HPLC-ELSD 法測定胃康顆粒中人參皂苷Rb1 和黃芪甲苷的含量

劉 璐，于雙雨，劉艷華,b （寧夏醫(yī)科大學(xué)：. 藥學(xué)院, b. 回醫(yī)藥現(xiàn)代化省部共建教育部重點實驗室，銀川 750004）

胃康顆粒由黃芪、三七等九味中藥經(jīng)微粉化制 粒而成，具有通降氣機、和胃健運的功效[1]，在臨床上主要用于治療慢性胃炎、潰瘍性結(jié)腸炎、術(shù)后殘胃炎、胃癌合并上消化道出血等疾病[2-3]。方中黃芪可以補氣健脾、固表、利尿脫毒[4]，三七可以散瘀止血，消腫定痛[5]。黃芪中所含的黃芪甲苷以及三七中所含的人參皂苷Rb1是胃康顆粒的主要活性成分，也是其含量測定的重要檢測指標?！吨袊幍洹?015 版中采用HPLC-ELSD 法測定黃芪中黃芪甲苷的含量，用高效液相色譜-紫外檢測（HPLCUV）法測定三七中人參皂苷Rb1的含量，無法按藥典方法同時測定人參皂苷Rb1和黃芪甲苷。有關(guān)文獻[6-9]采用HPLC-ELSD 法同時測定制劑中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd 的含量，該方法簡便、準確、分離好，靈敏度高，重復(fù)性好，無干擾，對建立三七藥材及其制劑的質(zhì)量控制方法有參考價值。陳驍勇[10]、王銀[11]等采用HPLC-ELSD分別測定參芪五味子片、益肺清化顆粒中的有效成分的含量，該方法可以同時測定皂苷類成分和黃芪甲苷的含量，簡便快捷、結(jié)果準確、重復(fù)性好。因此，本研究參考相關(guān)文獻，優(yōu)化胃康顆粒中人參皂苷Rb1和黃芪甲苷的提取方法，并建立同時測定人參皂苷Rb1和黃芪甲苷含量的方法，作為控制胃康顆粒質(zhì)量的方法之一。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

98-1-B 型電子調(diào)溫電熱套(天津泰斯特儀器有限公司）；RE-2000A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器 廠）；Agilent 1 220 高 效 液 相 色 譜 儀、Agilent G4260B 型蒸發(fā)光散射檢測器、Splaris 230 Vac 型空氣發(fā)生器（均為安捷倫科技有限公司產(chǎn)品）；BSA223S-CW 型電子分析天平（德國賽多利斯）。

1.2 材料

胃康顆粒（寧夏醫(yī)科大學(xué)自制）；黃芪甲苷對照品（批號：110 781-201 616，純度為96.9%）、人參皂苷Rb1對 照 品（批 號：110 704-201 827，純 度 為91.2%）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純；水為娃哈哈水；其他為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色 譜 柱： XBridge?Shield RP18（ 4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（32：68，V/V）；流速：1.0 ml/min；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μl；蒸發(fā)光檢測器，漂移管溫度為60 ℃，霧化室溫度為33 ℃，載氣流量為1.7 SLM。

2.2 黃芪甲苷和人參皂苷Rb1 的提取工藝考察

綜合相關(guān)文獻及2015 版《中國藥典》關(guān)于測定芪參膠囊中三七皂苷R1和黃芪甲苷含量的方法，初步擬定胃康顆粒的提取方法：取裝量差異項下的本品內(nèi)容物，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇，密塞，稱定重量，超聲處理，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液，回收溶劑至干，殘渣加水使溶解，加水飽和的正丁醇振搖提取，合并正丁醇提取液，用濃氨試液洗滌，棄去洗滌液，正丁醇提取液回收溶劑至干，殘渣加甲醇使溶解并轉(zhuǎn)移至量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。本研究篩選并優(yōu)化該提取工藝中的提取方式、提取溶劑、提取料液比、提取時間、正丁醇提取次數(shù)和氨水洗滌次數(shù)。

2.2.1 提取方式的篩選

實驗時曾采用相關(guān)文獻[9]中供試品處理的方法，發(fā)現(xiàn)供試品溶液的HPLC 圖譜在黃芪甲苷處峰形較小，故本研究在保證人參皂苷Rb1含量的前提下，采用相關(guān)文獻中甲醇超聲提取和回流提取兩種方式，結(jié)果如表1 所示，可知回流提取人參皂苷Rb1和黃芪甲苷的含量較高，故綜合考慮認為選擇回流提取較為適宜。

表1 不同提取方式對人參皂苷Rb1 和黃芪甲苷含量的影響

2.2.2 提取溶劑的篩選

皂苷類成分常采用水、甲醇、乙醇作為提取溶劑，因此分別用上述3 種提取溶劑，對供試品進行提取并測定含量，結(jié)果如表2 所示，水的提取效果較差，而以甲醇提取時，人參皂苷Rb1和黃芪甲苷的含量最高，故選擇甲醇為提取溶劑。

表2 不同提取溶劑對人參皂苷Rb1 和黃芪甲苷含量的影響

2.2.3 提取料液比的篩選

參照相關(guān)文獻分別選取1∶3、1∶6、1∶10、1∶20、1∶50 的5 種料液比進行提取，并測定提取液中人參皂苷Rb1和黃芪甲苷的含量，考察結(jié)果如表3 所示，人參皂苷Rb1和黃芪甲苷的含量在料液比1∶6 時達到峰值，且從節(jié)省溶劑的角度考慮，選擇料液比1∶6 提取較為適宜。

2.2.4 提取時間的篩選

分別采用0.5、1、1.5、2 h 的4 種提取時間，對供試品進行提取并測定人參皂苷Rb1和黃芪甲苷的含量，結(jié)果如表4 所示，隨著提取時間的延長，人參皂苷Rb1和黃芪甲苷的含量也隨之逐漸上升，不過1.5 h 后，人參皂苷Rb1和黃芪甲苷的含量不增反降，考慮可能是因為浸提液受熱時間長，破壞了藥材成分，從而導(dǎo)致人參皂苷Rb1和黃芪甲苷的含量不增反降，故提取時間選擇1.5 h 較為適宜。

表3 不同提取料液比對人參皂苷Rb1 和黃芪甲苷含量的影響

表4 不同提取時間對人參皂苷Rb1 和黃芪甲苷含量的影響

2.2.5 正丁醇提取次數(shù)的篩選

分別采用正丁醇提取3、4、5、6 次，并對提取液測定人參皂苷Rb1和黃芪甲苷的含量，結(jié)果如表5 所示，正丁醇提取5 次時，人參皂苷Rb1和黃芪甲苷的含量較高，但是繼續(xù)增加正丁醇提取次數(shù)，人參皂苷Rb1和黃芪甲苷的含量的增幅不大。綜合考慮后續(xù)試驗及成本等因素，選擇正丁醇提取5 次較為適宜。

表5 正丁醇提取次數(shù)對人參皂苷Rb1 和黃芪甲苷含量的影響

2.2.6 氨水洗滌次數(shù)的篩選

分別采用氨水洗滌1、2、3 次，對供試品進行提取并測定人參皂苷Rb1和黃芪甲苷的含量，結(jié)果如表6 所示，氨水洗滌2 次時，人參皂苷Rb1和黃芪甲苷的含量最高，故選擇氨水洗滌2 次較為適宜。

表6 氨水洗滌次數(shù)對人參皂苷Rb1 和黃芪甲苷含量的影響

2.3 人參皂苷Rb1 和黃芪甲苷的含量測定

2.3.1 對照品溶液的制備

精密稱定黃芪甲苷5 mg 和人參皂苷Rb14 mg，置10 ml 量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備

取本品5 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入甲醇30 ml，稱定重量，回流提取1.5 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液20 ml，蒸干，殘渣加水20 ml 使溶解，加水飽和的正丁醇提取5 次，每次20 ml，合并正丁醇提取液，用濃氨試液洗滌2 次，每次30 ml，棄去洗滌液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5 ml 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 陰性對照溶液的制備

分別按處方比例取除黃芪和三七的其余中藥飲片，照胃康顆粒的制法制成黃芪陰性樣品和三七陰性樣品，取黃芪陰性樣品4.09 g 和三七陰性樣品4.55 g，照供試品溶液的制備方法分別制成缺黃芪和缺三七的陰性對照溶液。

2.3.4 系統(tǒng)適用性實驗

取對照品、供試品和陰性對照品溶液各20 μl，注入液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件測定，人參皂苷Rb1的保留時間約為8 min，黃芪甲苷的保留時間約為12 min，峰形對稱尖銳，基線平穩(wěn)，與其他色譜峰分離良好，陰性樣品無干擾，詳見圖1。

2.3.5 線性關(guān)系考察

精密吸取混合對照品溶液1、3、9、12、15、18、21、24 μl，注入液相色譜儀，測定峰面積積分值。分別以人參皂苷Rb1和黃芪甲苷對照品進樣量的對數(shù)值為橫坐標（X1和X2），峰面積積分值的對數(shù)值為縱坐標（Y1和Y2），繪制標準曲線，計算回歸方程。得人參皂苷Rb1和黃芪甲苷的回歸方程分別為：

結(jié)果表明，人參皂苷Rb1在1.70～40.80 μg/ml的濃度范圍內(nèi)、黃芪甲苷在5.03～120.72 μg/ml 的濃度范圍內(nèi)，與各自峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.3.6 精密度試驗

取同一供試品溶液，精密吸取20 μl，按上述色譜條件，重復(fù)進樣6 次，記錄色譜峰面積，計算人參皂苷Rb1和黃芪甲苷色譜峰面積積分對數(shù)值的RSD 值分別為0.21%、0.39%，表明該方法日內(nèi)精密度良好。

取同一供試品溶液，精密吸取20 μl，按上述色譜條件，重復(fù)進樣2 次，連續(xù)3 d，記錄色譜峰面積，計算人參皂苷Rb1和黃芪甲苷色譜峰的峰面積積分對數(shù)值的RSD 值分別為0.22%和0.36%，表明該方法日間精密度良好。

2.3.7 重復(fù)性試驗

取本品同一供試品（批號20 200 112）約5.0 g，共6 份，精密稱定，照供試品溶液的制備方法制成供試液。按“2.1”項下色譜條件，測定峰面積并計算含量，人參皂苷Rb1和黃芪甲苷的平均含量分別為2.860 9 和0.253 0 mg/g，RSD 分 別 為1.97%和2.89%，表明此法重復(fù)性良好。

2.3.8 回收率試驗

取已知含量的同一批胃康顆粒約5.0 g，共6 份，精密稱定，分別精密加入一定量的人參皂苷Rb1對照品和黃芪甲苷對照品，按供試品溶液制備方法制備，按“2.1”項下色譜條件測定含量，計算人參皂苷Rb1和黃芪甲苷的加樣回收率分別為95.65%和 100.57%，RSD 分別為1.06%和0.62%。

2.3.9 樣品含量測定

取3 批樣品，按建立的方法測定人參皂苷Rb1和黃芪甲苷的含量。分別精密吸取對照品溶液10、20 μl，供試品溶液20 μl，注入液相色譜儀測定，以外標兩點法對數(shù)方程計算，即得。結(jié)果如表7所示，胃康顆粒中人參皂苷Rb1和黃芪甲苷的平均含 量 分 別 為2.863 0 和0.257 6 mg/g，RSD 分 別 為0.62%和1.51%。

表7 3 批胃康顆粒的含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 提取方法

皂苷類成分的提取方法有很多，如有機溶劑提取法、超聲波提取法等，在生產(chǎn)中由于不同的提取方法，其有效成分的含量也會出現(xiàn)差別，本實驗在胃康顆粒的人參皂苷Rb1和黃芪甲苷提取方法篩選和優(yōu)化過程中，發(fā)現(xiàn)超聲提取所得供試品溶液的HPLC 圖譜在黃芪甲苷處峰形較小，而回流提取既可以保證人參皂苷Rb1的含量，又可以改善黃芪甲苷的峰形與含量，且提取效率高、生產(chǎn)成本低。皂苷類成分常采用水、乙醇、甲醇作為提取溶劑，當胃康顆粒以甲醇提取時，人參皂苷Rb1和黃芪甲苷的含量最高，故選擇甲醇提取。我們嘗試直接測定經(jīng)甲醇提取后的胃康顆粒，發(fā)現(xiàn)色譜圖中干擾物質(zhì)多，故考慮采用正丁醇萃取黃芪甲苷和人參皂苷Rb1，再以氨水洗滌溶解提取濃縮的殘渣，且由于黃芪甲苷在堿性環(huán)境下存在轉(zhuǎn)化的過程，結(jié)合實驗結(jié)果和藥典方法，最終經(jīng)甲醇提取胃康顆粒后，再選擇正丁醇為萃取溶劑、氨試液為洗滌劑，從而除去干擾雜質(zhì)，并且對氨水洗滌次數(shù)以及正丁醇萃取次數(shù)進行了考察，最終確定了最佳提取方法。本研究建立的提取方法的最大改進之處在于采用甲醇回流同時提取胃康顆粒中人參皂苷Rb1和黃芪甲苷兩種成分，采用該提取方法制備的供試品溶液色譜的雜質(zhì)峰少，且可提高人參皂苷Rb1和黃芪甲苷的提取含量。

3.2 含量測定

三七中所含的皂苷類成分的紫外吸收均為末端吸收，常使用203 nm 波長檢測，易受噪音和梯度洗脫的影響，靈敏度低，基線噪音大；黃芪中黃芪甲苷的含量多采用ELSD 測定。ELSD 僅對不揮發(fā)成分產(chǎn)生信號，其信號響應(yīng)值僅取決于被分析物質(zhì)顆粒的大小和數(shù)量，不存在紫外末端吸收的問題，且通過調(diào)節(jié)漂移管溫度、氣體流速等參數(shù)可以使基線平穩(wěn)。因此，本研究擬建立同時測定人參皂苷Rb1和黃芪甲苷的含量的HPLC-ELSD 法。本實驗考察了各個參數(shù)對含量測定結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)流速為1.0 ml/min、漂移管溫度為60 ℃、霧化室溫度為33 ℃，載氣壓力為1.7 SLM 時，儀器的靈敏度高，基線噪聲小、信號穩(wěn)定。ELSD 的流動相不能使用非揮發(fā)性的試劑，可以使用的流動相僅有乙腈-水、甲醇-水。本實驗考察了兩種流動相對含量測定結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)采用甲醇-水作為流動相或乙腈-水梯度洗脫，結(jié)果分離效果不好，改用乙腈-水（32∶68，V/V）作為流動相，人參皂苷Rb1和黃芪甲苷的出峰時間適宜，峰形對稱，且相鄰雜質(zhì)峰無干擾。本實驗建立的HPLC-ELSD 法最大的改進之處在于同時測定人參皂苷Rb1和黃芪甲苷的含量，且操作簡單，靈敏度、穩(wěn)定性及重現(xiàn)性很高，是一種值得推廣應(yīng)用的檢測制劑中人參皂苷Rb1和黃芪甲苷成分的方法。

4 結(jié)論

本研究建立了胃康顆粒中人參皂苷Rb1和黃芪甲苷兩種指標性成分的提取方法，該方法采用回流提取同時提取了人參皂苷Rb1和黃芪甲苷兩種成分，采用正丁醇萃取和氨水洗滌除去干擾雜質(zhì)，可大幅縮短提取時間，提高效率，降低能量損耗，節(jié)約成本，有效提高了人參皂苷Rb1和黃芪甲苷的提取含量，在大規(guī)模生產(chǎn)中也具有可行性。

本研究建立了同時測定胃康顆粒中人參皂苷Rb1和黃芪甲苷含量的HPLC-ELSD 法，該方法采用乙腈-水（32∶68，V/V）作為流動相等度洗脫，選擇ELSD 作為檢測器并優(yōu)化了相關(guān)檢測參數(shù)。該方法操作簡便、精密度高、穩(wěn)定性好，可作為胃康顆粒指標性成分含量測定和質(zhì)量控制的方法，為胃康顆粒質(zhì)量標準的建立提供依據(jù)。