分離技術(shù)對(duì)直鏈麥芽低聚糖組分含量的影響

李家宬陳殿寧顧正彪,2李才明,2李兆豐,2

(1. 江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2. 江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122)

直鏈麥芽低聚糖是指由3～10個(gè)葡萄糖單元以α-1,4-糖苷鍵連接而成的寡糖聚合體，具有甜度較低、保濕能力強(qiáng)、吸濕性小等特點(diǎn)，在改善食品質(zhì)地、風(fēng)味及延長(zhǎng)面包、速凍食品保質(zhì)期方面具有良好的應(yīng)用效果[1-2]；此外，直鏈麥芽低聚糖還具有良好的生理功能，可在不引起血糖急劇升高的情況下，緩慢持續(xù)地為人體供能，是最具潛力的新型低聚糖之一[1]。其中，聚合度3～6的直鏈麥芽低聚糖(G3～G6)具有適中的黏度，可作為磷酸寡糖合成的前體，促使人體對(duì)Ca2+的吸收[3]，還可以抑制腸道腐敗菌生長(zhǎng)，促進(jìn)益生菌增殖，維護(hù)腸道健康[4-5]，因此，具有更好的應(yīng)用前景。

直鏈麥芽低聚糖的工業(yè)化生產(chǎn)主要采用酶法工藝，即通過(guò)麥芽糖生成酶(EC 3.2.1.1)作用淀粉而成[6]。其酶解產(chǎn)物中不僅含有G3～G6，還含有單、雙糖和六糖以上的組分，產(chǎn)物中G3～G6所占比例不高，限制了其工業(yè)化應(yīng)用。目前鮮有直鏈麥芽低聚糖分離純化的報(bào)道，但市場(chǎng)上存在兩種產(chǎn)品形式：① 以“mg”為訂購(gòu)單位的高純度純品，用于儀器分析，價(jià)格昂貴；② 純度較低的直鏈麥芽低聚糖糖漿，并未實(shí)現(xiàn)高純度樣品的大批量、連續(xù)化生產(chǎn)，因而限制了其研究與應(yīng)用。

課題組[7]前期已成功構(gòu)建來(lái)源于BacillusstearothermophilusSTB04的直鏈麥芽低聚糖生成酶(Bst-MFA酶，GenBank: AIV43245.1)的BacillussubtilisWB600表達(dá)系統(tǒng)，并研究了該酶制備直鏈麥芽低聚糖的情況。結(jié)果顯示，該酶生產(chǎn)的直鏈麥芽低聚糖主要為G5和G6，G3～G6所占比例也相對(duì)較高。試驗(yàn)擬以該酶酶解產(chǎn)物為原料，探究膜分離、活性炭吸附分離、葡聚糖凝膠柱層析分離和離子交換樹(shù)脂柱層析分離等技術(shù)對(duì)直鏈麥芽低聚糖組分的影響，以G3～G6、G5+G6比例和回收率為指標(biāo)，綜合評(píng)判各技術(shù)對(duì)直鏈麥芽低聚糖各組分的分離能力，并分析了相關(guān)機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

玉米淀粉：山東大宗生物開(kāi)發(fā)股份有限公司；

普魯蘭酶：2 000 U/mL，日本天野公司；

G3～G7標(biāo)準(zhǔn)品：上?；菡\(chéng)生物科技有限公司；

葡聚糖凝膠G-25：西寶生物科技(上海)股份有限公司；

鈉型、鈣型離子交換樹(shù)脂：天津南開(kāi)大學(xué)樹(shù)脂有限公司；

鉀型K310離子交換樹(shù)脂：陶氏化學(xué)(羅門哈斯)中國(guó)有限公司；

其他試劑：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

高效陰離子交換色譜儀(HPAEC-PAD)：CS-5000 plus型，美國(guó)Thermo Scientific有限公司；

管式陶瓷膜超濾設(shè)備：CeraMen-0100型，廈門福美科技有限公司；

阿貝折射儀：WAY-2S型，上海始恒儀器設(shè)備有限公司；

電導(dǎo)率儀：STARTER3100C型，奧豪斯國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司；

順序式模擬移動(dòng)床：小試設(shè)備-1型，上海兆光色譜分離技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 玉米淀粉的酶解 配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為45%的玉米淀粉乳，調(diào)節(jié)pH至5.0，60 ℃保溫15 min，按底物干基加入Bst-MFA酶20 U/g，以2.0 ℃/min的速率升溫至90 ℃，保溫30 min，以10 ℃/min的速率將溫度降為65 ℃，穩(wěn)定后加入普魯蘭酶20 U/g，反應(yīng)24 h。

1.2.2 直鏈麥芽低聚糖的組分分析 取1 mL樣品，沸水浴30 min滅酶[8]、定容、離心(10 000 r/min，10 min)，上清液過(guò)0.22 μm水系濾膜，稀釋一定倍數(shù)后用HPAEC-PAD分析產(chǎn)物組成[9]。

HPAEC-PAD分析參照文獻(xiàn)[7]的方法。分別按式(1)、(2)計(jì)算G1～G7(G1、G2分別表示葡萄糖、麥芽糖，其他組分由于缺乏相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品，未做定量分析)的產(chǎn)率和G1～G7中各糖組分的比例。

(1)

(2)

式中：

Y——目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率，%；

c1——稀釋后樣品中目標(biāo)產(chǎn)物的濃度，mg/mL；

m1——取樣質(zhì)量，mg；

ω——目標(biāo)產(chǎn)物的比例，%；

c——樣品中G1～G7的濃度，mg/mL。

1.2.3 直鏈麥芽低聚糖濃度的測(cè)定 采用阿貝折射儀[10]。

1.2.4 酶解產(chǎn)物的預(yù)處理 酶解產(chǎn)物經(jīng)滅酶、離心后保留上清液，在最佳溫度和活性炭負(fù)載量下，進(jìn)行活性炭脫色處理[11]。此外，為避免待分離樣品中的金屬離子置換出離子交換樹(shù)脂上的功能離子，脫色樣品需依次泵入陰、陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱以去除雜離子[12]，水洗流速230 mL/min，上樣流速140 mL/min，待有糖液流出時(shí)開(kāi)始收集。經(jīng)此處理的樣品，電導(dǎo)率在10 μS/cm以下時(shí)可用于后續(xù)分離[13]。

1.2.5 直鏈麥芽低聚糖的分離純化

(1) 膜分離：依次用陶瓷膜、有機(jī)膜[14]對(duì)酶解液中的直鏈麥芽低聚糖進(jìn)行分離純化，每進(jìn)行一次膜分離均收集透過(guò)液和截留液，并用HPAEC-PAD分析直鏈麥芽低聚糖的組成變化。以分離前后樣品中目標(biāo)產(chǎn)物的增量和回收率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，并按式(3)、(4)進(jìn)行計(jì)算。

(3)

(4)

式中：

Δ——目標(biāo)組分比例的增量，%；

ω1——初始酶解液中目標(biāo)組分的比例，%；

ω2——分離后樣品中目標(biāo)組分的比例，%；

γ——目標(biāo)組分的回收率，%；

σ1——初始酶解液的糖度，%；

σ2——分離后樣品的糖度，%。

(2) 活性炭吸附分離：參照文獻(xiàn)[15]并做適當(dāng)修改。層析柱尺寸為Φ1 cm×90 cm，上樣量為1 mL。用超純水洗脫G1，再分別用體積分?jǐn)?shù)為5%，7%，10%的乙醇溶液洗脫G2、G3和G4，最后用15%的乙醇溶液洗脫其他糖，洗脫流速1.0 mL/min，自動(dòng)部分收集器每管收集4 mL洗脫液，采用阿貝折射儀測(cè)定洗脫液中的糖濃度，并用HPAEC-PAD分析洗脫液中直鏈麥芽低聚糖的組成變化。

(3) 葡聚糖凝膠柱層析分離：參照文獻(xiàn)[16]并做適當(dāng)修改。操作溫度為60 ℃，洗脫劑為超純水，洗脫流速為1.0 mL/min，自動(dòng)部分收集器每管收集4 mL洗脫液，分析洗脫液中直鏈麥芽低聚糖的組成變化。

(4) 離子交換樹(shù)脂柱層析分離：參照文獻(xiàn)[17]并做適當(dāng)修改。操作溫度為60 ℃，洗脫劑為超純水，用恒流泵控制流速，自動(dòng)部分收集器每管收集4 mL洗脫液，分析洗脫液中直鏈麥芽低聚糖的組成變化。將鈉型樹(shù)脂轉(zhuǎn)化為鈣型的方法為：鈉型樹(shù)脂溶脹后先用1 mol/L的鹽酸溶液浸泡24 h，用去離子水洗至中性，再用1 mol/L的CaCl2溶液將其轉(zhuǎn)化為鈣型，最后用去離子水洗至無(wú)Ca2+流出。鉀型樹(shù)脂用去離子水浸泡溶脹24 h即可使用。

(5) 模擬移動(dòng)床分離：將樣品糖濃度濃縮至50%，順序式模擬移動(dòng)床操作條件為填料總體積8 L，12根尺寸為Φ3.9 cm×65 cm的分離柱，操作溫度60 ℃，洗脫劑為去離子水，進(jìn)樣流速19.5 mL/min，進(jìn)水及循環(huán)流速39 mL/min，通過(guò)調(diào)整模擬移動(dòng)床的閥切換時(shí)間控制目標(biāo)產(chǎn)物的組成。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)結(jié)果為3次獨(dú)立試驗(yàn)的平均值，用平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶解產(chǎn)物分析

按照1.2.1所示方法制備直鏈麥芽低聚糖，并對(duì)產(chǎn)物組分進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，復(fù)合使用Bst-MFA酶和普魯蘭酶作用于質(zhì)量濃度45%的玉米淀粉乳24 h后，所得產(chǎn)物中含有大量的麥芽低聚糖，其中G1～G7的產(chǎn)率為85.89%。G5+G6的總質(zhì)量占G1～G7總質(zhì)量的55.46%，G3～G6占G1～G7的比例達(dá)到77.08%，產(chǎn)物中G3～G6、G5+G6的比例還有待進(jìn)一步提高。

2.2 膜分離效果分析

以5 nm陶瓷膜和1 000 Da的有機(jī)膜組合對(duì)酶解液中的直鏈麥芽低聚糖進(jìn)行分離純化。酶解液經(jīng)5 nm陶瓷膜過(guò)濾處理，以除去大分子顆粒；將透過(guò)液用1 000 Da的有機(jī)膜進(jìn)行二次分離，以除去G1～G4等小分子糖。

膜分離對(duì)G5+G6和G3～G6的分離效果見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，相比于初始酶解液，透過(guò)液中G5+G6和G3～G6的比例分別提高了14.07%和8.04%，表明膜分離可以在一定程度上分離直鏈麥芽低聚糖。但G5+G6和G3～G6的回收率低于60%，大量目標(biāo)產(chǎn)物損失于膜分離的過(guò)程中，且G5+G6和G3～G6所占比例還未達(dá)到較高水平。這可能是因?yàn)槟し蛛x技術(shù)主要通過(guò)分子量大小和顆粒形狀對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分離，而不同的直鏈麥芽低聚糖分子量差異較小，且為鏈狀結(jié)構(gòu)，相比于球狀分子更難利用膜分離的方式進(jìn)行分離。

2.3 活性炭吸附分離效果分析

活性炭具有較大的表面積，其內(nèi)、外表面和孔隙均可吸附直鏈麥芽低聚糖分子，當(dāng)用去離子水洗脫時(shí)，G1首先脫吸附，依次增加洗脫劑中乙醇的濃度，G2～G7可相繼被洗脫[15]。試驗(yàn)結(jié)果顯示，相比于初始酶解液，分離產(chǎn)物中G5+G6和G3～G6的比例分別提高了23.52%和0.91%(表1)。然而，G5+G6和G3～G6的回收率均低于50%，可能是因?yàn)榛钚蕴繉?duì)G1～G7的吸附能力過(guò)強(qiáng)，使得洗脫劑不能將被吸附的糖完全洗脫回收。

2.4 葡聚糖凝膠柱層析分離效果分析

葡聚糖凝膠可通過(guò)分子篩原理對(duì)直鏈麥芽低聚糖進(jìn)行分離純化，其對(duì)G5+G6和G3～G6的分離效果見(jiàn)表1。相比于初始酶解液，分離產(chǎn)物中G5+G6和G3～G6所占比例分別達(dá)到84.43%和86.09%，分離效果優(yōu)于膜分離和活性炭吸附分離。

表1 直鏈麥芽低聚糖不同分離純化方法對(duì)比?

葡聚糖凝膠可比較高效地分離不同組分的直鏈麥芽低聚糖，可能是由于當(dāng)直鏈麥芽低聚糖流經(jīng)葡聚糖凝膠層析柱時(shí)，分子量較大、鏈長(zhǎng)較長(zhǎng)的G5～G7只能在凝膠顆粒的網(wǎng)孔外移動(dòng)，流速較快因而先從凝膠層析柱中流出；分子量較小的組分(如G1和G2)可以進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，流速較慢而后從層析柱中流出。流速差異使得不同組分流經(jīng)色譜柱的時(shí)間不同，從而實(shí)現(xiàn)G1～G7中不同組分的高效分離。但葡聚糖凝膠成本較高，黏度和密度均較大的糖漿在分離過(guò)程中易產(chǎn)生較高的柱壓，使部分凝膠的糖苷鍵水解或交聯(lián)結(jié)構(gòu)受損[18]，分離效果下降。

2.5 離子交換樹(shù)脂柱層析分離效果分析

2.5.1 鈉型離子交換樹(shù)脂柱層析分離 鈉型離子交換樹(shù)脂的可交換離子為Na+，其對(duì)G5+G6和G3～G6的分離效果見(jiàn)表1，相比于初始酶解液，分離產(chǎn)物中G5+G6和G3～G6的比例分別提高了2.76%和2.10%，但回收率均低于20%，可見(jiàn)鈉型離子交換樹(shù)脂柱對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的分離效果不明顯。

2.5.2 鈣型離子交換樹(shù)脂柱層析分離 參照1.2.5(4)方法將鈉型離子交換樹(shù)脂轉(zhuǎn)為鈣型，其對(duì)G5+G6和G3～G6的分離效果見(jiàn)表1，相比初始酶解液，分離產(chǎn)物中G5+G6和G3～G6的比例分別提高了36.07%和10.85%，回收率分別為63.52%和51.48%，可見(jiàn)，鈣型離子交換樹(shù)脂柱對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的分離效果優(yōu)于鈉型。這可能是因?yàn)殡m然二者分離直鏈麥芽低聚糖主要基于Na+和Ca2+與糖分子所帶羥基間的配位絡(luò)合交換原理，但Ca2+與糖分子所帶羥基的絡(luò)合作用強(qiáng)于Na+。

2.5.3 鉀型離子交換樹(shù)脂柱層析分離 鉀型K310樹(shù)脂層析柱是以分子體積排阻作用為主導(dǎo)對(duì)直鏈麥芽低聚糖進(jìn)行分離純化，其分離效果見(jiàn)表1。當(dāng)上樣體積為1 mL，洗脫劑流速為1.0 mL/min時(shí)，與初始酶解液相比，分離產(chǎn)物中G5+G6和G3～G6的比例分別升高至77.38%和83.35%，回收率分別高達(dá)78.11%和63.89%，分離效果優(yōu)于鈉型和鈣型樹(shù)脂。這可能是因?yàn)殁c型和鈣型兩種樹(shù)脂孔隙較大，粒徑分布不均且交聯(lián)度較低，G1～G7均可通過(guò)孔隙，分子體積排阻效應(yīng)未得到很好的體現(xiàn)。而鉀型K310樹(shù)脂的孔徑介于G4和G5之間，G1～G7通過(guò)樹(shù)脂時(shí)被分成兩部分，G1～G4隨洗脫劑在樹(shù)脂孔徑內(nèi)移動(dòng)，而G5～G7通過(guò)層析柱時(shí)只能隨洗脫劑在孔徑外(樹(shù)脂顆粒間)移動(dòng)，流出色譜柱的時(shí)間差異使得G1～G4和G5～G7得以分離。鉀型樹(shù)脂柱的分離原理類似于葡聚糖凝膠柱，可見(jiàn)分離直鏈麥芽低聚糖時(shí)應(yīng)使分子體積排阻發(fā)揮主導(dǎo)作用。

2.6 順序式模擬移動(dòng)床分離

對(duì)比上述幾種直鏈麥芽低聚糖的分離方法，選用鉀型K310樹(shù)脂為吸附劑填料對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化。參照1.2.5(5)方法設(shè)置模擬移動(dòng)床條件，周期時(shí)長(zhǎng)是指連續(xù)分離過(guò)程中一個(gè)分離周期(從進(jìn)樣到下一次進(jìn)樣)的時(shí)間。測(cè)定不同周期時(shí)長(zhǎng)下所收集樣品中的目標(biāo)產(chǎn)物含量，發(fā)現(xiàn)隨著周期時(shí)長(zhǎng)的縮短，提余液中G3～G6的比例和回收率均逐漸降低，G5+G6的比例和回收率先升高后降低。當(dāng)周期時(shí)長(zhǎng)為1 378 s時(shí)，G5+G6的比例和回收率均達(dá)到最高，分別為84.74%和84.23%(表2)，此時(shí)直鏈麥芽低聚糖分離前后的HPAEC-PAD色譜圖如圖1所示，分離效果較好。

表2 模擬移動(dòng)床分離純化直鏈麥芽低聚糖?

從模擬移動(dòng)床的分離過(guò)程來(lái)解釋，待分離原料F從串聯(lián)色譜柱的中部加入色譜柱系統(tǒng)，分離過(guò)程中洗脫劑D從左端進(jìn)入并自左向右流動(dòng)，色譜柱向左移動(dòng)。提取液A中各組分(G1～G4)在色譜柱中的移動(dòng)速度較慢，從串聯(lián)色譜柱左端收集，而提余液B中各組分(G5～G7)移動(dòng)速度較快，從色譜柱右端收集。要實(shí)現(xiàn)兩組分分離，色譜柱系統(tǒng)閥切換速度需介于A和B在色譜柱中的移動(dòng)速度之間。隨著閥切換時(shí)間的縮短，色譜柱向左移動(dòng)的速度越來(lái)越快，直鏈麥芽低聚糖分子更多地隨色譜柱向左移動(dòng)，提余液自B處流出要經(jīng)歷的色譜柱長(zhǎng)度增加，使得G5～G7與G1～G4分離得更為徹底，而G1～G4在提取液A處被收集的作用也更加明顯，這時(shí)，在B處收集的提余液中G5+G6的比例和回收率升高而G3～G6的比例和回收率略有下降；然而，若閥切換時(shí)間進(jìn)一步縮短，G5～G7隨色譜柱向左移動(dòng)的速度越來(lái)越快也會(huì)在A處被部分收集，導(dǎo)致提余液B中G5+G6的比例和回收率有所降低，G3～G6的比例和回收率進(jìn)一步降低。當(dāng)模擬移動(dòng)床的分離周期為1 378 s時(shí)，提余液中G3～G6比例和回收率均較高，且G5+G6達(dá)到最高的比例和回收率，通過(guò)噴霧干燥可制備含高比例G5+G6的直鏈麥芽低聚糖固體粉末。

G1. 葡萄糖 G2. 麥芽糖 G3. 直鏈麥芽三糖 G4. 直鏈麥芽四糖 G5. 直鏈麥芽五糖 G6. 直鏈麥芽六糖 G7. 直鏈麥芽七糖

3 結(jié)論

采用多種手段對(duì)直鏈麥芽低聚糖生成酶的酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離純化。結(jié)果顯示，基于選擇透過(guò)性原理的膜分離技術(shù)對(duì)不同分子量的直鏈麥芽低聚糖分離效果不佳，目標(biāo)產(chǎn)物的比例及回收率均較低；活性炭對(duì)低聚糖的吸附能力過(guò)強(qiáng)，導(dǎo)致目標(biāo)產(chǎn)物回收率低且耗時(shí)耗能；基于分子篩原理的葡聚糖凝膠柱層析分離效果較好，但其在分離過(guò)程中易產(chǎn)生過(guò)高的柱壓，不利于連續(xù)化批量操作；不同離子類型的離子交換樹(shù)脂對(duì)直鏈麥芽低聚糖的分離效果不同，其中，基于配位絡(luò)合交換原理的鈉型與鈣型樹(shù)脂對(duì)G5+G6的純化效果并不理想，而主要依靠分子體積排阻效應(yīng)的鉀型K310樹(shù)脂對(duì)G3～G6和G5+G6的分離效果較好。在此基礎(chǔ)上，以鉀型K310離子交換樹(shù)脂為固定相吸附劑，采用模擬移動(dòng)床對(duì)直鏈麥芽低聚糖進(jìn)行連續(xù)分離純化，通過(guò)優(yōu)化模擬移動(dòng)床的分離周期，可將G3～G6和G5+G6所占比例進(jìn)一步提高。