納洛酮對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞自噬的影響

李小亮，李君，李林，孫林林，陳揚(yáng)，付愛軍

作者單位：1華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，河北 唐山063000；2開灤總醫(yī)院林西醫(yī)院神經(jīng)外科，河北 唐山063000；3鄭州市第七人民醫(yī)院神經(jīng)外科，河南 鄭州450000

自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）是嚴(yán)重威脅人類健康的一種疾病，由于其發(fā)病突然、變化迅猛，給救治帶來很大的挑戰(zhàn)，絕大多數(shù)SAH為動(dòng)脈瘤破裂所致［1］，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)SAH發(fā)病率約為每年10.5∕10萬人口［2］，并且呈逐年上升趨勢(shì)。隨著顯微腦血管外科、高分辨率影像后處理技術(shù)、麻醉理論及血管內(nèi)介入水平的不斷發(fā)展及提高，其病死率較前有所下降，但致殘率一直處于較高水平［3］，治療后大概33%的SAH病人遺留嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺失并需長(zhǎng)期護(hù)理［4］，給病人和家庭帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)以及身心上的雙重創(chuàng)傷［5］。既往的學(xué)者認(rèn)為，導(dǎo)致SAH病人神經(jīng)功能缺失的主要因素為腦血管痙攣（CVS）［6］，但是應(yīng)用藥物拮抗CVS的發(fā)生后，并未顯著改善SAH病人的神經(jīng)功能缺失。近年來文獻(xiàn)報(bào)道，應(yīng)用藥物或其它措施對(duì)SAH早期腦損傷的盡早干預(yù)，可以減輕神經(jīng)功能缺失［7］。目前對(duì)SAH早期腦損傷的機(jī)制研究中，自噬被廣泛關(guān)注，適當(dāng)活化的自噬可以減輕大鼠SAH模型早期腦損傷的損害性發(fā)展，從而保護(hù)神經(jīng)功能［8］。納洛酮注射液是阿片類受體阻滯劑，在臨床上普遍使用，并取得了不錯(cuò)的療效。有研究報(bào)道納洛酮注射液在治療SAH所致的腦損傷方面具有積極的意義［9］，但相關(guān)機(jī)制尚不明確。

本研究于2016年10月至2018年10月采取刺破頸內(nèi)動(dòng)脈的方法制作SAH大鼠模型，觀察納洛酮注射液對(duì)大鼠行為學(xué)功能及自噬相關(guān)蛋白Beclin-1及微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3-Ⅱ）的影響，探討納洛酮注射液對(duì)SAH的可能作用機(jī)制，為臨床治療提供豐富的基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)支持。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 108只健康雄性清潔級(jí)SD大鼠，周齡范圍為9～12周，體質(zhì)量（350±30）g，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2014-0004。飼養(yǎng)于華北理工大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物飼養(yǎng)室，正常通風(fēng)光照，維持室溫于（23±2）℃，濕度控制于（50±15）%，自由活動(dòng)并正常飲水進(jìn)食，避免不良刺激。在實(shí)驗(yàn)開始前1周進(jìn)行環(huán)境適應(yīng)。采用隨機(jī)數(shù)字表法將108只大鼠分為三組，依次為假手術(shù)組、SAH組、納洛酮組，每組36只，并相應(yīng)做好標(biāo)記，每組再依次分為6 h、24 h、72 h三個(gè)亞組，每個(gè)亞組12只。本研究符合一般動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)原則。

1.1.2 藥物和試劑 納洛酮注射液（1 mL∶0.4 mg）；Beclin-1（ABclonal生物技術(shù)有限公司）和LC3-Ⅱ抗體（GeneTex生物技術(shù)有限公司）；內(nèi)參微管蛋白（tubulin）（美國Abcam公司）；二抗及顯色用品（美國KPL公司）。

1.1.3 主要儀器 820-Ⅱ型切片機(jī)（德國Leica公司）；OLYMPUS攝像顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；凝膠成像分析系統(tǒng)；圖像采集及分析系統(tǒng)。

1.2方法

1.2.1 模型建立 根據(jù)文獻(xiàn)采用頸動(dòng)脈刺破法制作SAH大鼠模型［10］：腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛（300 mg∕kg）麻醉大鼠，刺激無反應(yīng)后將其仰臥并固定，頸部術(shù)前無菌處理，縱行剪開，沿組織間隙進(jìn)行分離，暴露并解剖頸總動(dòng)脈及頸內(nèi)外動(dòng)脈，遠(yuǎn)心端扎閉并剪斷頸外動(dòng)脈，牽拉使其與頸內(nèi)動(dòng)脈進(jìn)入顱內(nèi)的方向一致，將銳化并標(biāo)記好的纖芯自遠(yuǎn)心端穿入頸外動(dòng)脈并沿頸內(nèi)動(dòng)脈直至顱內(nèi)，刺破血管，造成SAH模型。然后將傷口消毒后縫合，正常飼養(yǎng)。以取腦時(shí)環(huán)池、基底池有血凝塊為模型制備成功的標(biāo)準(zhǔn)。假手術(shù)組只將纖芯沿血管穿入顱內(nèi)，避免刺穿血管，其它操作步驟與SAH組相同。

1.2.2 給藥方法 納洛酮組刺破顱內(nèi)血管后立即給予腹腔內(nèi)注射納洛酮注射液（1 mg∕kg），每12小時(shí)1次，用藥至處死的各時(shí)相點(diǎn)。假手術(shù)組和SAH組采用同樣方法給予同等體積的0.9%氯化鈉溶液。

1.2.3 穿梭箱實(shí)驗(yàn) 各組實(shí)驗(yàn)大鼠于造模前2 d開始進(jìn)行訓(xùn)練，每天練習(xí)2次，以培養(yǎng)條件反射。術(shù)后于預(yù)設(shè)時(shí)間，首先在穿梭箱內(nèi)讓實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行環(huán)境適應(yīng)5 min，達(dá)到去除條件反射的目的，然后給予5 s聲光刺激，再給予20 s電刺激（電擊強(qiáng)度30 V，50 Hz）。觀察大鼠的逃避情況，每間隔20 s訓(xùn)練1次，共計(jì)30次。視頻分析實(shí)驗(yàn)大鼠的逃避情況。統(tǒng)計(jì)逃避次數(shù)及逃避反應(yīng)時(shí)間（大鼠受到刺激至逃到安全區(qū)的平均次數(shù)與時(shí)間）。

1.2.4 蘇木精-伊紅（HE）染色于造模成功后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，采取腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛（300 mg∕kg）將大鼠深度麻醉，待其無反應(yīng)后進(jìn)行左心室穿刺灌注，先灌注0.9%氯化鈉溶液500 mL、再灌注4%多聚甲醛250 mL，在冰上解剖取出腦組織，并置于4%多聚甲醛中固定3 d。對(duì)固定好的腦組織進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，層厚5μm做連續(xù)冠狀位切片（包含海馬組織），每只大鼠腦標(biāo)本蠟塊取3張進(jìn)行HE染色。光學(xué)顯微鏡（×400）觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)及結(jié)構(gòu)，按隨機(jī)數(shù)字表法保存6個(gè)不同視野的照片，并用Motic-6.0分析系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)結(jié)構(gòu)無異常的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量。

1.2.5 免疫組織化學(xué)染色 每只大鼠腦標(biāo)本蠟塊取6張切片，進(jìn)行常規(guī)脫蠟、水化、高壓修復(fù)、室溫孵育。按隨機(jī)數(shù)字表法等分成2組，一組滴加Beclin-1抗體（1∶100），另一組滴加LC3-Ⅱ抗體（1∶100），將滴加抗體的切片放入4℃冰箱過夜（超過12 h），滴加組化二抗，孵育、脫水、透明、顯色、封固。光學(xué)顯微鏡（×400）觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞，按隨機(jī)數(shù)字表法保存6個(gè)不同視野的照片，并用Motic-6.0分析系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞數(shù)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用Excel 2007收集計(jì)量資料，所得數(shù)據(jù)以xˉ±s表示，使用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行多組間的兩兩比較。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1穿梭箱實(shí)驗(yàn)與假手術(shù)組對(duì)比，SAH組6 h、24 h、72 h大鼠躲到安全區(qū)的次數(shù)均減少，躲到安全區(qū)的時(shí)間均延長(zhǎng)（P＜0.05）；與SAH組對(duì)比，納洛酮組6 h、24 h、72 h躲到安全區(qū)的次數(shù)均增多，躲到安全區(qū)的時(shí)間均縮短（P＜0.05）。見表1，2。

表1各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)逃避反應(yīng)次數(shù)比較∕（次±s）

表1各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)逃避反應(yīng)次數(shù)比較∕（次±s）

注：與假手術(shù)組比較，a P＜0.05；與SAH組比較，b P＜0.05，SAH為蛛網(wǎng)膜下腔出血

組別假手術(shù)組SAH組納洛酮組F值P值鼠數(shù)36 36 36 6 h 24.83±3.24 14.41±1.98a 16.50±1.93b 60.282 0.000 24 h 25.33±2.64 16.25±2.18a 19.25±2.30b 45.317 0.000 72 h 25.16±2.82 18.33±2.57a 22.50±2.20b 22.017 0.000

表2各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)逃避反應(yīng)時(shí)間比較

表2各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)逃避反應(yīng)時(shí)間比較

注：與假手術(shù)組比較，a P＜0.05；與SAH組比較，b P＜0.05，SAH為蛛網(wǎng)膜下腔出血

組別假手術(shù)組SAH組納洛酮組F值P值鼠數(shù)36 36 36 6 h 3.54±0.99 9.09±1.38a 8.05±1.24b 70.948 0.000 24 h 3.55±0.84 8.73±1.13a 6.56±1.09b 76.479 0.000 72 h 3.54±0.83 8.00±1.04a 5.36±0.97b 66.653 0.000

2.2 HE染色假手術(shù)組6 h、24 h、72 h海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞絕大部分形態(tài)正常，細(xì)胞質(zhì)均一，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)完整，染色適中。SAH組海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞情況：6 h亞組鏡下顯示少量細(xì)胞的細(xì)胞核染色加深、梭形固縮；24 h亞組細(xì)胞核深染、梭形固縮情況明顯增多，并出現(xiàn)核破碎；72 h亞組細(xì)胞核深染、梭形固縮、核破碎情況進(jìn)一步加劇。納洛酮組對(duì)比SAH組，6 h、24 h、72 h細(xì)胞核深染、梭形固縮、核破碎等情況均相對(duì)減少。見表3。

2.3免疫組織化學(xué)染色選取自噬的特異性標(biāo)志物Beclin-1和LC3-Ⅱ，經(jīng)染色及顯色后，胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃、黃褐色顆粒樣物質(zhì)既表明該細(xì)胞發(fā)生了自噬。假手術(shù)組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)可見少數(shù)細(xì)胞陽性表達(dá)。SAH組：6 h亞組胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃、黃褐色顆粒樣物質(zhì)的細(xì)胞數(shù)較假手術(shù)組增多；24 h亞組細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃、黃褐色顆粒樣物質(zhì)的細(xì)胞數(shù)明顯增多；72 h亞組細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃、黃褐色顆粒樣物質(zhì)的細(xì)胞數(shù)仍很多。納洛酮組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃、黃褐色顆粒樣物質(zhì)的細(xì)胞數(shù)均比SAH組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)增多。見表4，5。

表3 各組各時(shí)間點(diǎn)大鼠海馬區(qū)結(jié)構(gòu)無異常的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量∕個(gè)，（±s）

表3 各組各時(shí)間點(diǎn)大鼠海馬區(qū)結(jié)構(gòu)無異常的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量∕個(gè)，（±s）

注：與假手術(shù)組比較，a P＜0.05；與SAH組比較，b P＜0.05，SAH為蛛網(wǎng)膜下腔出血

組別假手術(shù)組SAH組納洛酮組F值P值鼠數(shù)36 36 36 6 h 122.67±5.55 84.25±12.63a 94.75±11.06b 45.394 0.000 24 h 122.25±5.50 75.58±11.11a 84.50±9.21b 92.685 0.000 72 h 121.58±5.68 67.75±10.55a 77.33±9.88b 126.258 0.000

表4 各組各時(shí)間點(diǎn)大鼠海馬區(qū)Beclin-1蛋白陽性細(xì)胞數(shù)量∕（個(gè)，ˉ±s）

表4 各組各時(shí)間點(diǎn)大鼠海馬區(qū)Beclin-1蛋白陽性細(xì)胞數(shù)量∕（個(gè)，ˉ±s）

注：與假手術(shù)組比較，a P＜0.05；與SAH組比較，b P＜0.05，SAH為蛛網(wǎng)膜下腔出血

組別假手術(shù)組SAH組納洛酮組F值P值鼠數(shù)36 36 36 6 h 20.50±3.45 31.41±4.96a 36.17±4.06b 43.788 0.000 24 h 20.33±2.77 47.67±7.35a 57.58±6.68b 125.938 0.000 72 h 20.50±3.59 43.17±6.46a 52.75±7.35b 92.324 0.000

表5 各組各時(shí)間點(diǎn)大鼠海馬區(qū)LC3-II蛋白陽性細(xì)胞數(shù)量∕（個(gè)ˉ±s）

表5 各組各時(shí)間點(diǎn)大鼠海馬區(qū)LC3-II蛋白陽性細(xì)胞數(shù)量∕（個(gè)ˉ±s）

注：與假手術(shù)組比較，a P＜0.05；與SAH組比較，b P＜0.05，SAH為蛛網(wǎng)膜下腔出血

組別假手術(shù)組SAH組納洛酮組F值P值鼠數(shù)36 36 36 6 h 17.08±3.00 27.42±3.40a 30.92±4.19b 48.921 0.000 24 h 17.50±2.31 39.83±4.67a 48.33±5.66b 154.197 0.000 72 h 17.41±2.57 31.50±4.06a 38.58±5.40b 79.974 0.000

3 討論

納洛酮注射液作為經(jīng)典的阿片類受體阻滯劑，具有很高的脂溶性，能夠很好地透過血腦屏障進(jìn)而作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。納洛酮注射液最早在臨床上應(yīng)用是能夠?qū)拱⑵愃幬飶?fù)合麻醉恢復(fù)期或阿片類藥物過量所致的呼吸功能減弱［11］。隨著對(duì)病理生理學(xué)認(rèn)識(shí)的不斷深入，學(xué)者們檢測(cè)到急性顱腦損傷病人和腦損傷模型動(dòng)物的腦組織內(nèi)內(nèi)源性阿片肽（β-內(nèi)啡肽和強(qiáng)啡肽等）的數(shù)值均顯著上升，內(nèi)源性阿片肽的毒性作用會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損害的進(jìn)一步加重［12］。納洛酮注射液可阻斷內(nèi)源性阿片肽的毒性作用進(jìn)而可以減輕腦水腫、降低顱內(nèi)壓、改善腦代謝，并可以逆轉(zhuǎn)呼吸抑制［13］。臨床試驗(yàn)亦表明納洛酮注射液對(duì)SHA病人［8］、高血壓腦出血病人［14］、重度顱腦損傷病人［15］、急性腦梗死病人［16］均具有腦保護(hù)作用。研究顯示，SAH模型大鼠的行為能力及其海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞會(huì)受到損害，其可能的原因被認(rèn)為是SAH后腦組織及蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)源性阿片肽含量增多，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷［13］。

自噬是真核細(xì)胞的程序性死亡方式之一，也是細(xì)胞面對(duì)損傷性刺激的自我保護(hù)機(jī)制［17］。通過溶酶體蛋白降解途徑能夠有效地清除受損的細(xì)胞器和細(xì)胞內(nèi)的毒性物質(zhì)，并能夠?yàn)榈鞍踪|(zhì)的合成和細(xì)胞器的更新提供相應(yīng)的原料，通過上述反應(yīng)的發(fā)生可以很好地保持細(xì)胞的功能及結(jié)構(gòu)，進(jìn)而達(dá)到對(duì)抗損傷性刺激的目的［18］。在一定程度內(nèi)發(fā)生的自噬可以有效地穩(wěn)定細(xì)胞功能并能夠降低致死率；自噬程度不足則會(huì)損傷細(xì)胞功能與結(jié)構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致?lián)p傷性結(jié)果的發(fā)生［19］。既往學(xué)者實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給予SAH動(dòng)物模型藥物處理能夠在一定程度上增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞自噬，經(jīng)檢測(cè)胞內(nèi)出現(xiàn)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1及LC3-Ⅱ的細(xì)胞數(shù)量升高，神經(jīng)細(xì)胞死亡明顯減少［20］；應(yīng)用藥物降低自噬程度后，在一定程度上增加了細(xì)胞致死率［21］。

現(xiàn)階段對(duì)于納洛酮注射液對(duì)SAH神經(jīng)保護(hù)作用的文獻(xiàn)報(bào)道主要在臨床，基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)很少，在自噬方面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果鮮有報(bào)道。該實(shí)驗(yàn)經(jīng)過精心設(shè)計(jì)，參考文獻(xiàn)采取顱內(nèi)動(dòng)脈刺破法制作SAH大鼠模型，并給予SAH大鼠藥物干預(yù)，結(jié)果顯示SAH后大鼠行為學(xué)功能減退，胞內(nèi)出現(xiàn)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1及LC3-Ⅱ的細(xì)胞數(shù)量升高，給予納洛酮注射液處理后行為學(xué)功能得到改善，胞內(nèi)出現(xiàn)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1及LC3-Ⅱ的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步升高，這與以往相關(guān)文獻(xiàn)［22］報(bào)道一致。

通過以上實(shí)驗(yàn)，我們得到結(jié)論，納洛酮注射液能夠恢復(fù)SAH大鼠的行為學(xué)功能，其機(jī)制可能是在一定程度上增強(qiáng)了SAH大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞自噬，穩(wěn)定了細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能。納洛酮注射液對(duì)SAH的神經(jīng)保護(hù)功效，涉及相當(dāng)復(fù)雜的分子機(jī)制，尚需學(xué)者不斷努力、深入探討。