組蛋白去乙酰化酶9對(duì)腎小球發(fā)育的調(diào)控

李 知 侯 慶 汪 玲 朱小東 翟修文 秦衛(wèi)松 曾彩虹 陳朝紅 劉志紅

腎小球是腎臟的功能單位，腎小球?yàn)V過屏障是腎臟血液濾過裝置，發(fā)育缺陷引起腎功能異常[1]。腎小球?yàn)V過屏障由腎小球血管內(nèi)皮細(xì)胞、腎小球臟層上皮細(xì)胞即足細(xì)胞和基底膜構(gòu)成[2]，其中，足細(xì)胞間的裂孔隔膜是腎小球?yàn)V過屏障的獨(dú)特結(jié)構(gòu)，裂孔隔膜發(fā)育障礙會(huì)導(dǎo)致蛋白尿的產(chǎn)生[3]。

哺乳動(dòng)物的腎臟發(fā)育經(jīng)歷前腎、中腎和后腎三個(gè)階段，前腎和中腎是哺乳動(dòng)物胚胎時(shí)期的暫時(shí)器官，后腎是體內(nèi)永久性器官[4]。斑馬魚腎臟發(fā)育經(jīng)歷前腎和中腎兩個(gè)階段，其在結(jié)構(gòu)、功能和分子組成上均與哺乳動(dòng)物腎臟相似和高度保守[5]。斑馬魚前腎在受精后(hours post-fertilization,hpf)80h即發(fā)育成熟，具有正常的腎小球?yàn)V過功能[6]；斑馬魚腎小球?yàn)V過膜與哺乳動(dòng)物相同，由足細(xì)胞、腎小球血管內(nèi)皮細(xì)胞和基底膜構(gòu)成[7]。

在斑馬魚前腎發(fā)育過程中，腎臟祖細(xì)胞原腸期和體節(jié)發(fā)生期可通過不同轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)來區(qū)分，如pax2a，lhx1a和wt1a；在15體節(jié)期，足細(xì)胞的祖細(xì)胞被wt1b特異性標(biāo)記，同時(shí)還表達(dá)pax2a和lhx1a；到24hpf，足細(xì)胞開始表達(dá)裂孔隔膜分子podocin和nephrin；在48～50 hpf，隨著足細(xì)胞的發(fā)育和血管生成，腎小球開始形成，直至84hpf腎小球發(fā)育成熟[8-10]。因此，斑馬魚是研究腎臟發(fā)育的理想模型，被廣泛應(yīng)用[11-12]。

本研究前期發(fā)現(xiàn)組蛋白去乙?；?(histone deacetylase 9，hdac9)在發(fā)育的腎小球中高豐度表達(dá)，隨著腎小球發(fā)育完成其表達(dá)消失。本文擬通過基因編輯技術(shù)敲除hdac9基因，探究hdac9基因缺失對(duì)腎臟發(fā)育的影響。

材料與方法

斑馬魚飼養(yǎng)和繁殖野生型斑馬魚(AB品系)購買于國(guó)家斑馬魚資源中心。斑馬魚成魚飼養(yǎng)于28.5℃恒溫水中，照明14h/黑暗10h交替。斑馬魚胚胎飼養(yǎng)于28.5℃恒溫培養(yǎng)箱中，每日更換養(yǎng)魚水。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置符合東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

主要試劑T7 High Yield RNA Transcription Kit(諾唯贊)，重組核酸酶Cas9蛋白(近岸)，2×SuperMix Taq(全式金)，pEASY-T5-Zero Cloning kit (全式金)，DNA Clean & Concentration (ZYMO Research)，RNA Clean & Concentration (ZYMO Research)，mMESSAGE mMACHINE T7 kit(Invitrogen)，MEGAclear Kit(Invitrogen)，Dig RNA Labeling Mix(Roche)，NBT/BCIP stock solution(Roche)。

斑馬魚突變體構(gòu)建針對(duì)斑馬魚hdac9(Transcript ID:ENSDART00000079159)設(shè)計(jì)single-guide RNA (sgRNA)靶點(diǎn)(http://www.rgenome.net/cas-designer/)，反應(yīng)體系：oligo F (10 μm) 5 μl，oligo R (10 μm)5 μl,2×SuperMix 10 μl；反應(yīng)條件：94℃ 5 mins,50℃ 10 mins,72℃ 10 mins。DNA純化回收PCR產(chǎn)物后，利用T7 High Yield RNA Transcription Kit 轉(zhuǎn)錄，純化回收sgRNA。50 ng/μl sgRNA 和300 ng/μl重組Cas9蛋白37℃孵育10 mins，用于斑馬魚胚胎(AB品系)單細(xì)胞顯微注射。所用引物見表1。

全胚胎原位雜交(WISH)斑馬魚hdac9,nphs1,nphs2,lhx1a,pax2a,mafba和wt1b探針模板通過PCR擴(kuò)增后，克隆入pEASY-T5-Zero cloning 載體，地高辛標(biāo)記的反義鏈RNA探針通過T7 High Yield RNA Transcription Ki t轉(zhuǎn)錄，60℃堿水解回收后使用。斑馬魚胚胎固定于4%多聚甲醛4℃過夜，標(biāo)準(zhǔn)操作如前所描述[13]。所用引物見表1。

表1 引物列表

信使RNA(messengerRNA，mRNA)合成斑馬魚hdac9全長(zhǎng)編碼序列通過PCR擴(kuò)增克隆入pEASY-T5-Zero cloning 載體，正義鏈通過mMESSAGE mMACHINE T7 kit 體外轉(zhuǎn)錄成mRNA，MEGAclear Kit回收轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。75 ng/μl hdac9 mRNA 用于斑馬魚胚胎單細(xì)胞顯微注射。

電鏡斑馬魚胚胎固定于3.75%戊二醛，4℃過夜，乙醇、丙酮脫水，丙酮、樹脂置換和浸透，包埋，烤制，切片，透射電子顯微鏡下觀察拍照。

結(jié) 果

斑馬魚腎臟發(fā)育階段hdac9的表達(dá)情況為了檢測(cè)斑馬魚hdac9在腎臟發(fā)育階段的表達(dá)分布情況，通過WISH檢測(cè)發(fā)現(xiàn)hdac9在24hpf即開始在神經(jīng)系統(tǒng)和發(fā)育中的前腎小球表達(dá)，持續(xù)表達(dá)至72 hpf (圖1)。

圖1 WISH檢測(cè)hdac9在腎臟發(fā)育階段的表達(dá)分布紅色箭頭為前腎小球；hdac9:組蛋白去乙?；?；hpf:受精后小時(shí)

CRISPR/Cas9構(gòu)建hdac9基因敲除斑馬魚為了探究hdac9基因在腎小球發(fā)育的作用，我們構(gòu)建了hdac9基因敲除斑馬魚，針對(duì)斑馬魚hdac9基因第一號(hào)外顯子區(qū)域設(shè)計(jì)了sgRNA，將sgRNA/Cas9蛋白復(fù)合體顯微注射到AB品系野生胚胎的單細(xì)胞中，注射24h后，通過PCR驗(yàn)證敲除效率后，逐代篩選；通過PCR基因分型檢測(cè)并測(cè)序確認(rèn)hdac9純合突變斑馬魚存在7個(gè)堿基缺失(圖2A)；并通過WISH驗(yàn)證hdac9純合突變的胚胎中hdac9的表達(dá)，如圖2B所示，野生型幼魚中可檢測(cè)到hdac9在腎小球的表達(dá)，而hdac9基因敲除幼魚中未見hdac9表達(dá)，表明hdac9基因敲除斑馬魚構(gòu)建成功。

圖2 hdac9基因敲除斑馬魚構(gòu)建hdac9:組蛋白去乙?；?；A：針對(duì)斑馬魚hdac9設(shè)計(jì)靶點(diǎn)(黑色下劃線)，紅色虛線為缺失堿基片段；B：WISH證實(shí)hdac9基因敲除魚構(gòu)建成功， 紅色剪頭所指為野生型幼魚hdac9原位雜交信號(hào)

hdac9基因敲除導(dǎo)致前腎小球發(fā)育障礙通過亞甲藍(lán)染色和透射電子顯微鏡成像觀察hdac9敲除對(duì)腎小球超微結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果顯示hdac9缺失嚴(yán)重影響腎小球發(fā)育：與野生組相比，亞甲藍(lán)染色顯示hdac9敲除后腎小球區(qū)域僅有少許的細(xì)胞團(tuán)，可見包曼氏囊輪廓，未見明顯腎小球結(jié)構(gòu)(圖3A)；超微結(jié)構(gòu)顯示hdac9敲除斑馬魚腎小球?yàn)V過屏障發(fā)育障礙，足細(xì)胞數(shù)量顯著減少，足細(xì)胞間裂孔隔膜消失(圖3B)；WISH檢測(cè)了足細(xì)胞裂孔隔膜的標(biāo)志物podocin和nephrin的表達(dá)，與野生組相比，hdac9敲除導(dǎo)致podocin和nephrin的表達(dá)被明顯抑制(圖3C)。為了進(jìn)一步證實(shí)hdac9敲除引起腎小球發(fā)育障礙和足細(xì)胞數(shù)量減少的表型特異性，我們?cè)趆dac9突變胚胎中回輸了hdac9 mRNA；回輸hdac9b mRNA后，腎小球?yàn)V過屏障、足細(xì)胞數(shù)量、podocin和nephrin的表達(dá)均被成功逆轉(zhuǎn)。結(jié)果顯示，hdac9缺失導(dǎo)致腎小球發(fā)育障礙。

圖3 hdac9缺失對(duì)腎小球發(fā)育的影響A：腎小球亞甲藍(lán)染色，黑色圓框虛線內(nèi)為腎小球；B：腎小球超微結(jié)構(gòu)，白色箭頭所指為腎小球?yàn)V過屏障；C：足細(xì)胞標(biāo)志物podocin和nephrin WISH結(jié)果(紅色箭頭所指為原位雜交信號(hào))，120hpf：受精后120小時(shí)；dac9:組蛋白去乙?；?

hdac9敲除對(duì)腎臟祖細(xì)胞表達(dá)的影響圖1證實(shí) hdac9在腎臟發(fā)育早期即開始表達(dá)，而hdac9基因敲除影響腎小球的正常發(fā)育和形成。因此，我們推測(cè)hdac9敲除在腎臟發(fā)育早期可能影響腎臟祖細(xì)胞的表達(dá)。通過WISH檢測(cè)斑馬魚腎臟祖細(xì)胞標(biāo)志物lhx1a,pax2a,mafba和wt1b的表達(dá)情況，我們發(fā)現(xiàn)hdac9敲除顯著抑制了腎臟祖細(xì)胞的表達(dá)，尤其是足細(xì)胞祖細(xì)胞標(biāo)志物mafba和wt1b表達(dá)；而當(dāng)回輸hdac9 mRNA之后，可顯著逆轉(zhuǎn)足細(xì)胞祖細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，包括mafba和wt1b。結(jié)果顯示，hdac9是腎臟祖細(xì)胞向足細(xì)胞分化所必需的。

圖4 hdac9缺失對(duì)腎臟祖細(xì)胞的影響hdac9:組蛋白去乙?；?；hpf:受精后小時(shí)；WISH檢測(cè)腎臟祖細(xì)胞lhx1a,pax2a,mafba和wt1b的表達(dá)，24hpf；紅色箭頭所指為原位雜交信號(hào)

討 論

本研究首次報(bào)道斑馬魚hdac9在腎臟發(fā)育階段的時(shí)空表達(dá)分布，并證實(shí)hdac9是腎小球正常發(fā)育所必需的基因，hdac9很可能是影響了腎臟祖細(xì)胞的增殖功能，及其向足細(xì)胞的分化功能。

hdac是一類進(jìn)化上高度保守的酶，至今，哺乳動(dòng)物的hdac家族已發(fā)現(xiàn)18個(gè)成員，依據(jù)它們與酵母中同源蛋白結(jié)構(gòu)的保守型及相似性，將其分為四類[14]。hdac活性對(duì)于維持胚胎發(fā)育、基因表達(dá)和分化均至關(guān)重要[15]，包括腎臟發(fā)育[16-17]。

研究表明，在小鼠腎臟發(fā)育過程中，Ⅰ類(hdac1～3)和Ⅱ類(hdac4、 hdac7、hdac9)家族成員隨著腎臟發(fā)育的成熟，表達(dá)逐漸下降。其中hdac1～3在小鼠腎臟發(fā)育過程中表達(dá)最豐富[17]。利用Ⅰ類、Ⅱ類hdac廣譜抑制劑Scriptaid處理胚胎期小鼠腎臟12小時(shí)會(huì)阻止腎臟發(fā)生及輸尿管芽分支的形成，并且抑制腎臟祖細(xì)胞增殖相關(guān)基因如Eya1，WT1，Pax2，HNF1，F(xiàn)oxD1，Wnt9b，Gdnf以及分化相關(guān)基因如Pax8，F(xiàn)gf8，Wnt4，Lhx1等的表達(dá)。在基因敲除小鼠中，hdac1和hdac2存在功能代償；當(dāng)同時(shí)敲除hdac1和hdac2時(shí)，發(fā)現(xiàn)其通過維持β-catenin和p53的活性調(diào)控小鼠腎臟輸尿管芽細(xì)胞增殖、存活以及發(fā)育[18]。然而，hdac9對(duì)腎臟發(fā)育的影響至今不明。

本研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚hdac9在腎臟發(fā)育階段高豐度表達(dá)在腎小球中，利用基因編輯技術(shù)構(gòu)建hdac9基因敲除斑馬魚，進(jìn)一步證實(shí)hdac9缺失導(dǎo)致腎小球?yàn)V過屏障發(fā)育缺陷，足細(xì)胞發(fā)育障礙，裂孔隔膜消失。腎臟組織來源于中間中胚層[19]，在發(fā)育早期，中間中胚層表達(dá)腎臟祖細(xì)胞的標(biāo)記基因如pax2a和lhx1a等。在24hpf階段，斑馬魚hdac9的表達(dá)分布與腎臟祖細(xì)胞分布一致，在hdac9基因敲除斑馬魚中，腎臟祖細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，包括lhx1a,pax2a,wt1b和mafba，均受到了抑制，并且回輸hdac9 mRNA之后，顯著逆轉(zhuǎn)了腎臟祖細(xì)胞和足細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，說明基因敲除hdac9會(huì)抑制腎臟祖細(xì)胞增殖相關(guān)基因wt1b喝mafba，分化相關(guān)基因pax2a和lhx1a的表達(dá)，此結(jié)果與既往結(jié)果吻合[17]。因此，在腎小球發(fā)育過程中，hdac9同時(shí)維持了腎臟祖細(xì)胞的增殖功能和分化功能，是腎臟祖細(xì)胞向足細(xì)胞分化所必需基因。

綜上所述，我們首次發(fā)現(xiàn)hdac9在腎小球發(fā)育過程中扮演著重要的角色，并且利用斑馬魚模型和基因編輯技術(shù)證實(shí)，在腎臟發(fā)育過程中，hdac9是維持腎臟祖細(xì)胞向足細(xì)胞分化所必需的，而其具體的調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步探究。