結(jié)果列于表2中。

表2 不同體系下的結(jié)合位點數(shù)n、 結(jié)合常數(shù)KaTable 2 The binding site number n and the binding constant Ka of different system

lg[(F0-F)]/F=nlg[Q]+lgKa

(2)

由表2可知，在cFIR的參與下，REO與BSA相互作用的結(jié)合位點數(shù)n與結(jié)合常數(shù)Ka明顯提高。兩個體系的結(jié)合位點數(shù)分別與百里香酚[8]、 揮發(fā)油納米乳[10]類似。在三元體系中，n的值近似為1，說明BSA在cFIR和REO上存在一個有效結(jié)合位點；另外，結(jié)合常數(shù)達到了103(L·mol-1)以上，進一步說明二者與BSA之間存在強有效的作用力，cFIR的存在可促進REO與BSA的結(jié)合，其可能是REO與cFIR之間存在協(xié)同作用，使得與BSA作用時結(jié)合常數(shù)增大。

2.3 cFIR-REO對BSA構(gòu)象的影響

2.3.1 同步熒光光譜分析

因同步熒光光譜具有簡單、 避免擾動等優(yōu)點常用來研究蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化。熒光峰的位置與蛋白質(zhì)的構(gòu)象相關(guān)，極性的變化常常引起最大吸收波長的變化，若發(fā)生紅移，則說明氨基酸周圍極性增大，反之減小。當激發(fā)波長和發(fā)射波長之間的Δλ設(shè)置為15和60 nm時，同步熒光光譜給出了Tyr和Trp殘基的特征信息[10]。(BSA-cFIR)-REO體系的同步熒光光譜如圖2所示。

由圖2可以看出，在(BSA-cFIR)-REO體系中，Trp和Tyr的熒光強度都降低，Trp熒光峰規(guī)律性的下降，而Tyr在只加cFIR時逐漸減低，繼續(xù)加入REO后則無梯度規(guī)律性；另外，Trp的最大吸收峰出現(xiàn)了輕微的藍移，而Tyr的熒光峰幾乎沒有移動，且Trp猝滅程度大于Tyr，說明REO和cFIR與BSA的結(jié)合更偏向色氨酸殘基，使Trp周圍的極性降低，疏水性增加，導(dǎo)致BSA構(gòu)象發(fā)生略微的變化。同步熒光光譜的說明cFIR的加入會使BSA的Trp暴露在一個相對疏水的環(huán)境。Trp的行為與Mahanthappa等[7]研究的納米硫化銅、 Riaz等[11]研究的兩親性材料類似。

圖2 (BSA-cFIR)-REO同步熒光光譜Fig.2 (BSA-cFIR)-REO synchronous fluorescence spectrum(a)：Δλ=60 nm；(b)：Δλ=15 nm c(BSA)=5×10-6 mol·L-1; c(cFIR)(0—5): (0，0.19，0.38，0.57，0.76，0.95)×10-5 mol·L-1; c(REO) (6—10): (0，0.19，0.38，0.57，0.76，0.95)×10-4 mol·L-1

2.3.2 三維熒光光譜分析

三維熒光光譜常用來揭示小分子對蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響。為了進一步探究cFIR和REO與BSA作用的影響，測定了BSA-REO-cFIR體系的三維熒光光譜圖。BSA的三維熒光圖見圖3。將所有體系的三維熒光光譜特征參數(shù)列于表3中。

圖3 BSA的三維熒光光譜圖Fig.3 Three-dimensional fluorescence spectrum of BSA

Peak a主要代表瑞利散射峰，常用來表示大分子直徑的變化。由表3可知隨著REO和cFIR的不斷加入Peak a的強度不斷增強，說明兩者與BSA相互作用形成了締合物，締合物使體系的摩爾質(zhì)量增大，導(dǎo)致瑞利光散射增強而內(nèi)源性熒光降低[7]。

Peak 1代表Tyr和Trp的熒光特征峰，其變化主要與氨基酸周圍極性的改變有關(guān)；Peak 2是BSA多肽骨架結(jié)構(gòu)的熒光光譜特征峰，該峰是由多肽骨架發(fā)生π→π*躍遷引起的，其變化與BSA二級結(jié)構(gòu)的改變有關(guān)[7]；由表3可知，Peak 1和Peak 2的熒光強度隨著猝滅劑的加入在一定程度上都在不斷降低，且Peak 2伴隨輕微藍移，說明了BSA與cFIR和REO結(jié)合后多肽骨架受到影響，疏水性增強，以至BSA二級結(jié)構(gòu)發(fā)生略微的變化。該結(jié)論與同步熒光光譜一致。

表3 不同體系中的三維熒光光譜特征參數(shù)Table 3 Characteristic parameters of three-dimensional fluorescence spectra of different systems

Campana等[12]利用中子反射的研究觀察到BSA在油水界面有更高的吸附作用，提出在疏水性較強的界面處，蛋白質(zhì)的吸附性更高的結(jié)論。這一結(jié)論為該結(jié)果提供一定的論據(jù)，說明加入cFIR后，使蛋白質(zhì)處在相對疏水的環(huán)境，該環(huán)境更利于REO與BSA的結(jié)合。

2.3.3 傅里葉變換紅外光譜分析

為定量分析BSA蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化，利用Gaussian去卷積和二階導(dǎo)數(shù)擬合對酰胺Ⅰ帶進行處理，如圖4所示。根據(jù)擬合的結(jié)果，計算BSA的二級結(jié)構(gòu)比例。由表4可知，隨著cFIR，REO和cFIR-REO的加入，α-helix的比例均略微降低，其他結(jié)構(gòu)含量升高，說明兩者的加入會使蛋白質(zhì)分子變得更加松散，BSA的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生略微變化。另外，REO和cFIR共同作用時α-helix含量為26.66%，該值介于cFIR與REO單獨作用的值之間，說明二者存在協(xié)同作用。

圖4 不同體系的酰胺Ⅰ帶擬合圖Fig.4 Amide Ⅰ band fitting maps for different systems(a): BSA; (b): BSA-cFIR; (c): BSA-REO; (d): BSA-cFIR-REO

表4 不同體系的二級結(jié)構(gòu)擬合結(jié)果Table 4 Fitting results of secondary structures for different systems

2.4 從BSA到REO-cFIR的能量轉(zhuǎn)移

2.4.1 結(jié)合距離計算

根據(jù)F?rster非輻射能量轉(zhuǎn)移理論[14]，若供體與受體之間滿足以下三個條件，將會發(fā)生非輻射能量轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致熒光猝滅：①供體能夠給出熒光；②供體的熒光光譜與受體的紫外光譜有充分的重疊；③供體與受體的結(jié)合距離小于7 nm。根據(jù)此理論，非輻射能量轉(zhuǎn)移效率E、 供體與受體之間的結(jié)合距離r、 臨界能量轉(zhuǎn)移距離R0及光譜的重疊積分J可由式(3)—式(5)計算

(3)

(4)

J=∑F(λ)ε(λ)λ4Δλ/∑F(λ)Δλ

(5)

式中，K2為偶極空間取向因子，一般取平均值2/3；φ為量子產(chǎn)率，對于BSA，取0.118[14]；n為介質(zhì)的折射率，取水和有機物的平均值1.336；J為供體的熒光光譜與受體的紫外光譜的重疊積分；F與F0分別為受體存在與不存在時BSA的熒光強度；ε為受體在相應(yīng)波長下的摩爾吸收系數(shù)[14]。圖5給出了cFIR存在或不存在時，BSA的熒光光譜與REO的紫外光譜重疊圖。

圖5 有(a)無(b)cFIR時BSA發(fā)射光譜與REO紫外光譜重疊圖Fig.5 The overlap of the emission spectrum of BSA and UV spectrum of REO with (a) or without (b) cFIR in the systems

利用Origin計算出當cFIR存在與不存在時各個物理量的值，將結(jié)果列于表5中。

表5 有無cFIR時F?rster非輻射能量轉(zhuǎn)移特征參數(shù)Table 5 Characteristic parameters of nonradiative energy transfer of F?rster with or without cFIR

由表5的結(jié)果可知，兩個體系的結(jié)合距離都小于7 nm，說明在cFIR存在或不存在的情況下，REO對BSA熒光靜態(tài)猝滅的同時也伴隨著非輻射能量轉(zhuǎn)移；R0

2.4.2 不同體系對熱輻射的響應(yīng)分析

紅外熱成像是利用物體不同的輻射能力和對紅外線的反射強弱，將不可見的紅外輻射變成可見的熱圖像。紅外熱成像圖其實就是物體溫度分布的圖像。圖6展現(xiàn)了在鈉燈的照射下拍攝不同體系的特征紅外熱成像圖。

圖6 鈉燈照射下不同體系面膜的紅外熱成像圖(紅色區(qū)域代表面膜)Fig.6 Thermograph of the mask in different systems irradiated by sodium lamp (red area represents mask)

從圖6可以得出，在鈉燈照射下面膜的響應(yīng)溫度高于周圍的溫度。重復(fù)6次實驗，將180組數(shù)據(jù)取平均值作圖，利用SPSS軟件，利用LSD法進行方差分析，結(jié)果如圖7所示。

圖7 不同體系的紅外響應(yīng)溫度情況注：用LSD法進行多重比較，標有不同字母表示組間差異顯著(p<0.05)，標有相同字母表示組間差異不顯著Fig.7 Infrared response temperature of different systemsNote: Multiple comparisons are performed using the LSD method. Different letters of an alphabet are used to indicate significant differences between groups (p<0.05), and the same letters are used to indicate no significant differences between groups

圖6、 圖7結(jié)果顯示，純cFIR和BSA-cFIR體系在鈉燈照射后呈現(xiàn)最高的溫度響應(yīng)(兩者無顯著差異)，其次是純BSA、 純CCP、 純REO及BSA-CCP體系(四組間無顯著差異，與純cFIR和BSA-cFIR體系差異顯著，p<0.05)；溫度響應(yīng)最低的是BSA-REO體系(p<0.05)，而在該體系中加入陶瓷粉后(BSA-cFIR-REO體系和BSA-CCP-REO體系)溫度會升高，但仍然低于其他組(p<0.05)。這些現(xiàn)象說明單一體系、 二元體系、 三元體系呈現(xiàn)迥異的溫度響應(yīng)特征；與單一體系相比，精油可使生物分子的溫度降低，而cFIR可使生物分子溫度升高；共同作用時，cFIR的加入會使BSA-REO體系響應(yīng)的溫度增加，即熱效應(yīng)會增加(p<0.05)。按照李云平[4]等的說法，這個熱效應(yīng)可起擴張血管、 加速新陳代謝等作用。與普通陶瓷粉相比，遠紅外陶瓷粉的熱效應(yīng)更顯著。另一方面，用紅外成像技術(shù)用于研究小分子/納米顆粒與BSA之間相互作用受客觀因素的影響大，還需更廣泛的研究進一步闡明其作用。

3 結(jié) 論

利用熒光光譜法得出REO和cFIR與BSA的作用機制與結(jié)合情況，以此基礎(chǔ)再繼續(xù)用各種分析方法研究REO和cFIR對BSA構(gòu)象的影響，最后用紅外熱成像技術(shù)表征二者對BSA能量輻射的影響?；谝陨系姆治觯傻贸鋈缦聨c結(jié)論：(1)熒光光譜法表明無論遠紅外陶瓷粉是否存在，BSA與精油之間都存在相互作用和熒光猝滅，且主要作用機制主要為靜態(tài)猝滅；通過計算結(jié)合常數(shù)Ka與結(jié)合位點數(shù)n表明遠紅外陶瓷粉的加入會使精油與BSA的結(jié)合更加牢靠；(2)同步熒光光譜、 三維熒光光譜和FTIR的結(jié)果表明遠紅外陶瓷粉和精油對BSA的二級結(jié)構(gòu)產(chǎn)生略微的變化，兩者使氨基酸周圍的極性降低，疏水性增加，同時通過形成締合物的方式對BSA的內(nèi)源性熒光產(chǎn)生影響；F?rster非輻射能量轉(zhuǎn)移距離的計算進一步表明無論遠紅外陶瓷粉是否存在，精油與BSA之間都發(fā)生非輻射能量轉(zhuǎn)移，同時絡(luò)合物BSA-cFIR的形成改變了BSA的構(gòu)象，使其與精油的結(jié)合更加容易；(3)紅外熱成像結(jié)果表明遠紅外材料的加入能提高BSA-REO體系響應(yīng)的溫度，具有熱效應(yīng)。

因此，具有納米尺寸效應(yīng)和遠紅外射線輻射的納米紅外線陶瓷粉，在與精油共同作用于生物分子時，可通過形成締合物影響體系的微環(huán)境，從而影響熒光特征與能量傳遞。本研究結(jié)果可為精油結(jié)合遠紅外材料在醫(yī)療保健上的進一步應(yīng)用及機理研究提供參考。