食管癌及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中血清應(yīng)答因子與α-平滑肌肌動(dòng)蛋白差異表達(dá)的意義

何喜，王志強(qiáng)，林韜

作者單位：唐山市人民醫(yī)院胸外科，河北 唐山063001

食管鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響食管癌預(yù)后的主要因素之一，區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移被認(rèn)為是食管癌病人術(shù)后預(yù)后不良的指標(biāo)之一［1］。課題組前期采用免疫組織化學(xué)染色方法，發(fā)現(xiàn)血清應(yīng)答因子（serum response factor，SRF）在食管癌組織中高表達(dá)，且與浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，與α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）的高表達(dá)呈正相關(guān)；體外研究也顯示基因沉默SRF能夠抑制Eca-109細(xì)胞的增殖和侵襲［2］。SRF轉(zhuǎn)錄因子能夠與α-SMA基因啟動(dòng)子結(jié)合并促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄，被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的一個(gè)重要指標(biāo)之一［3］。因此本研究擬觀察SRF在食管癌組織及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的差異表達(dá)，并觀察其與臨床病理參數(shù)以及α-SMA表達(dá)的相關(guān)性，為研究食管鱗癌發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移機(jī)制提供一定的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料及方法

1.1一般資料收集2017年1月至2018年12月在唐山市人民醫(yī)院行食管癌根治性手術(shù)的病人樣本68例，均伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。其中男性46例，女性22例；年齡≥65歲30例，＜65歲38例；腫瘤直徑≥3 cm 36例，腫瘤直徑＜3 cm 32例。按照食管癌國際TNM分期標(biāo)準(zhǔn)（第8版），鱗癌臨床TNM分期I+II期14例，III期54例；浸潤深度T1+T2 12例，T3+T4 56例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移N1為10例，N2+N3為58例。所有標(biāo)本均經(jīng)蘇木素伊紅染色后病理證實(shí)，臨床資料完整。所有病人術(shù)前均未行放化療治療。病人或近親屬對(duì)研究方案簽署知情同意書。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2方法

1.2.1 HE染色 石蠟切片脫蠟至水，蘇木素10 min，鹽酸酒精分化數(shù)秒，稍洗，伊紅1～2 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色 石蠟切片脫蠟至水，高壓修復(fù)，3%H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶，SRF（sc-335，美國santa cruz公司）、α-SMA（ab124964，英國abcam公司）一抗（1：200）4℃過夜，二抗37℃孵育20 min，DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染，中性樹膠封固。陽性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：SRF主要表達(dá)于細(xì)胞核，α-SMA表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)。參照文獻(xiàn)方法判定、分析免疫組織化學(xué)染色結(jié)果［2］，即染色強(qiáng)度評(píng)分：0（無表達(dá)）、1（弱表達(dá)）、2（中等程度表達(dá)）、強(qiáng)表達(dá)（3）；染色百分比評(píng)分：0（＜10%）、1（10-30%）、2（31-70%）、3（＞70%）。以染色強(qiáng)度評(píng)分與染色百分比評(píng)分乘積作為免疫組織化學(xué)染色評(píng)判結(jié)果，其中≤3分定義為陰性，＞3分定義為陽性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，組間計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SRF、α-SMA在食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中高表達(dá)SRF主要表達(dá)于細(xì)胞核；α-SMA主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，其中在平滑肌組織中的陽性表達(dá)不定義為陽性結(jié)果。在食管鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中的SRF、α-SMA陽性表達(dá)率分別為73.53%和77.94%，顯著高于原位癌組的52.94%和44.12%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1、表1。

表1 SRF、α-SMA在食管癌原位癌組織和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中的差異表達(dá)∕例

2.2 SRF、α-SMA在食管鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中的表達(dá)與臨床病理特征的聯(lián)系SRF、α-SMA在食管鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌標(biāo)本中的表達(dá)與性別、年齡、腫瘤大小無關(guān)（P＞0.05），而與浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移區(qū)域和TNM分期關(guān)系密切（P＜0.05）。SRF與α-SMA在食管鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中共表達(dá)45例，二者具有正相關(guān)性（r＝0.485，P＜0.001）。見表2。

3 討論

SRF作為MADS基因家族的成員之一，可能調(diào)控200多個(gè)相應(yīng)的靶基因，在胚胎發(fā)育、肌肉、消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)的形成，以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起到了重要的調(diào)控作用［4］。在體內(nèi)外沉默SRF，能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，并抑制荷瘤小鼠的生長，與腫瘤的惡性轉(zhuǎn)移關(guān)系密切［3］。其他研究也顯示，SRF在肝癌組織中高表達(dá)，其可結(jié)合微小染色體維持蛋白7啟動(dòng)子并促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄，抑制SRF能夠顯著抑制肝腫瘤干細(xì)胞的形成和相關(guān)基因的表達(dá)［5］。基因敲除SRF能夠下調(diào)早期生長反應(yīng)1蛋白的表達(dá)，從而抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化［6］。在本研究中也發(fā)現(xiàn)，SRF在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中的陽性率顯著高于原位癌組織，并與浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移區(qū)域、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM分期關(guān)系密切，提示SRF可能是調(diào)控食管鱗癌轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子。

表2 SRF、α-SMA在食管鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

SRF能夠與α-SMA基因啟動(dòng)子結(jié)合并促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄，多項(xiàng)研究證實(shí)SRF通過對(duì)E-鈣黏蛋白、β-連環(huán)蛋白、α-SMA等上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化指標(biāo)的調(diào)節(jié)，從而促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，或在纖維化進(jìn)程中起到重要的調(diào)控作用［2，7-9］。課題組較早就將α-SMA作為腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的指標(biāo)進(jìn)行研究，在本研究中也發(fā)現(xiàn)，α-SMA除可以標(biāo)記腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞［10］以外，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中陽性表達(dá)無論是強(qiáng)度還是陽性表達(dá)率，顯著高于原位癌組織。α-SMA在食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中的異常高表達(dá)，提示食管癌細(xì)胞可能經(jīng)歷上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而獲得了遷移和運(yùn)動(dòng)的能力，因而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。然而本研究屬于半定量、描述性研究，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，將采用免疫印跡和PCR技術(shù)定量檢測(cè)SRF及α-SMA蛋白和基因水平的差異表達(dá)，以期可將SRF作為早期預(yù)測(cè)食管鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的標(biāo)記物進(jìn)行深入研究。

圖1 血清應(yīng)答因子、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白在食管鱗癌原位癌及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中的陽性表達(dá)