負(fù)載于二氧化硅納米粒子的菲并咪唑衍生物對(duì)Hg2+的檢測(cè)

賈紅丹，邢文莉，宋玉姣，鄭社洪，高云燕，歐植澤

(西北工業(yè)大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，陜西 西安 710072)

汞離子是毒性最強(qiáng)的重金屬離子之一，易于與各種生物分子反應(yīng)，在濃度非常低的情況下也能造成各種疾病，例如肩痛和Hunter-Russell綜合征等[1-3]。汞離子還會(huì)通過食物鏈在人體中富集，嚴(yán)重威脅人類的身體健康[4,5]。鑒于汞離子的高毒性，我國規(guī)定生活飲用水中汞含量不得高于1 μg·L-1，工業(yè)廢水中汞的總含量不得高于50 μg·L-1，因此對(duì)水中汞離子進(jìn)行定量檢測(cè)非常重要。

熒光檢測(cè)法具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、選擇性好的優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于檢測(cè)各種物質(zhì)?；诠x子與配體之間的配位作用或汞離子引發(fā)的不可逆的化學(xué)反應(yīng)，可構(gòu)建汞離子熒光傳感器[6-8]。相對(duì)于配位作用而言，基于特定化學(xué)反應(yīng)的汞離子熒光傳感器具有更好的選擇性和抗干擾能力。利用Hg2+對(duì)硫縮醛的特殊反應(yīng)活性，可以設(shè)計(jì)基于分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ICT)機(jī)制的Hg2+熒光傳感器[9]。富電子的硫縮醛基團(tuán)與汞離子發(fā)生脫保護(hù)反應(yīng)后，生成吸電子的醛基，使化合物的ICT效應(yīng)增強(qiáng)，表現(xiàn)為熒光峰位紅移、熒光強(qiáng)度顯著變化等。苯并惡二唑、香豆素、萘酰亞胺、四苯乙烯等多種熒光基團(tuán)已用于制備含硫縮醛基團(tuán)的汞離子傳感器[10]。含硫縮醛基團(tuán)的汞離子熒光傳感器具有很高的靈敏度，其檢測(cè)限可達(dá)到nmol·L-1級(jí)，甚至是pmol·L-1級(jí)[11]。

菲并咪唑類衍生物具有合成簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好，熒光量子產(chǎn)率高等優(yōu)點(diǎn)，在光電器件和發(fā)光材料等領(lǐng)域中備受關(guān)注[12]。近年來，基于菲并咪唑衍生物的Hg2+熒光傳感器已有報(bào)道，這些傳感器的檢測(cè)限一般在25～250 nmol·L-1范圍內(nèi)[13-16]。然而，這些熒光傳感器大多水溶性差，不利于在水溶液中進(jìn)行檢測(cè)。如將熒光分子與二氧化硅納米粒子結(jié)合，構(gòu)建納米結(jié)構(gòu)的傳感器，可提高傳感器的靈敏度，并可實(shí)現(xiàn)在水相中對(duì)汞離子的檢測(cè)[17]?；诖怂悸?，本文設(shè)計(jì)合成了一種以硫縮醛為識(shí)別基團(tuán)、菲并咪唑?yàn)闊晒饣鶊F(tuán)的熒光傳感器PIP-S(圖1)，并將其負(fù)載于二氧化硅納米粒子上，可實(shí)現(xiàn)在水溶液中對(duì)汞離子的檢測(cè)，且檢測(cè)限小于15 nmol·L-1。

圖1 硫縮醛修飾的菲并咪唑衍生物PIP-S的合成路線

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

試劑：二乙氧基二甲基硅烷(DMDES)、正硅酸乙酯(TEOS)、F127(PEO106-PPO70-PEO106)、9,10-二苯基蒽、對(duì)苯二甲醛、2-巰基乙醇、對(duì)甲苯磺酸、9,10-菲醌、4-溴苯甲醛、4-甲?；脚鹚?、醋酸鈀、三苯基膦均購自梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司。Hg(NO3)2·H2O、Al(NO3)3·9H2O、Cr(NO3)3·9H2O、(CH3COO)2Pb、SnCl2·2H2O、LiCl、NaCl、Mg(NO3)2、KCl、FeCl3、CoCl2、CaCl2、ZnCl2、(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O、Ni(NO3)2、Cu(NO3)2、AgNO3、Cd(NO3)2及其它化學(xué)品均為分析純，購自北京化工廠。所用溶劑均經(jīng)過干燥，并在使用前重蒸處理。如無特殊說明，實(shí)驗(yàn)中所用緩沖溶液均為磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH 7.4，10 mmol·L-1)。

儀器：1H NMR光譜采用Bruker Avance 400核磁共振光譜儀測(cè)定，13C NMR光譜采用Bruker Avance 600核磁共振光譜儀測(cè)定，質(zhì)譜(MS)采用Bruker solariX FT-ICR-MS儀測(cè)定。穩(wěn)態(tài)吸收和熒光發(fā)射光譜分別采用Hitachi UV-3010(日本)紫外可見分光光度計(jì)和Hitachi F-4600(日本)熒光光譜儀測(cè)定。

1.2 二氧化硅納米粒子的合成

根據(jù)文獻(xiàn)合成二氧化硅納米粒子SNP1和SNP2[18]。將0.6 g F127溶解在9.0 mL HCl(0.85 mol·L-1)溶液中，室溫?cái)嚢? h，加入正硅酸乙酯(TEOS)(0.3 g，1.44 mmol)，攪拌40 min。再加入60 mg二乙氧基二甲基硅烷(DEDMS)，室溫?cái)嚢? h。反應(yīng)液在4000 r/min條件下離心15 min，除去大顆粒硅膠，再用截留分子量為8000～14400的透析袋透析3次，每次12 h。用0.22 μm的Teflon過濾器過濾，得到SNP1。SNP2的制備過程與SNP1 類似，只是DEDMS的加入量為120 mg。將上述得到的SNP1和SNP2溶液轉(zhuǎn)移到25 mL容量瓶中，用蒸餾水定容，再用PBS(pH 7.4，10 mmol·L-1)進(jìn)一步稀釋10倍后用于測(cè)試。

1.3 化合物PIP-CHO的合成

參照文獻(xiàn)[19]合成PIP-Br，具體步驟如下：將菲醌(1.0 g，4.80 mmol)溶解于30 mL冰乙酸中，依次加入4-溴苯甲醛(0.89 g，4.80 mmol)、醋酸銨(1.0 g，13.0 mmol)，100 ℃下反應(yīng)8 h。反應(yīng)液冷卻至室溫后，倒入冰水中，用 Na2CO3溶液調(diào)節(jié)pH為7～8，抽濾，濾餅用水(15 mL)洗3次。利用柱色譜純化粗產(chǎn)物，以CH2Cl2/甲醇(20∶1，V/V)為洗脫劑，得化合物PIP-Br(0.93 g，52.0%)。

將PIP-Br(0.40 g，1.07 mmol)、醋酸鈀(0.024 g，0.107 mmol)、三苯基磷(0.28 g，1.07 mmol)、4-甲?；脚鹚?0.32 g，2.14 mmol)，碳酸鈉(0.57 g，5.37 mmol)加到反應(yīng)瓶中，再加入1 mL水和10 mL DMF的混合液，在80 ℃下氮?dú)鈿夥諗嚢璺磻?yīng)20 h。冷卻至室溫，減壓蒸餾除去溶劑后，利用柱色譜純化粗產(chǎn)物，以CH2Cl2/甲醇(20:1，V/V)為洗脫劑，得黃色固體，為PIP-CHO(0.56 g，67.0%)。1H NMR(DMSO-d6，400 MHz)：13.57(s，1H)，10.09(s，1H)，8.90～8.85(m，2H)，8.64～8.58(m，2H)，8.48～8.46(m，2H)，8.07～8.04(m，6H)，7.80～7.74(m，2H)，7.68～7.64(m，2H)。

1.4 化合物PIP-S的合成

將PIP-CHO(0.20 g，0.50 mmol)溶于20 mL干燥的無水乙醇中，依次加入無水硫酸鈉(2.0 g，14.1 mmol)、對(duì)甲苯磺酸(0.60 g，3.48 mmol)、2-巰基乙醇(0.6 mL，8.56 mmol)，80 ℃下氮?dú)獗Ｗo(hù)攪拌反應(yīng)24 h。冷卻至室溫，減壓濃縮除去大部分溶劑后，倒入 CH2Cl2和 CH3OH的混合溶液中，攪拌條件下加入 Na2CO3溶液，調(diào)節(jié)pH為7～8。抽濾，得白色濾餅。以CH2Cl2/THF(4/1，V/V)為洗脫劑，通過柱色譜法純化粗產(chǎn)物，得化合物PIP-S(0.10 g，38.0%)。1H NMR(DMSO-d6，400 MHz)：13.53(s，1H)，8.90～8.85(m，2H)，8.64～8.58(m，2H)，8.43～8.42(m，2H)，7.96～7.95(m，2H)，7.82～7.72(m，4H)，7.72～7.64(m，2H)，7.59～7.57(m，2H)，5.35(s，1H)，4.86～4.85(m，2H)，3.58～3.55(m，4H)，2.74～2.70(m，2H)，2.63～2.59(m，2H)。13C NMR(DMSO-d6，150 MHz)：148.8，140.6，140.0，138.6，137.1，129.4，128.2，127.8，127.7，127.6，127.2，127.0，126.9，126.7，125.4，125.2，124.1，123.7，122.3，122.0，121.9。EMI-MS：537.1，calcd for C32H28N2O2S2，536.7。

1.5 光譜滴定及光物理性質(zhì)

在10 mL容量瓶中，將PIP-S的DMSO母液加入到二氧化硅納米粒子(SNP1和SNP2)的溶液中，室溫?cái)嚢?0 min，使PIP-S負(fù)載于硅膠納米粒子上。逐漸加入不同體積Hg2+溶液，混合均勻，避光攪拌10 min，進(jìn)行紫外-可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜測(cè)試?；衔飳?duì)Hg2+的檢測(cè)限(limit of detection，LOD)通過公式(1)計(jì)算：

(1)

式中,σ為空白溶液在最大發(fā)射波長處的12次熒光強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)偏差，s為最大發(fā)射波長處的熒光強(qiáng)度(F)與汞離子濃度進(jìn)行線性擬合后的斜率。

1.6 選擇性與競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)試

配制PIP-S化合物濃度為10 μmol·L-1的二氧化硅納米粒子溶液(SNP1或SNP2)，分別加入金屬離子(Li+、Na+、Ca2+、Mg2+、Al3+、Sn2+、Ni2+、Fe3+、Ag+、K+、Pb2+、Fe2+、Cd2+、Hg2+、Cr3+、Zn2+、Co2+、Cu2+)，混合均勻，靜置10 min。測(cè)定加入金屬離子前后的紫外-可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜，研究化合物對(duì)Hg2+的選擇性。

競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)為加入上述離子后，再加入20 μmol·L-1的Hg2+溶液，混合均勻，測(cè)試溶液的熒光發(fā)射光譜，判斷其它金屬離子與Hg2+的競(jìng)爭(zhēng)性。離子選擇性和競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)中，Hg2+濃度為20 μmol·L-1，Li+、Na+、K+、Mg2+、Ca2+等離子的濃度為1.0 mmol·L-1，其它金屬離子的濃度為40 μmol·L-1。

2 結(jié)果與討論

2.1 二氧化硅納米粒子的合成與表征

二氧化硅納米粒子具有水溶性好、毒性低、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定和可提高染料熒光效率等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于生物成像、電子學(xué)、傳感器等領(lǐng)域[20-23]。本文以嵌段共聚物F127為模板，正硅酸乙酯(TEOS)和二乙氧基二甲基硅烷(DEDMS)為前驅(qū)體，通過調(diào)節(jié)硅氧烷原料配比制備了分散性良好的二氧化硅納米粒子SNP1和SNP2，并利用透射電鏡研究了所得二氧化硅納米顆粒的形貌和微觀結(jié)構(gòu)(圖2)。SNP1和SNP2的尺寸分別為13.5 nm和25.9 nm，且分布范圍較窄。SNP2的粒徑比SNP1大，可能是由于在SNP2的制備過程中使用了更多的DEDMS。DEDMS可以和二氧化硅的表面的Si—O反應(yīng)，因此增加DEDMS的量，所得二氧化硅納米粒子的粒徑增大[24]。

圖2 二氧化硅納米粒子SNP1(a，b)和SNP2(c，d)的TEM圖

動(dòng)態(tài)光散射(DLS)數(shù)據(jù)表明，SNP1和SNP2的平均粒徑分別約為16.2 nm和33.8 nm(圖3)，分布系數(shù)(particle dispersion index，PDI)均小于0.3，說明得到的納米粒子具有良好的分散性。DLS測(cè)得的平均粒徑大于TEM測(cè)得的尺寸，是因?yàn)镈LS測(cè)得的是流體動(dòng)力學(xué)尺寸，而TEM測(cè)得的是干的粒子的粒徑[25]。SNP1和SNP2均帶負(fù)電荷，其中SNP1的Zeta電位為-5.74 mV，而SNP2的Zeta電位為-2.28 mV。SNP2的負(fù)表面電荷密度低于SNP1，可能是因?yàn)樵赟NP2的制備中使用了較多的DEDMS。DEDMS可以與Si—OH基團(tuán)結(jié)合，減少了表面Si-OH的數(shù)量[26]。二氧化硅納米粒子溶液在存放一個(gè)月后仍然分散性良好，表明這些二氧化硅納米粒子在水性介質(zhì)中具有良好的穩(wěn)定性[27]。

圖3 二氧化硅納米粒子SNP1(a)與SNP2(b)的動(dòng)態(tài)光散射圖

2.2 吸收光譜滴定和熒光光譜滴定

首先，采用紫外-可見吸收光譜研究了化合物PIP-S在DMF溶液中與Hg2+的相互作用，如圖4所示。在DMF溶液中，PIP-S在341、354和374 nm有吸收峰。隨著Hg2+的加入，341 nm和354 nm處的吸收峰強(qiáng)度逐漸下降，而374 nm處的吸收峰逐漸增強(qiáng)，且在360 nm處出現(xiàn)等吸收點(diǎn)。等吸收點(diǎn)的存在表明Hg2+與PIP-S發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)，有新物質(zhì)產(chǎn)生。

圖4 Hg2+對(duì)PIP-S(10 μmol·L-1)的DMF溶液的紫外-可見吸收光譜的影響(汞離子濃度為0～20 μmol·L-1)

熒光光譜滴定實(shí)驗(yàn)可進(jìn)一步探究Hg2+與PIP-S的相互作用。如圖5所示，化合物PIP-S在DMF溶液中的熒光較弱，隨著Hg2+的逐漸加入，在529 nm處的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)(圖5a)。當(dāng)Hg2+濃度達(dá)到8 μmol·L-1時(shí)，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值(圖5a插圖)。以529 nm處的熒光強(qiáng)度(F)對(duì)Hg2+濃度(0～4.0 μmol·L-1)作圖，得到線性關(guān)系良好的直線(R2= 0.9945)(圖5b)。根據(jù)公式(1)計(jì)算得PIP-S對(duì)Hg2+的檢測(cè)限為1.32 nmol·L-1。

圖5 (a) PIP-S在DMF中對(duì)Hg2+的熒光滴定光譜；(b) 529 nm處的熒光強(qiáng)度(F)對(duì)Hg2+濃度(0～4.0 μmol·L-1)響應(yīng)的線性關(guān)系圖(λem=410 nm)插圖：529 nm處的熒光強(qiáng)度(F)對(duì)Hg2+濃度(0～20.0 μmol·L-1)作圖

化合物PIP-S在SNP1水溶液中對(duì)Hg2+的熒光滴定光譜如圖6所示，在未加入Hg2+時(shí)，PIP-S在SNP1中的熒光很弱，隨著Hg2+的加入，480 nm處的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)(圖6a)。Hg2+濃度為10 μmol·L-1時(shí)，480 nm處的熒光強(qiáng)度達(dá)到最大(圖6a插圖)。以480 nm處的熒光強(qiáng)度(F)對(duì)Hg2+濃度(0～3.0 μmol·L-1)作圖(圖6b)，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(R2=0.9996)。根據(jù)公式(1)計(jì)算得到PIP-S在SNP1水溶液中對(duì)Hg2+的檢測(cè)限為8.37 nmol·L-1。在SPN-2水溶液中進(jìn)行熒光滴定，經(jīng)計(jì)算得PIP-S在SNP2水溶液中對(duì)Hg2+的檢測(cè)限為14.75 nmol·L-1。不同二氧化硅納米粒子溶液中，PIP-S對(duì)汞離子的熒光響應(yīng)和檢測(cè)限有差異，可能是由于SNP1和SNP2中的微環(huán)境不同引起的[28]。汞離子可與PIP-S中的硫原子配位，在水溶液中可以促進(jìn)PIP-S中的硫縮醛基團(tuán)水解，并轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的醛PIP-CHO[10,11](圖7)。PIP-CHO具有較強(qiáng)的ICT效應(yīng)，在極性溶劑如DMF中熒光峰位于529 nm，而在極性較低的二氧化硅納米粒子中，熒光峰藍(lán)移至480 nm。上述結(jié)果表明，采用二氧化硅納米粒子作為載體能夠在水中對(duì)汞離子進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)限能達(dá)到nmol·L-1級(jí)別，與國家飲用水汞離子濃度標(biāo)準(zhǔn)(5 nmol·L-1，1 μg·L-1)接近。

圖6 (a) PIP-S在SNP1水溶液中對(duì)Hg2+的熒光滴定光譜；(b) 480 nm處的熒光強(qiáng)度(F)對(duì)Hg2+(0～3.0 μmol·L-1)的線性關(guān)系圖(λex=410 nm)插圖：480 nm處的熒光強(qiáng)度(F)對(duì)Hg2+濃度(0～20.0 μmol·L-1)作圖

圖7 汞離子催化硫縮醛PIP-S的水解機(jī)理

2.3 PIP-S對(duì)汞離子的選擇性

為研究化合物PIP-S在SNP1中對(duì)Hg2+的選擇性，加入不同金屬離子(Li+、Cu2+、Ca2+、Mg2+、Al3+、Sn2+、Ni2+、Fe3+、Ag+、K+、Pb2+、Fe2+、Cd2+、Hg2+、Cr3+、Zn2+、Co2+、Na+)后進(jìn)行紫外-可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜測(cè)試(圖8a和8b)。加入Hg2+后，PIP-S的吸收光譜和發(fā)射光譜均發(fā)生了很大的變化；而加入其它金屬離子后，PIP-S的吸收光譜和熒光光譜都變化不大。此外，我們還研究了Hg2+與其他離子共存時(shí)PIP-S的熒光響應(yīng)圖。其它金屬離子存在時(shí)，PIP-S在480 nm處的熒光較弱，再加入Hg2+后，熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)(圖8c)。以上結(jié)果表明，化合物PIP-S(10 μmol·L-1)在SNP1中對(duì)Hg2+具有很好的選擇性，且不受其它金屬離子干擾?；衔颬IP-S在SNP2中也對(duì)Hg2+具有很好的選擇性且不受其它金屬離子的干擾。

圖8 在SNP1溶液中，化合物PIP-S在不同金屬離子存在時(shí)的(a)紫外-可見吸收光譜和(b)熒光發(fā)射光譜(λex=410 nm)；(c) 化合物PIP-S在SNP1中Hg2+與其他離子共存時(shí)在480 nm處的熒光強(qiáng)度，黑色柱狀圖為PIP-S與其他金屬離子作用的圖形，紅色柱狀圖為PIP-S與Hg2+作用的圖形

2.4 時(shí)間響應(yīng)性

我們分別研究了化合物PIP-S在SNP1和SNP2溶液中的響應(yīng)時(shí)間。如圖9所示，在PIP-S的SNP1和SNP2溶液中加入20 μmol·L-1的Hg2+后，熒光強(qiáng)度都迅速增強(qiáng)，在10 min內(nèi)熒光強(qiáng)度達(dá)到飽和，表明化合物PIP-S對(duì)Hg2+的響應(yīng)時(shí)間很短，可實(shí)現(xiàn)對(duì)Hg2+的快速檢測(cè)。

圖9 化合物PIP-S(10 μmol·L-1)的SNP1和SNP2溶液中加入Hg2+(20 μmol·L-1)的時(shí)間響應(yīng)曲線

3 結(jié)論

本文制備了兩種二氧化硅納米粒子SNP1和SNP2，合成了硫縮醛修飾的菲并咪唑衍生物PIP-S，并對(duì)其進(jìn)行了表征。研究了SNP1和SNP負(fù)載的PIP-S對(duì)Hg2+的響應(yīng)性。PIP-S對(duì)Hg2+具有很高的靈敏度，檢測(cè)限為nmol·L-1級(jí)，與國家飲用水標(biāo)準(zhǔn)相當(dāng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明二氧化硅納米粒子負(fù)載的熒光探針PIP-S可以選擇性快速檢測(cè)水中的Hg2+。